Valutazione della bioenergetica cellulare in cellule staminali ematopoietiche di topo e progenitrici primitive utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare

Surinder Kumar; Morgan Jones; Qing Li; David B. Lombard

doi:10.3791/63045

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Articolo metodologico

Valutazione della bioenergetica cellulare in cellule staminali ematopoietiche di topo e progenitrici primitive utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare

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DOI:

10.3791/63045

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24 settembre 2021

Surinder Kumar¹ , Morgan Jones² , Qing Li²^,³^,⁴ , David B. Lombard¹^,⁴^,⁵

¹Department of Pathology, University of Michigan, Ann Arbor, ²Department of Internal Medicine, University of Michigan, Ann Arbor, ³Department of Cellular and Developmental Biology, University of Michigan, Ann Arbor, ⁴Rogel Cancer Center, University of Michigan, Ann Arbor, ⁵Institute of Gerontology, University of Michigan, Ann Arbor

In questo articolo

Sommario

Il metodo qui presentato riassume i protocolli ottimizzati per la valutazione della bioenergetica cellulare nelle cellule staminali ematopoietiche non aderenti del topo e nelle cellule progenitrici primitive (HSPC) utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare per misurare il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) e il tasso di consumo di ossigeno (OCR) degli HSPC in tempo reale.

Abstract

Allo stato stazionario, le cellule staminali ematopoietiche (HSC) rimangono in gran parte quiescenti e si ritiene che dipendano prevalentemente dalla glicolisi per soddisfare le loro esigenze energetiche. Tuttavia, in condizioni di stress come infezioni o perdita di sangue, le HSC diventano proliferative e producono rapidamente cellule progenitrici a valle, che a loro volta si differenziano ulteriormente, producendo infine cellule del sangue mature. Durante questo processo di transizione e differenziazione, le HSC escono dalla quiescenza e subiscono rapidamente un passaggio metabolico dalla glicolisi alla fosforilazione ossidativa (OxPHOS). Varie condizioni di stress, come l'invecchiamento, il cancro, il diabete e l'obesità, possono avere un impatto negativo sulla funzione mitocondriale e quindi possono alterare la riprogrammazione metabolica e la differenziazione delle HSC e dei progenitori durante l'ematopoiesi. Preziose informazioni sulle funzioni glicolitiche e mitocondriali di HSC e progenitori in condizioni normali e di stress possono essere ottenute attraverso la valutazione del loro tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) e del tasso di consumo di ossigeno (OCR), che sono indicatori di glicolisi cellulare e respirazione mitocondriale, rispettivamente.

Qui, viene fornito un protocollo dettagliato per misurare ECAR e OCR in popolazioni di cellule derivate dal midollo osseo di topo, che includono sia cellule staminali ematopoietiche che cellule progenitrici primitive (HSPC), utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare. Questo protocollo descrive gli approcci per isolare le cellule negative al lignaggio dal midollo osseo del topo, spiega l'ottimizzazione della densità di semina cellulare e le concentrazioni di 2-deossi-D-glucosio (2-DG, un analogo del glucosio che inibisce la glicolisi) e vari farmaci mirati a OxPHOS (oligomicina, FCCP, rotenone e antimicina A) utilizzati in questi saggi e descrive le strategie di trattamento farmacologico. In questi saggi possono essere misurati i parametri chiave del flusso glicolitico, come la glicolisi, la capacità glicolitica e la riserva glicolitica e i parametri OxPHOS, come la respirazione basale, la respirazione massima, la perdita di protoni, la produzione di ATP, la capacità respiratoria di riserva e l'efficienza di accoppiamento. Questo protocollo consente misurazioni ECAR e OCR su HSPC non aderenti e può essere generalizzato per ottimizzare le condizioni di analisi per qualsiasi tipo di cella di sospensione.

Introduzione

L'ematopoiesi è il processo mediante il quale vari tipi di cellule del sangue mature con funzioni altamente specializzate sono formate da HSC¹. Le HSC sono in grado di auto-rinnovarsi e differenziarsi in varie popolazioni progenitrici multipotenti e specifiche del lignaggio. Questi progenitori alla fine producono cellule di lignaggi linfoidi, mieloidi, eritroidi e megacariociti. Per mantenere la loro capacità di auto-rinnovamento, le HSC rimangono in gran parte quiescenti e, come altre cellule staminali tissutali, si ritiene che si basino sulla glicolisi piuttosto che sull'OxPHOS mitocondriale per la produzione di ATP