I monostrati lipidici sono stati utilizzati come base per la formazione di cristalli proteici bidimensionali (2D) per studi strutturali per decenni. Sono stabili all'interfaccia aria-acqua e possono fungere da materiale di supporto sottile per l'imaging elettronico. Qui presentiamo i passaggi comprovati sulla preparazione di monostrati lipidici per studi biologici.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Preparazione del campione utilizzando un metodo monostrato lipidico per studi cristallografici elettronici
In questo articolo
Sommario
Abstract
La cristallografia elettronica è un potente strumento per la determinazione della struttura ad alta risoluzione. Le macromolecole come le proteine solubili o di membrana possono essere coltivate in cristalli bidimensionali (2D) altamente ordinati in condizioni favorevoli. La qualità dei cristalli 2D cresciuti è fondamentale per la risoluzione della ricostruzione finale tramite l'elaborazione di immagini 2D. Nel corso degli anni, i monostrati lipidici sono stati utilizzati come strato di supporto per favorire la cristallizzazione 2D delle proteine di membrana periferica e delle proteine solubili. Questo metodo può essere applicato anche alla cristallizzazione 2D di proteine di membrana integrali, ma richiede un'indagine empirica più ampia per determinare le condizioni di detergente e dialisi per promuovere la suddivisione nel monostrato. Un monostrato lipidico si forma all'interfaccia aria-acqua in modo tale che i gruppi di testa lipidica polare rimangano idratati nella fase acquosa e le catene acilice non polari, le code si dividano nell'aria, rompendo la tensione superficiale e appiattindo la superficie dell'acqua. La natura carica o le parti chimiche distintive dei gruppi di testa forniscono affinità per le proteine in soluzione, promuovendo il legame per la formazione di array 2D. Un monostrato di nuova formazione con l'array 2D può essere facilmente trasferito in un microscopio elettronico (EM) su una griglia di rame rivestita di carbonio utilizzata per sollevare e supportare l'array cristallino. In questo lavoro, descriviamo una metodologia monostrato lipidico per l'imaging criogenico al microscopio elettronico (crio-EM).
Introduzione
La diffrazione elettronica attraverso cristalli 2D o matrici elicoidali di proteine può raggiungere risoluzioni sub-nanometriche in casi favorevoli1,2,3. Di particolare interesse sono gli array di proteine di membrana 2D ricostituite o i cristalli nei loro ambienti quasi nativi1. Poiché un cristallo agisce come un amplificatore di segnale migliorando l'intensità dei fattori strutturali a specifiche frequenze spaziali, la cristallografia elettronica consente di sondare un bersaglio con dimensioni più piccole ad alte risoluzioni, come piccole molecole, r....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Preparazione del blocco di teflon
- Preparare il blocco di Teflon da resina PTFE (politetrafluoroetilene) resistente agli agenti chimici. Praticate dei fori sul blocco utilizzando un trapano generale seguito dalle quote etichettate nella Figura 1.
2. Preparazione lipidica monostrato
NOTA: Tempo di funzionamento stimato: 30-45 minuti
- Preparazione del brodo lipidico
- Preparare una miscela lipidica da 0,01 mg/mL in cloroformio/metanolo 9:1 (v/v) utilizzando 8,91 mL di cloroformio, 0,99 mL di metanolo e 0,01 ml di lipidi....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Un monostrato lipidico depositato sulla griglia EM può essere visualizzato al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) senza macchie. La presenza del monostrato può essere riconosciuta dalla differenza di contrasto dall'area senza alcun campione nel percorso del fascio. Le aree che hanno una copertura lipidica monostrato hanno un contrasto locale inferiore rispetto a quelle senza copertura, poiché il fascio di elettroni attraverso i fori vuoti non ha dispersione e mostra un'illuminazione più luminosa (
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Un monostrato lipidico è un potente strumento che facilita la crescita di grandi cristalli 2D per studi strutturali di macromolecole biologiche. Per preparare con successo un monostrato lipidico intatto all'interfaccia aria-acqua, si raccomanda vivamente che i lipidi siano preparati appena il giorno dell'esperimento, perché l'ossidazione della catena lipidica acilico potrebbe portare a un'interruzione dell'imballaggio nel monostrato e influire negativamente sulla formazione di cristalli risultante. I lipidi acquistati in.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da dichiarare.
Ringraziamenti
La preparazione di questo manoscritto è stata parzialmente supportata dall'US Army Research Office (W911NF2010321) e dai fondi di avvio dell'Arizona State University per P.-L.C.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 14:0 PC (DMPC) | Avanti Lipids | 850345 | 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina, 1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2,5 mL |
| Bulbo per pipette piccole | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Cloroformio | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Essiccatore sottovuoto | Southern Labware | 55207 | |
| Griglie EM | Scienze della microscopia elettronica | CF413-50 | CF-1.2/1.3-4C 1.2 µ m foro, 1,3 µ m spazio |
| Carta da filtro | GE Healthcare Life Sciences | 1001-090 | Diametro 90 mm |
| Vetro Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Siringa Hamilton (25 µ L) | Hamilton Company | 80465 | |
| Siringa Hamilton (250 µ L) | Hamilton Company | 81165 | |
| Siringa Hamilton (5 µ L) | Hamilton Company | 87930 | |
| Siringa Hamilton (500 µ L) | Hamilton Company | 203080 | |
| Metanolo | Sigma-Aldrich | M1775-1GA | |
| Piastra di Petri | VWR | 25384-342 | 100 mm & 15 mm |
| Blocco di teflon | Grainger | 55UK05 | 60 &; Pozzetti a L con porte di iniezione laterali, pinzette fatte manualmente |
| Microscopia elettronica Scienze | 78325 | Vari stili | |
| Acqua | |||
| Pulitore ad ultrasuoni | VWR | 97043-996 |
Riferimenti
- Raunser, S., Walz, T. Electron crystallography as a technique to study the structure on membrane proteins in a lipidic environment. Annual Review of Biophysics. 38 (1), 89-105 (2009).
- Avila-Sakar, A. J., Chiu, W.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
