Method Article

Preparazione del campione utilizzando un metodo monostrato lipidico per studi cristallografici elettronici

DOI:

10.3791/63015

⸱

November 20th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1School of Molecular Sciences, Arizona State University, 2Center for Applied Structural Discovery, Biodesign Institute, Arizona State University, 3Eyring Materials Center, Arizona State University, 4Department of Microbiology and Immunology, The Pennsylvania State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I monostrati lipidici sono stati utilizzati come base per la formazione di cristalli proteici bidimensionali (2D) per studi strutturali per decenni. Sono stabili all'interfaccia aria-acqua e possono fungere da materiale di supporto sottile per l'imaging elettronico. Qui presentiamo i passaggi comprovati sulla preparazione di monostrati lipidici per studi biologici.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La cristallografia elettronica è un potente strumento per la determinazione della struttura ad alta risoluzione. Le macromolecole come le proteine solubili o di membrana possono essere coltivate in cristalli bidimensionali (2D) altamente ordinati in condizioni favorevoli. La qualità dei cristalli 2D cresciuti è fondamentale per la risoluzione della ricostruzione finale tramite l'elaborazione di immagini 2D. Nel corso degli anni, i monostrati lipidici sono stati utilizzati come strato di supporto per favorire la cristallizzazione 2D delle proteine di membrana periferica e delle proteine solubili. Questo metodo può essere applicato anche alla cristallizzazione 2D di proteine di membrana integrali, ma richiede un'indagine empirica più ampia per determinare le condizioni di detergente e dialisi per promuovere la suddivisione nel monostrato. Un monostrato lipidico si forma all'interfaccia aria-acqua in modo tale che i gruppi di testa lipidica polare rimangano idratati nella fase acquosa e le catene acilice non polari, le code si dividano nell'aria, rompendo la tensione superficiale e appiattindo la superficie dell'acqua. La natura carica o le parti chimiche distintive dei gruppi di testa forniscono affinità per le proteine in soluzione, promuovendo il legame per la formazione di array 2D. Un monostrato di nuova formazione con l'array 2D può essere facilmente trasferito in un microscopio elettronico (EM) su una griglia di rame rivestita di carbonio utilizzata per sollevare e supportare l'array cristallino. In questo lavoro, descriviamo una metodologia monostrato lipidico per l'imaging criogenico al microscopio elettronico (crio-EM).

Introduction

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La diffrazione elettronica attraverso cristalli 2D o matrici elicoidali di proteine può raggiungere risoluzioni sub-nanometriche in casi favorevoli1,2,3. Di particolare interesse sono gli array di proteine di membrana 2D ricostituite o i cristalli nei loro ambienti quasi nativi1. Poiché un cristallo agisce come un amplificatore di segnale migliorando l'intensità dei fattori strutturali a specifiche frequenze spaziali, la cristallografia elettronica consente di sondare un bersaglio con dimensioni più piccole ad alte risoluzioni, come piccole molecole, rispetto a quelle per la crio-EM a singola particella. Il fascio di elettroni può essere diffratto da una matrice 2D ordinata di proteine, generando un modello di diffrazione o un'immagine reticolare a seconda di dove viene registrato il piano dell'immagine sul rivelatore4. Le intensità diffratte possono quindi essere estratte ed elaborate per ricostruire una struttura di proiezione 2D del cristallo. Gli elettroni hanno una sezione trasversale di scattering più grande dei raggi X e la sua diffusione segue principalmente il modello di Rutherford basato sull'interazione di Coulomb tra gli elettroni e gli atomi carichi nella molecola5. Gli spessori dei cristalli a membrana 2D sono solitamente inferiori a 100 nm, adatti per la trasmissione di elettroni senza dispersione dinamica che si verifica all'interno del campione6. Gli studi cristallografici elettronici hanno dimostrato di essere un potente strumento per sondare informazioni strutturali ad alta risoluzione delle proteine di membrana e delle interazioni lipidico-proteina7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17.

Un monostrato lipidico è un singolo strato lipidico composto da fosfolipidi densamente impacchettati in un'interfaccia aria-acqua6, che può aiutare la formazione di array 2D per proteine solubili o proteine di membrana periferica18. A seconda della densità dei lipidi e della loro pressione laterale, le molecole lipidiche possono formare un array 2D ordinato sull'interfaccia aria-acqua con le loro catene acilice estese all'aria e gruppi di testa idrofili esposti nella soluzione acquosa1,6,19. Il gruppo lipidico può interagire con le proteine tramite interazione elettrostatica o può essere modificato per fornire un tag di affinità per legare un dominio proteico specifico. Ad esempio, il DOGS-NTA-Ni (acido 1,2-dioleoil- sn-glicero-3-[(N-(5-ammino-1-carbossipentil)acido iminodiacetico)succinil]2- Ni2+) viene spesso utilizzato nella formazione di un monostrato lipidico per legare le proteine con un tag poli-istidina20,21,22. Inoltre, la tossina B del colera può legare un particolare pentasaccaride del ganglioside GM1 in un monostrato lipidico per studi strutturali23,24. Ancorando le proteine sui gruppi di testa lipidica, il monostrato lipidico può aiutare la formazione degli array 2D che sono sottili per studi cristallografici elettronici ad alta risoluzione. La tecnica lipidica monostrato è stata utilizzata in cristallografia elettronica per studi strutturali di proteine, quali streptavitina2,25,annessina V26,tossina colera27, E. coli girasi B subunità28, E. coli RNA polimerasi25,29,30,carbossisoma shell proteins31 e le proteine capside del virus HIV-132 e Moloney murine leucemia virus 33. A causa della stabilità e delle proprietà chimiche del monostrato lipidico, sono state esplorate diverse applicazioni per la preparazione del campione per l'imaging crio-EM34. Tuttavia, sarà necessaria l'ottimizzazione per la formazione di array proteici.

Qui, forniamo ampi dettagli sulla preparazione generale dei monostrati lipidici per l'imaging crio-EM e alcune considerazioni che potrebbero influenzare la qualità dei monostrati formati.

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Protocol

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1. Preparazione del blocco di teflon

  1. Preparare il blocco di Teflon da resina PTFE (politetrafluoroetilene) resistente agli agenti chimici. Praticate dei fori sul blocco utilizzando un trapano generale seguito dalle quote etichettate nella Figura 1.

2. Preparazione lipidica monostrato

NOTA: Tempo di funzionamento stimato: 30-45 minuti

  1. Preparazione del brodo lipidico
    1. Preparare una miscela lipidica da 0,01 mg/mL in cloroformio/metanolo 9:1 (v/v) utilizzando 8,91 mL di cloroformio, 0,99 mL di metanolo e 0,01 ml di lipidi 10 mg/mL.
  2. Preparazione piastra in teflon
    1. Sonicare una piastra di teflon in un bagno di metanolo per 5 minuti.
    2. Lavare con acqua calda per 15 minuti.
    3. Risciacquare con acqua distillata.
    4. Asciugare la piastra di Teflon in un essiccatore per 30 minuti e tenerla sotto vuoto quando non in uso (Figura 1).

3. Formazione di monostrato lipidico sul serbatoio tampone

NOTA: Tempo di funzionamento stimato: 1,5 ore

  1. Preparare appena una miscela lipidica di 0,01 mg/ml in una miscela 9:1 di cloroformio/metanolo il giorno dell'esperimento.
  2. Posizionare una carta da filtro di tipo 1 in una capsula di Petri e disporre il blocco di teflon sopra la carta da filtro.
  3. Riempire i pozzi della piastra di Teflon con 60 μL del tampone.
  4. Aggiungere con attenzione la miscela lipidica sulla superficie del tampone goccia a goccia (idealmente 1 μL per goccia) usando una siringa Hamilton.
  5. Bagnare la carta da filtro con acqua distillata per mantenere l'umidità nella capsula di Petri.
  6. Incubare a temperatura ambiente per 60 minuti. Il cloroformio dovrebbe evaporare e dovrebbe essere formato un monostrato di lipidi sulla superficie del tampone.

4. Applicazione di una griglia EM su un monostrato lipidico

NOTA: Tempo di funzionamento stimato: 1,5 ore

  1. Posizionare delicatamente una griglia EM rivestita in carbonio senza scarica di bagliore, lato carbonio verso il basso, sulla parte superiore di ciascun serbatoio tampone.
  2. Iniettare con cura le proteine nell'iniezione laterale bene. Utilizzare le concentrazioni proteiche finali nel pozzo intorno a 1 μM di proteine come punto di partenza. Pre-ottimizzare la concentrazione proteica prima dell'esperimento.
  3. Incubare per 60 minuti a temperatura ambiente.
  4. Iniettare delicatamente circa 20-30 μL di tampone nella porta di iniezione laterale. Questo solleverà la griglia sopra la superficie del blocco di Teflon.
  5. Raccogliere immediatamente la griglia con una pinzetta e sollevarla verticalmente dalla goccia.
  6. Preparare campioni monostrato per la colorazione negativa o l'imaging crio-TEM (Figura 2). Se le proteine formano un array 2D, lo spettro di potenza dell'immagine o il parodontogramma di Fourier mostrerà intensità di diffrazione alle frequenze spaziali in base alla simmetria cristallina. Se non vengono mostrati punti di diffrazione nello spettro di potenza, è improbabile che le proteine formino un cristallo 2D.
  7. Controllare la copertura del monostrato lipidico sulla griglia EM utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione (TEM). Un'immagine elettronica ingrandita inferiormente è utile per identificare la morfologia del monostrato coperto. Di solito, il contrasto dell'immagine dell'area coperta da monostrato sarà leggermente inferiore a quello delle aree scoperte. Inoltre, lo spettro di potenza dell'immagine 2D calcolata aiuterà a identificare la posizione del cristallino 2D.

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Results

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Un monostrato lipidico depositato sulla griglia EM può essere visualizzato al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) senza macchie. La presenza del monostrato può essere riconosciuta dalla differenza di contrasto dall'area senza alcun campione nel percorso del fascio. Le aree che hanno una copertura lipidica monostrato hanno un contrasto locale inferiore rispetto a quelle senza copertura, poiché il fascio di elettroni attraverso i fori vuoti non ha dispersione e mostra un'illuminazione più luminosa (

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Discussion

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Un monostrato lipidico è un potente strumento che facilita la crescita di grandi cristalli 2D per studi strutturali di macromolecole biologiche. Per preparare con successo un monostrato lipidico intatto all'interfaccia aria-acqua, si raccomanda vivamente che i lipidi siano preparati appena il giorno dell'esperimento, perché l'ossidazione della catena lipidica acilico potrebbe portare a un'interruzione dell'imballaggio nel monostrato e influire negativamente sulla formazione di cristalli risultante. I lipidi acquistati in...

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Disclosures

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Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da dichiarare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La preparazione di questo manoscritto è stata parzialmente supportata dall'US Army Research Office (W911NF2010321) e dai fondi di avvio dell'Arizona State University per P.-L.C.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
14:0 PC (DMPC)Avanti Lipids8503451,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina,
1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2,5 mL
Bulbo per pipette piccoleFisher Scientific03-448-21
CloroformioSigma-AldrichC2432
Essiccatore sottovuotoSouthern Labware55207
Griglie EMScienze della microscopia elettronicaCF413-50CF-1.2/1.3-4C 1.2 µ m foro, 1,3 µ m spazio
Carta da filtroGE Healthcare Life Sciences1001-090Diametro 90 mm
Vetro Pasteur pipetteFisher Scientific13-678-20A
Siringa Hamilton (25 µ L)Hamilton Company80465
Siringa Hamilton (250 µ L)Hamilton Company81165
Siringa Hamilton (5 µ L)Hamilton Company87930
Siringa Hamilton (500 µ L)Hamilton Company203080
MetanoloSigma-AldrichM1775-1GA
Piastra di PetriVWR25384-342100 mm & 15 mm
Blocco di teflonGrainger55UK0560 &; Pozzetti a L con porte di iniezione laterali, pinzette fatte manualmente
Microscopia elettronica Scienze78325Vari stili
Acqua
Pulitore ad ultrasuoniVWR97043-996
ultrapura

References

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