Interfacce idrogel fotodegradabili per lo screening, la selezione e l'isolamento dei batteri

Summary

Viene segnalato l'uso di idrogel fotodegradabili per isolare le cellule batteriche utilizzando uno strumento di battito luminoso ad alta risoluzione. Vengono esaminate le procedure sperimentali essenziali, i risultati e i vantaggi del processo. Il metodo consente l'isolamento rapido ed economico di batteri mirati che mostrano funzioni rare o uniche da comunità o popolazioni eterogenee.

Abstract

I biologi hanno a lungo tentato di comprendere la relazione tra fenotipo e genotipo. Per comprendere meglio questa connessione, è fondamentale sviluppare tecnologie pratiche che abbinino lo screening cellulare microscopico con l'isolamento cellulare ad alta purezza per l'analisi genetica a valle. Qui, viene descritto l'uso di idrogel poli(glicole etilenico) fotodegradabili per lo screening e l'isolamento di batteri con fenotipi di crescita unici da popolazioni cellulari eterogenee. Il metodo si basa sull'incapsulamento o sull'intrappolamento delle cellule con l'idrogel, seguito da coltura, screening microscopico, quindi utilizzo di uno strumento di modellazione della luce ad alta risoluzione per il controllo spaziotemporale della degradazione dell'idrogel e il rilascio di cellule selezionate in una soluzione per il recupero. L'applicazione di diversi modelli di luce consente il controllo sulla morfologia della cellula estratta e modelli come anelli o croci possono essere utilizzati per recuperare le cellule con un'esposizione diretta minima alla luce UV per mitigare il danno al DNA agli isolati. Inoltre, lo strumento di modellazione della luce fornisce una dose di luce regolabile per ottenere varie velocità di degradazione e rilascio cellulare. Consente la degradazione ad alta risoluzione, consentendo il recupero delle cellule con precisione spaziale su scala micron. Qui, viene dimostrato l'uso di questo materiale per schermare e recuperare batteri sia da idrogel sfusi che da dispositivi microfabbricati lab-on-a-chip. Il metodo è economico, semplice e può essere utilizzato per applicazioni comuni ed emergenti in microbiologia, tra cui l'isolamento di ceppi batterici con profili di crescita rari da librerie mutanti e l'isolamento di consorzi batterici con fenotipi emergenti per caratterizzazioni genomiche.

Introduction

L'isolamento di cellule con comportamenti unici da un ambiente complesso ed eterogeneo è fondamentale per ottenere informazioni genetiche in biologia¹. In microbiologia, la selezione e l'isolamento di microbi rari o unici dopo l'osservazione diventa importante in molte applicazioni che richiedono una connessione tra informazioni genomiche e informazioni fenotipiche osservabili. Queste applicazioni includono la selezione di ceppi fenotipicamente rari da librerie mutanti², la selezione di microrganismi chiave da comunità microbiche complesse^3,4e la selezione di batteri fenotipicamente rari ma importanti da popolazioni isogeniche. L'isolamento di cellule vitali ma non coltivabili (VBNC) da una popolazione batterica è un esempio importante di quest'ultima, dove le cellule con il fenotipo VBNC sono spesso nascoste in popolazioni di batteri a 1:10² a 1:10⁵ rapporti^5,6. A causa delle diffuse difficoltà nell'isolamento dei batteri, molto rimane sconosciuto su molti microrganismi fenotipicamente rari. Queste limitazioni sottolineano la necessità di tecniche di isolamento cellulare per identificare prima la cellula o le cellule bersaglio da una miscela e quindi recuperarle e isolarle per l'analisi molecolare a valle⁷.

Alcuni dei metodi più comunemente stabiliti di isolamento cellulare includono la citometria a flusso e lo smistamento cellulare attivato fluorescente (FACS)^8,la separazione immunomagnetica^9,10e la microfluidica^11. Mentre questi metodi di isolamento hanno un valore elevato, hanno anche degli svantaggi che ne limitano l'uso. Ad esempio, FACS può fornire l'isolamento microbico di routine a livello di singola cellula per l'analisi genomica di follow-up^3, ma è spesso limitato dalla sua disponibilità e spesa, nonché dai problemi di contaminazione a valle¹¹. Approcci basati su microfluidici come la citometria a flusso microfluidica hanno ottenuto molta attenzione, che, rispetto alla citometria a flusso convenzionale, consente una significativa riduzione del volume del campione richiesto¹². Tuttavia, la separazione e il recupero di un singolo o di piccole raccolte di cellule da dispositivi microfluidici è spesso un problema impegnativo che in genere richiede una configurazione e una progettazione del dispositivo più complesse¹³. Molti approcci basati su microfluidici caratterizzano geneticamente le cellule prima che vengano immesse e osservate in un dispositivo¹⁴, limitando il numero di specie uniche osservate durante l'esecuzione di uno schermo funzionale. Date queste limitazioni, è necessaria un'ulteriore innovazione di metodi e materiali pratici per lo screening e l'isolamento cellulare per un uso diffuso in molti laboratori.

Questo documento presenta un nuovo approccio basato sui materiali per lo screening e l'isolamento dei batteri. Il metodo utilizza idrogel fotodegradabili per l'incapsulamento cellulare, la coltura, l'osservazione microscopica e il rilascio e il recupero su richiesta di batteri mirati con fenotipi unici. Gli idrogel sono progettati per contenere una dimensione di maglia di 10 nm, dove ogni reticolazione contiene gruppi di o-nitrobenzile¹⁵. Il materiale incapsula o intrappola le cellule per l'osservazione, consentendo al contempo la diffusione di nutrienti e prodotti di scarto da e verso le cellule per la coltura. L'esposizione del materiale a una sorgente di luce UV a 365 nm modellata attraverso un microscopio verticale consente la degradazione locale dell'idrogel attraverso la fotoccolatura dei gruppi o-nitrobenzile^16,17. La degradazione innesca il rilascio selettivo di cellule per il recupero per l'analisi a valle, compresa l'analisi genomica e, potenzialmente, proteomica e trascrittomica. La configurazione sperimentale e il protocollo sono relativamente semplici, economici e traslazionali per i laboratori di microbiologia. Richiede solo l'incapsulamento cellulare attraverso la formazione di idrogel, l'osservazione delle cellule catturate con un microscopio a campo luminoso e fluorescenza verticale e l'illuminazione delle cellule di interesse con una sorgente di luce UV modellata per il recupero.

Un vantaggio chiave di questo approccio allo screening basato sui materiali è la sua adattabilità a diversi formati di screening. Nel suo formato più elementare, il materiale può essere utilizzato per lo screening incapsulando una raccolta di cellule eterogenee in idrogel sfusi. Le cellule vengono quindi osservate per il fenotipo desiderato e le singole cellule di interesse vengono rimosse per la caratterizzazione genomica. In formati più elaborati, il materiale può anche essere integrato in dispositivi lab-on-a-chip per fornire un rilascio e un recupero precisi delle celle dalle aree desiderate del dispositivo. Entrambi i formati sono descritti qui, ed entrambi hanno permesso recenti nuove applicazioni di screening microbico e selezione^17,18,19. Il metodo è qui dimostrato con organismi Gram-negativi modello (Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens) e un organismo modello Gram-positivo (Bacillus subtilis) ed è stato prontamente esteso a una varietà di altri batteri.

Protocol

1. Ceppi batterici e protocolli di coltura

1. Colonie di batteri su piastre di agar integrate con mezzi di crescita appropriati. In questo rapporto, B. subtilis (ceppo 1A1135, Bacillus Genetic Stock Center) viene coltivato su ATGN (0,079 M KH₂PO₄, 0,015 M (NH₄)₂SO₄, 0,6 mM MgSO₄·7H₂O, 0,06 mM CaCl₂·2H₂O, 0,0071 mM MnSO₄· H₂O, 0,125 m FeSO_4· 7H₂O, 28 mM di glucosio, pH: 7 ± 0,2, 15 g/L di agar) piastre di agar integrate con 100 μg/mL di spectinomicina ed E. coli (ceppo 25922, ATCC) su piastre di agar ATGN integrate con ampicillina da 100 μg/mL.
   NOTA: Precedenti rapporti di incapsulamento e rilascio di idrogel con questi materiali da Fattahi et al.¹⁹ invece utilizzavano cellule A. tumefaciens C58
2. Scegli le colonie desiderate dai piatti di agar ATGN e inizia le colture notturne. Per i ceppi di E. coli e B. subtilis qui utilizzati, la coltura a 37 °C mentre si agita a 215 giri/min in mezzo liquido ATGN per 24 ore. Conservare le colture cellulari in glicerolo al 50% a -80 °C fino all'uso futuro.
3. Prelevare colonie di entrambi i ceppi da stock di glicerolo utilizzando anelli di inoculazione sterili e incubare in mezzi liquidi ATGN per 24 ore a 37 °C e 215 giri/min.

2. Preparazione del materiale necessario per la formazione di idrogel

1. Sintesi fotodegradabile di PEG-o-NB-diacrilato
   NOTA: La sintesi interna del PEG-o-NB-diacrilato è stata ben descritta e precedentemente riportata^16,17. In alternativa, poiché la sintesi è di routine, può essere esternalizzata da un impianto di sintesi chimica.
2. Buffer di reticolazione
   1. Prendi la ricetta del mezzo selezionato per il ceppo batterico e prepara i media con 2x nutrienti. Aggiungere il fosfato, ad esempio NaH₂PO_4, alla concentrazione medio-finale di 100 mM. Quindi, regolare il valore del pH su 8 utilizzando 5 M NaOH (aq).
   2. Sterilizzare la soluzione tampone e conservarla a -20 °C fino a nuovo utilizzo.
      NOTA: Tralasciare eventuali metalli di transizione presenti nel mezzo, in quanto questi metalli catalizzano l'ossidazione dei tioli a disolfuri.
3. Soluzione di PEG-o-NB-diacrilato
   1. Per ogni mg di polvere aliquota PEG-o-NB-diacrilato (3.400 Da peso molecolare), aggiungere 3,08 μL di acqua ultrapura per raggiungere 49 mM di concentrazione di PEG-o-NB-diacrilato (98 mM di concentrazione di acrilato).
   2. Vorticare la soluzione fino a quando non è ben miscelata e conservare questa soluzione a -20 °C fino a nuovo utilizzo.
4. Soluzione di PEG-tiolo a 4 bracci
   1. Per la preparazione di PEG-tiolo a 4 bracci (10.000 Da peso molecolare), aggiungere 4 μL di acqua ultrapura per mg di polvere per raggiungere una concentrazione di 20 mM (80 mM di concentrazione di tiolo).
   2. Vorticosamente questa soluzione fino a quando non è ben miscelata e conserva questa soluzione a -20 °C fino a nuovo utilizzo.

3. Preparazione di coverslip perfluoroalchilati (non reattivi)

1. Posizionare fino a 5 vetrini (25 mm x 75 mm x 1 mm) all'interno di una pinza scorrevole in polipropilene. Sonicare i vetrini con una soluzione detergente al 2% (p/v)(Tabella dei materiali)per 20 min.
2. Risciacquare i vetrini tre volte con acqua ultrapura, quindi sonicare i vetrini in acqua per 20 minuti. Asciugare le diapositive usando un flusso di N₂.
3. Plasma pulito (vedere Tabella dei materiali)su entrambi i lati dei vetrini secondo il protocollo di cui al paragrafo 4.1 per 2 min.
4. Riposizionare i vetrini puliti al plasma nel raccoglitore e riempire il contenitore con una soluzione allo 0,5% (v/v) di tricloro(1H, 1H, 2H, 2H,-perfluoroottil)silano in toluene. Consentire a queste diapositive di vetro di essere funzionalizzate per 3 ore a temperatura ambiente (RT).
5. Dopo che le diapositive sono state funzionalizzate, sciacquare le diapositive all'interno del mailer di scorrimento, prima con toluene e successivamente con etanolo (tre volte con ciascun solvente). Quindi, asciugare ogni diapositiva funzionalizzata con un flusso di N₂.

4. Preparazione di coperture funzionalizzate (base) di tiolo

1. Pulizia delle coperture in vetro con un detergente al plasma
   1. Posizionare i coperchi di 18 mm x 18 mm in una capsula di Petri. Quindi, posizionare la capsula di Petri in una camera di pulizia al plasma e accendere l'alimentazione del pulitore al plasma.
   2. Accendere la pompa per vuoto per liberare l'aria all'interno della camera fino a quando il manometro legge 400 mTorr.
   3. Aprire la valvola dosatrice per far entrare l'aria nella camera fino a quando il manometro raggiunge una pressione costante (800-1000 mTorr). Quindi, selezionare RF con la modalità "Hi" ed esporre i coverslip per 3 minuti.
   4. Dopo 3 minuti, spegnere la modalità RF e la pompa per vuoto.
   5. Togliere la capsula di Petri dalla camera, capovolgere le coperture e rimetterle nella camera per esporre al plasma l'altro lato della copertura di vetro.
   6. Ripetere i passaggi 4.1.2-4.1.4 per pulire al plasma il lato non trattato del coperchio di vetro.
   7. Dopo aver completato il processo, rimuovere la capsula di Petri dalla camera e spegnere il detergente al plasma e la pompa per vuoto.
2. Pulizia e idrossilazione dei coverslip con soluzione di piranha
   NOTA: i protocolli di pulizia piranha standard possono essere utilizzati per pulire e idrossilare gli scivoli di vetro. La soluzione di Piranha è una miscela 30:70 (v/v) di H₂O₂ e H₂SO₄. Possono essere utilizzati anche metodi alternativi di pulizia delle coperture in vetro.
   ATTENZIONE: La soluzione di Piranha è fortemente corrosiva ed esplosiva con solventi organici e deve essere maneggiata con estrema cautela. Dovrebbero essere attuate adeguate misure di sicurezza e contenimento, come l'uso di adeguati dispositivi di protezione individuale (camice da laboratorio, grembiule resistente alle sostanze chimiche, occhiali di sicurezza, visiera, guanti butilici resistenti agli acidi). Tutti gli oggetti in vetro e le superfici di lavoro a contatto con la soluzione di piranha devono essere puliti, asciutti e privi di residui organici prima dell'uso. La soluzione di Piranha non deve mai essere conservata in un contenitore parzialmente chiuso o chiuso.
   1. Posizionare una parabola di vetro pulita da 100 mm x 50 mm su un agitatore magnetico a piastra con velocità di agitazione regolabile sotto una cappa aspirante e aggiungere 14 ml di H₂SO₄ al piatto.
   2. Posizionare delicatamente una piccola barra magnetica rivestita in teflon utilizzando una pinza rivestita in teflon all'interno del piatto. Quindi, ruotare lentamente l'agitatore per evitare schizzi di acido.
   3. Quindi, aggiungere delicatamente 6 ml di H₂O₂ al piatto e lasciare che la soluzione diventi ben miscelata.
   4. Spegnere l'agitatore, quindi rimuovere la barra di agitazione dal piatto usando la pinza. Quindi, posizionare delicatamente i coperchi all'interno del piatto usando la pinza e impostare la temperatura a 60-80 °C.
   5. Dopo 30 minuti, rimuovere delicatamente le coperture usando la pinza e immergerle in acqua deionizzata (DI) due volte per lavare via la soluzione di piranha residua.
   6. Dopo il risciacquo con acqua, conservare i coperchi in acqua DI a RT fino a nuovo utilizzo.
   7. Spegnere la piastra elettrica e lasciare raffreddare la soluzione di piranha.
   8. Per smaltire la soluzione di piranha, posizionare delicatamente il piatto di vetro da 100 mm x 50 mm contenente la soluzione di piranha raffreddata in un becher di vetro vuoto più grande di almeno 1,5 L di volume. Quindi aggiungere 1 L di acqua per diluire e aggiungere polvere di bicarbonato di sodio per neutralizzare. Si noti che il bicarbonato di sodio causerà gorgogliamento e generazione di calore e dovrebbe essere aggiunto molto lentamente, altrimenti il gorgogliamento può portare a schizzi dell'acido. Quando l'ulteriore aggiunta di bicarbonato di sodio non causa gorgogliamento, controllare il pH con carta pH per verificare che sia stato neutralizzato. Una volta che la soluzione è neutralizzata e raffreddata, può essere versata nel lavandino.
3. Funzionalizzazione tiolica dei coverslips
   1. Preparare una soluzione al 5% (v/v) di 269 mM di soluzione di trimetossisilano (MPTS) (3-mercaptopropil) in toluene secco.
   2. Aggiungere 10 mL della soluzione ai singoli tubi conici della centrifuga da 50 mL e posizionare un coperchio pulito in ciascun tubo e immergerlo all'interno della soluzione.
      NOTA: un coverslip per tubo da 50 ml viene utilizzato per assicurare la tiolazione di entrambi i lati del substrato senza essere disturbato da altri substrati.
   3. Dopo 4 ore, lavare ogni coverslip (quattro lavaggi per coverslip) con toluene, un etanolo 1:1 (v/v): miscela di toluene ed etanolo.
      NOTA: Questo viene fatto immergendo ogni coverslip sequenzialmente in tubi conici di centrifuga contenenti le soluzioni menzionate.
   4. Dopo aver risciacquato il substrato, immergerli in etanolo e conservarli a 4 °C fino a nuovo utilizzo.
      NOTA: A seconda del numero di coverslip, questo metodo può diventare laborioso a causa del trattamento dei coverslip uno alla volta. Per più coverslip, è possibile utilizzare barattoli Columbia che si adattano a più coverslip contemporaneamente.

5. Fabbricazione di array di microwell in silicio

1. Rivestimento in parylene: utilizzare il protocollo standard descritto nei precedenti articoli di ricerca^20,21 per rivestire i wafer di silicio con parylene.
2. Microfabbricazione: Seguire il protocollo descritto da Barua et al.¹⁸ per progettare e fabbricare l'array di microwell (Figura supplementare 1).
   NOTA: Le tecniche fotolitografiche standard descritte da Timm et al.¹⁷ sono state applicate per fabbricare array di microwell su wafer di silicio rivestiti di parylene.

6. Formazione di idrogel

1. Formazione di idrogel sfuso su coperture di vetro
   1. Soluzione precursore dell'idrogel: aggiungere 12,5 μL del tampone reticolante a un tubo microcentrifuga da 0,5 mL, seguito da 5,6 μL di soluzione peg-o-NB-diacrilato. Infine, aggiungere 6,9 μL di soluzione di PEG-tiolo a 4 bracci alla miscela.
      NOTA: l'aggiunta del tiolo PEG a 4 bracci alla miscela avvia la reazione di reticolazione. Pertanto, la soluzione precursore dell'idrogel deve essere utilizzata immediatamente dopo la miscelazione.
   2. Per l'incapsulamento cellulare nella soluzione precursore dell'idrogel, seguire i passaggi 6.1.3-6.1.9.
   3. Per l'incapsulamento cellulare, prima del passaggio 6.1.1, inoculare il tampone di reticolazione con la densità cellulare desiderata. Come riportato in precedenza¹⁹, è stato osservato che la densità cellulare di 7,26 ×^{10 7} CFU / mL nel tampone di reticolazione è correlata a una densità di ~ 90 celle / mm² incapsulate attraverso l'idrogel.
   4. Posizionare la coverslip della base tiolata su una capsula di Petri pulita. Posizionare due distanziali (vedi Tabella dei materiali)sui due lati opposti del coperchio.
      NOTA: La funzionalizzazione tiolica dei coverslip è necessaria per l'attacco covalente dell'idrogel alla superficie del coverslip. Questo viene fatto attraverso la reazione dei gruppi tiolici sulla superficie e dei gruppi acrilati presenti nella soluzione precursore dell'idrogel.
   5. Fissare i distanziali sulla coverlip di base legando i distanziali alla piastra di Petri.
   6. Pipettare il volume desiderato della soluzione precursore su un vetrino perfluoroalchilato non reattivo.
   7. Posizionare il vetrino perfluoroalchilato sul coperchio di base (Figura 1C). Attendere 25 minuti a RT per completare la formazione di idrogel.
   8. Dopo la gelificazione, rimuovere delicatamente il vetrino perfluoroalchilato. L'idrogel rimarrà attaccato al coperchio di base.
      NOTA: per i coperchi da 18 mm x 8 mm per ottenere una membrana spessa 12,7 μm, utilizzare ~7 μL della soluzione precursore (Figura 1A,B). L'uso di volumi più elevati di soluzione precursore può provocare idrogel sotto il coperchio di base. Ciò può causare l'adesione del coperchio di base alla capsula di Petri e rompersi in caso di tentativo di rimozione. Inoltre, i residui di idrogel sotto il coperchio sono problematici per la microscopia. È necessaria una rimozione delicata del vetrino perfluoroalchilato non reattivo poiché una rapida rimozione può danneggiare l'idrogel.
   9. Posizionare il substrato in una capsula di Petri da 60 x 15 mm in un terreno di coltura specificato. Qui, i mezzi ATGN integrati con 100 μg/mL di spectinomicina per B. subtilis o 100 μg/mL di ampicillina per E.coli a 37 °C sono stati utilizzati per tempi di coltura di 24 ore.

Figura 1: Formazione di idrogel su coperture di vetro tiolato. (A) I distanziatori con uno spessore di 12,7 μm sono posti su due lati opposti di un coperchio di base contenente gruppi tiolici reattivi. (B) La soluzione precursore dell'idrogel viene pipettata su un vetrino fluorurato non reattivo. (C) Il vetrino non reattivo viene posizionato sui distanziatori per la formazione di idrogel di 12,7 μm di spessore. (D) Il vetrino non reattivo viene rimosso delicatamente, lasciando l'idrogel attaccato al coperchio di base. (E) L'idrogel preparato può essere incubato in terreni per la coltura. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

7. Formazione di idrogel su array di microwell

1. Semina di batteri in array di microwell
   NOTA: 700 μL di 0,1 OD₆₀₀ sospensioni cellulari sono state seminate sui substrati dell'array di microwell e il metodo di decollo del parylene è stato applicato per rimuovere le cellule dallo sfondo utilizzando il protocollo descritto da Timm etal. ²².
2. Preparare la soluzione precursore dell'idrogel aggiungendo 5,6 μL di PEG-o-NB-diacrilato con 12,5 μL di ATGN salino tamponato con fosfato pH 8 e mescolando con 6,9 μL della soluzione di tiolo PEG a quattro bracci.
3. Pipettare 12,5 μL della soluzione precursore su un vetrino di vetro perfluoroalchilato non reattivo e posizionare due distanziatori in acciaio da 38 μm (vedi Tabella dei materiali)su due lati opposti del substrato dell'array di microwell inoculato con celle.
4. Invertire il vetrino perfluoroalchilato con la goccia di soluzione precursore e posizionare la goccia al centro del substrato del microwell. Quindi, incubare per 25 minuti a RT per la formazione di idrogel.
5. Rimuovere delicatamente il vetrino dal substrato del microwell. La membrana idrogel deve rimanere attaccata al substrato del microwell. Procedere al passaggio 6.1.9.

8. Preparazione del materiale per l'estrazione cellulare

1. Preparazione del supporto PDMS
   1. Metti insieme una pila di dieci coverslip da 18 x 18 mm e incolla questa pila di coverslip sul fondo di una capsula di Petri.
   2. Per fabbricare supporti PDMS, mescolare il precursore PDMS e l'agente polimerizzante con un rapporto di volume di 10: 1 in un bicchiere di plastica, degasare la miscela in un essiccatore sottovuoto e quindi versare la miscela nella capsula di Petri.
   3. Polimerizzare PDMS per 90 min a 80 °C. Quindi, tagliare intorno al blocco nastrato per rimuovere il supporto PDMS e posizionare il supporto PDMS su un vetrino per una più facile manipolazione al microscopio.
2. Preparazione di microsiringhe e tubi
   1. Tagliare 20 cm di tubo in PTFE (0,05 in ID) e fissare un'estremità del tubo a una siringa a microlitri da 100 μL.
      NOTA: per l'estrazione, evitare l'uso di pipette poiché disegnare le celle rilasciate tramite una punta di pipetta può danneggiare la superficie dell'idrogel e portare alla contaminazione.

9. Degradazione dell'idrogel con lo strumento di illuminazione modellata

NOTA: i seguenti passaggi descritti in questa sezione sono identici sia per gli idrogel sfusi che per gli array di microwell, ad eccezione dei modelli di esposizione alla luce descritti nei passaggi 9.6.4-9.6.6 e 9.6.7-9.6.10.

1. Accendere il microscopio (vedi Tabella dei materiali). Quindi, attivare lo strumento di illuminazione a motivi geometrici(vedere Tabella dei materiali ).
2. Accendere il modulo di controllo analogico e digitale della sorgente luminosa a LED da 365 nm. Quindi, accendere il modulo di controllo della sorgente luminosa a LED.
3. Aprire il software del microscopio e il software per lo strumento di illuminazione modellata. Quando viene aperta la finestra di configurazione hardware, selezionare il pulsante Carica.
   NOTA: qui verranno caricati tre dispositivi. (Telecamera di terze parti, un modulo di controllo e lo strumento di illuminazione a motivi geometrici)
4. Premere il pulsante Start. Ora si aprirà la finestra del software di modellazione della luce. Seleziona la prima opzione, il pulsante Controllo dispositivo, nella barra laterale sinistra della finestra.
5. Calibrare lo strumento di illuminazione a motivi geometrici.
   NOTA: la calibrazione deve essere eseguita con lo stesso obiettivo e filtro del microscopio che verrà utilizzato per l'esposizione alla luce.
   1. Impostare l'obiettivo del microscopio su ingrandimento 10x.
      NOTA: questo ingrandimento consente una distanza di lavoro sufficiente tra la lente del microscopio e la superficie del campione. Consente inoltre di monitorare e registrare il processo di recupero in tempo reale attraverso la finestra dell'immagine.
   2. Impostare la lente e il filtro del microscopio sulle impostazioni utilizzate per l'esposizione alla luce e posizionare lo specchio di calibrazione sotto il microscopio.
   3. Nella finestra Controllo dispositivo, premere la scheda Controllo LED. Accendere il LED #1 e impostare l'intensità della luce sul numero desiderato. Negli esperimenti di estrazione standard, questo è impostato al 60%.
   4. Premere la scheda intitolata con il nome del prodotto dello strumento di illuminazione a motivi geometrici nella finestra Controllo dispositivo. Quindi, premere il pulsante Mostra griglia.
      NOTA: sullo specchio di calibrazione verrà proiettato un modello di griglia.
   5. Regolare la messa a fuoco del microscopio e l'esposizione della fotocamera per ottenere un'elevata qualità dell'immagine della griglia e ruotare la fotocamera per allineare le linee della griglia parallele alla cornice della finestra della fotocamera, se necessario.
   6. Selezionare il pulsante Calibrazione guidata nella scheda intitolata con il nome del prodotto dello strumento di illuminazione a motivi geometrici e seguire le istruzioni fornite dal software in questa finestra.
      NOTA: verrà aperta una finestra di configurazione della fotocamera di terze parti.
   7. Verrà aperta una finestra di selezione del tipo di calibrazione. Selezionare Calibrazione automatica e premere Avanti.
   8. Quando si apre la finestra Regolazione pre-calibrazione, seguire le istruzioni del software e premere il pulsante Avanti.
   9. Quando si apre la finestra Informazioni di mappatura, salvare la calibrazione di conseguenza nella cartella desiderata. Questo viene fatto inserendo la data, il nome del microscopio, la lente dell'obiettivo e il filtro.
   10. Dopo la calibrazione, premere il pulsante Definizione area di lavoro che si trova sotto la scheda intitolata con il nome del prodotto dello strumento di illuminazione modellato per definire l'area di lavoro dello strumento di illuminazione modellato, se necessario.
6. Sezione Sequence Design per la preparazione del pattern.
   1. Premere il pulsante Sequence Design nella barra laterale sinistra della finestra del software. Quindi, premere il pulsante Editor sequenza profili.
   2. Quando viene visualizzata la finestra Editor sequenza profili, selezionare l'opzione Nuovo profilo in Elenco profili.
      NOTA: ora verrà aperta una finestra dell'Editor di serie.
   3. Preparare il modello desiderato per l'esposizione alla luce scegliendo diverse forme e dimensioni del modello o, se lo si desidera, disegnare manualmente il modello.
   4. Per i modelli di cerchio e croce spezzata per l'idrogel sfuso, seguire i passaggi 9.6.5- 9.6.6
   5. Per i modelli di cerchio, definire un cerchio con un diametro di 30 μm su una colonia di batteri bersaglio per coprire l'intera colonia. Scegli il colore di riempimento della forma bianco.
   6. Per i modelli a croce spezzati, scegliete la forma rettangolare dalla finestra di disegno del modello con dimensioni di 3 μm x 8 μm. Posiziona quattro rettangoli con questa dimensione sui bordi della colonia di destinazione, mentre metà dei modelli ha una sovrapposizione con la colonia.
   7. Per i modelli di cerchio e anello per gli array di microwell, seguire i passaggi 9.6.8-9.6.10.
   8. Per i modelli circolari, disegnare un cerchio di 10 μm di diametro attorno al perimetro del pozzo. Scegli il colore di riempimento della forma bianco.
   9. Per il modello ad anello, disegnare un cerchio di diametro 20 μm, posizionarlo sopra il pozzetto e scegliere il colore di riempimento della forma bianco.
   10. Disegna un altro motivo circolare di diametro 10 μm con forma di riempimento di colore nero e posizionalo attorno al perimetro del pozzo.
7. Modificate la serie e modificate le forme in base al metodo di estrazione desiderato. Assicurarsi che il modello desiderato esista all'interno dell'area di lavoro dello strumento di illuminazione a motivi geometrici.
8. Posizionare il campione in un supporto PDMS e pipettare il supporto definito sulla parte superiore del campione per prevenire la disidratazione del campione e fornire una soluzione portante per le cellule rilasciate.
9. Quindi, sostituirlo con lo specchio di calibrazione.
10. Regolare la messa a fuoco del microscopio per ottenere un'immagine nitida delle colonie all'interno dell'idrogel. Ispeziona le colonie per identificare una colonia di interesse.
11. Qui, progetta i modelli di luce mentre la vista della fotocamera mostra le colonie all'interno del campione per testare diversi modelli per l'estrazione cellulare.
12. Salvate la serie definita. Dopo aver salvato la serie definita, selezionate la sezione Controllo sessione.
13. In questa sezione, sotto la scheda intitolata con il nome del prodotto dello strumento di illuminazione a motivi geometrici, aggiungere la sequenza salvata.
14. Dopo aver aggiunto la sequenza, scegliete l'opzione per simulare il modello da visualizzare e regolare per la posizione di esposizione desiderata.
    NOTA: la posizione del campione può essere regolata qui per garantire che il modello sia proiettato con precisione sull'area di destinazione.
15. Quindi, regolare l'intensità della luce al 60% e il tempo di esposizione a 40 s nella scheda di controllo LED e avviare il processo di esposizione.
16. Monitorare la degradazione dell'idrogel in tempo reale e in modalità brightfield per garantire il rilascio delle cellule.
    NOTA: Prevenire eventuali movimenti al campione durante l'esposizione alla luce in quanto può causare la degradazione di aree indesiderate dell'idrogel con conseguente contaminazione incrociata.

10. Recupero delle cellule

NOTA: la procedura di recupero delle celle è identica sia per gli idrogel di massa che per gli array di microwell.

1. Dopo un'esposizione alla luce di 365 nm e il rilascio cellulare, raccogliere le cellule utilizzando una siringa a microlitri e tubi microfluidici (Figura 2).
   NOTA: il recupero delle cellule deve essere eseguito immediatamente dopo l'esposizione del modello. Ciò consente il recupero cellulare localizzato prima che le cellule rilasciate si allontanino dall'area irradiata.
2. Cambiare il microscopio da campo luminoso a filtro FITC o TRITC per consentire la visualizzazione dell'area esposta del campione ad occhio nudo.
3. Una volta individuata l'area esposta, posizionare l'estremità del tubo sul punto irradiato. Quindi riportare il filtro del microscopio in campo luminoso per monitorare il recupero delle cellule in tempo reale.
4. Utilizzare la siringa attaccata all'altra estremità del tubo per prelevare con cura le cellule rilasciate. Prelevare 200 μL della soluzione e inserire la soluzione in un tubo centrifugo da 1,5 mL per l'analisi del DNA o la placcatura.

Figura 2: Rappresentazione schematica del metodo di estrazione per la raccolta delle cellule rilasciate dall'idrogel. Qui, immediatamente dopo l'esposizione ai raggi UV a 365 nm, la degradazione dell'idrogel e il rilascio cellulare, il microscopio viene utilizzato per illuminare il campione di idrogel con la luce di un filtro TRITC, risultando in una macchia verde brillante che copre l'area in cui si è verificato il rilascio cellulare. Questo aiuta l'utente a identificare la posizione spaziale per la raccolta dei campioni. Dopo aver visualizzato quest'area, il tubo di raccolta attaccato a una siringa a microlitri viene posizionato in questo punto e il campione viene raccolto. La microscopia a campo luminoso con ingrandimento 10x viene utilizzata per monitorare l'estremità della superficie del tubo e dell'idrogel in tempo reale per una raccolta precisa delle cellule. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

11. Purificazione genomica del DNA e misurazione della qualità del DNA

1. Utilizzare il kit di purificazione del DNA (vedi Tabella dei materiali)per estrarre il DNA dagli isolati di batteri.
   1. Seguire le specifiche del produttore descritte nel manuale del kit di purificazione del DNA²³ fino all'ultimo passaggio (passaggio 7), che richiede l'eluizione con Buffer AE.
   2. Per la fase di eluizione, seguire le specifiche del produttore, con la differenza di utilizzare 100 μL di Buffer AE invece di 200 μL.
   3. Ripetere l'eluizione una volta come descritto al punto 11.1.2. Questo passaggio porta ad un aumento della resa complessiva del DNA.
2. Misurare la qualità del DNA utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis (vedi Tabella dei materiali).
   1. Accendere lo spettrofotometro. Dopo l'inizializzazione del dispositivo, nella home page, selezionare l'opzione dsDNA sullo schermo.
   2. Quindi, sollevare il braccio del piedistallo e pulire la posizione del piedistallo con acqua DI e salviette prive di lanugine.
   3. Pipettare 2 μL di una soluzione in bianco, qui tampone AE, sulla posizione del piedistallo e portare delicatamente il braccio del piedistallo verso il basso e selezionare Blank sullo schermo.
   4. Quindi, sollevare il piedistallo e pulire la posizione del piedistallo con acqua DI per rimuovere qualsiasi materiale residuo dalla misurazione precedente.
   5. Caricare il campione (2 μL) sulla posizione del piedistallo, abbassare il braccio del piedistallo e selezionare il pulsante Misura sullo schermo.
   6. Ripetere i passaggi 11.2.4 e 11.2.5 per tutti i campioni.
   7. Una volta effettuata la misurazione, selezionare "Termina esperimenti" sullo schermo. Inserire l'unità flash nel dispositivo e premere "Esporta dati" sullo schermo.

12. Determinazione della vitalità cellulare da estratti di idrogel e microwell

1. Diluire le sospensioni batteriche con un fattore di diluizione di^{10 5} utilizzando una piastra a 96 pozzetti.
2. Pipettare 10 μL della sospensione batterica diluita e spot tre volte sulle piastre ATGN per ogni sospensione batterica.
3. Inclinare le piastre per diffondere le celle sulle superfici dell'agar. Asciugare all'aria le piastre ATGN contenenti le sospensioni batteriche.
4. Incubare le piastre a 37 °C per 48 h. Contare e registrare i numeri delle unità di formazione delle colonie (CFU). Contare tutte e tre le diffusioni di sospensioni batteriche su ciascuna piastra.
   NOTA: eseguire i passaggi 12.1-12.4 in un armadio di sicurezza biologica per evitare la contaminazione della piastra.

Results

Per studiare la capacità della luce UV di innescare la degradazione controllata dell'idrogel per il rilascio cellulare, gli idrogel sono stati prima incapsulati su coperture tiolate senza batteri presenti. Ogni idrogel è stato esposto a tre modelli di luce a cerchio replicato a diverse intensità e tempi di esposizione. La percentuale di degradazione del gel è stata calcolata dopo l'esposizione alla luce UV ad ogni intensità luminosa e il tempo di esposizione è stato quindi quantificato accoppiando gruppi tiolici pendenti con un colorante fluoresceina-5-maelimide per l'imaging a fluorescenza^19,24. Un esempio rappresentativo di come questi due parametri influenzano la degradazione dell'idrogel è mostrato nella Figura 3. Come evidente, la luce modellata fornita dallo strumento di illuminazione modellata fornisce il controllo spazio-temporale della degradazione dell'idrogel a una risoluzione che può consentire il rilascio solo di un piccolo numero di cellule.

Figura 3: Controllo sulla degradazione dell'idrogel. La dose di luce UV e il conseguente tasso di degradazione dell'idrogel sono sintonizzabili tramite lo strumento di illuminazione modellato. (Inserto) Sono state scelte due diverse intensità luminose per la degradazione pattern dell'idrogel. Dopo un'esposizione alla luce UV a 365 nm, gli idrogel sono stati etichettati con fluoresceina-5-maleimmide per l'imaging a fluorescenza. Ristampato (adattato) con il permesso di Fattahi et al.¹⁹ Copyright 2020 American Chemical Society. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per l'estrazione cellulare, sono stati utilizzati diversi modelli di luce per studiare il rilascio cellulare (Figura 4). Qui, le cellule batteriche di Agrobacterium sono state incapsulate in idrogel sfusi su coperture di vetro tiolato, quindi coltivate in colonie su microscala. Gli idrogel sono stati quindi ispezionati al microscopio a campo luminoso e le microcolonie mirate sono state esposte a vari modelli di luce UV. È stato osservato che diversi modelli di esposizione hanno influenzato la morfologia delle cellule rilasciate. Questo è potenzialmente vantaggioso per varie applicazioni. Ad esempio, l'esposizione di un modello ad anello attorno alla colonia bersaglio provoca il rilascio dell'intera colonia ancora incapsulata in un idrogel PEG protettivo e senza esposizione diretta alla luce UV(Figura 4A),che può preservare le cellule e fornire una facile purificazione a valle. Al contrario, esponendo parte o tutta la colonia alla luce UV, le cellule possono essere estratte come cluster cellulari aggregati (Figura 4B) o come cellule libere e singole (Figura 4C).

Figura 4: Controllo sulla morfologia delle cellule estratte. (A) Uso di un modello ad anello per rilasciare l'intera colonia cellulare, protetta in una matrice PEG. (B) Uso di un modello incrociato spezzato per il rilascio di cellule in aggregati. (C) Uso di un modello incrociato per rilasciare singole cellule. Ristampato (adattato) con il permesso di Fattahi et al.¹⁹ Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Fondamentale nel protocollo di incapsulamento è sia la densità di semina cellulare che lo spessore dell'idrogel, poiché entrambi questi parametri possono influenzare il numero di cellule incorporate nell'idrogel per l'osservazione. Per dimostrare, i campioni di cellule di A. tumefaciens sono stati incapsulati in idrogel di due diversi spessori utilizzando distanziatori sottili (12,7 μm) o distanziatori spessi (40 μm) coltivati e ripresi seguendo i protocolli stabiliti. Gli idrogel più sottili hanno determinato una densità di microcolonia di 90 colonie/mm² in tutto l'idrogel, dove è stata osservata una sovrapposizione minima delle colonie (Figura 5A). Al contrario, gli spessori dell'idrogel superiori a 12,7 μm hanno provocato la formazione di colonie sovrapposte nella direzione verticale (Figura 5B), che può comportare l'estrazione di più colonie. Le colonie sovrapposte possono causare contaminazione incrociata durante l'estrazione a causa della natura bidimensionale del modello di luce. Ad esempio, una colonia superiore può essere presa di mira, mentre con essa viene estratta anche una colonia sottostante (Figura 5C). Pertanto, l'utilizzo di distanziatori da 12,7 μm è raccomandato per la preparazione dell'idrogel.

Figura 5: Lo spessore dell'idrogel influisce sulla purezza dell'estrazione. (A) Utilizzando distanziatori con uno spessore di 12,7 μm per la formazione di idrogel, le colonie si formano all'interno di un piano focale 10x. (B) La sovrapposizione di colonie può essere osservata con un ingrandimento di 10x se si utilizzano distanziatori con spessori superiori a 12,7 μm. (C)La contaminazione incrociata può verificarsi con una sovrapposizione di colonie durante il rilascio cellulare: (i) viene utilizzato un modello ad anello per rilasciare una colonia cellulare mirata, (ii) la colonia cellulare bersaglio si stacca dall'idrogel e (iii) si osserva una seconda colonia sottostante durante l'esposizione alla luce sotto la colonia bersaglio. Anche questa colonia viene rimossa, con conseguente contaminazione incrociata. Ristampato (adattato) con il permesso di Fattahi et al.¹⁹ Copyright 2020 American Chemical Society. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Dato il potenziale danno ai batteri con la luce UV, l'effetto di varie micropattern di luce UV sulla vitalità cellulare è stato ulteriormente studiato utilizzando il modello, batteri Gram-positivi (B. subtilis) e modello, batteri Gram-negativi (E. coli). Ognuno è stato incapsulato all'interno di idrogel sfusi e coltivato in colonie su microscala secondo protocolli standard, verificandone la compatibilità con l'idrogel. Microcolonie mirate di dimensioni equivalenti (26 ± diametro di 1 μm) sono state quindi esposte a una dose di luce costante (168 mJ / mm²), sotto forma di modelli circolari che espongono intere microcolonie alla luce UV o modelli incrociati che degradano solo i bordi dell'idrogel per ridurre al minimo l'esposizione alla luce alle cellule. Le cellule sono state quindi recuperate e placcate per quantificare i CFU/mL recuperati da ciascuna colonia. Non è stata riscontrata alcuna differenza significativa nel livello di recupero cellulare (Figura 6A). Per indagare ulteriormente la purezza delle cellule estratte, il DNA è stato estratto da campioni di E. coli e analizzato utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis. Per entrambi i modelli, i livelli di qualità del DNA rientrano in un intervallo A₂₆₀/ A₂₈₀ tra 1,8 e 2,0 (Figura 6B), che è nell'intervallo ideale per il sequenziamento genomico²⁵. Ciò dimostra che i modelli UV utilizzati per il rilascio nelle condizioni descritte hanno un effetto minimo sulla quantità di cellule vitali recuperate dagli idrogel di massa o sulla qualità del DNA genomico dopo l'estrazione.

Figura 6: Impatto di diversi modelli di esposizione alla luce sulla vitalità cellulare e sulla qualità del DNA dei batteri rilasciati da idrogel sfusi. (A) Livelli di recupero cellulare sia per E. coli che per B. subtilis dopo l'estrazione utilizzando modelli incrociati e modelli circolari. Per questo esperimento, l'estrazione è stata effettuata da colonie sferiche con lo stesso diametro (26 μm ± 1 μm) per garantire che il numero di cellule rilasciate da ciascuna colonia fosse equivalente. Le soluzioni estratte sono state quindi placcate per calcolare i CFU/mL acquisiti da ciascun modello. L'analisi statistica non ha mostrato differenze significative nei CFU/mL ottenuti da modelli incrociati e circolari sia per E. coli che per B. subtilis (valore P > 0,05, n= 6 per entrambi i ceppi). (B) Quantificazione spettrofotometrica della qualità del DNA per cellule isolate di E. coli utilizzando modelli a croce e cerchio. Qui, l'analisi statistica non ha mostrato una differenza significativa nella qualità del DNA per i modelli utilizzati (valore P > 0,05, n = 6) (C) Immagini a campo luminoso di colonie con diametri uguali esposti a modelli incrociati e circolari. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli array Microwell forniscono un'interfaccia di screening alternativa lab-on-a-chip che offre funzionalità di screening più controllate rispetto agli idrogel sfusi. Ad esempio, gli array di microwell consentono la semina dei batteri in siti di coltura discreti in cui è possibile controllare il numero di cellule nell'inoculo. Anche le caratteristiche geometriche dei micro pozzetti, come la profondità e il diametro, sono controllate attraverso metodi di microfabbricazione standard. Con questi benefici, i microwell sono stati utili per studiare la crescita dei batteri sotto confinamento spaziale²⁶e più recentemente per la scoperta di interazioni simbiotiche e antagoniste tra diverse specie batteriche quando confinate insieme alla microscala¹⁸. L'estrazione cellulare da pozzi per l'analisi genomica come il sequenziamento amplicon 16S è fondamentale per queste applicazioni. Utilizzando lo stesso materiale idrogel, la luce UV può essere esposta su un pozzo contenente cellule di interesse, sia come modelli circolari che adanello. Quest'ultimo garantisce la degradazione dell'idrogel solo sul perimetro del microwell per prevenire l'irradiazione diretta delle cellule. Per dimostrarlo, le cellule di A. tumefaciens che esprimono mCherry sono state seminate in pozzi, l'idrogel è stato quindi attaccato all'array di microwell. Le cellule sono state coltivate e poi irradiate con modelli circolari o ad anello. La membrana è stata quindi macchiata con colorante fluoresceina-5-maleimmide. Le immagini a fluorescenza a due colori hanno rivelato che sia la membrana che le cellule all'interno dei pozzetti vengono rimosse per entrambi i modelli di irradiazione¹⁷. A differenza del formato idrogel di massa, l'estrazione cellulare qui è stata osservata solo sotto forma di cluster cellulari¹⁸.

Figura 7: Immagini rappresentative al microscopio confocale che mostrano l'impatto del modello di luce sull'isolamento cellulare da array di microwell. (A) Micro pozzetti con diametri di 40 μm contenenti batteri (rosso) dopo la semina e la coltura. (B) Esposizione alla luce utilizzando modelli di cerchi e anelli (blu). (C) La diminuzione della fluorescenza rossa dimostra che le cellule vengono estratte dai pozzetti irradiati. (D) Immagine a fluorescenza bicolore di membrane e batteri dopo irradiazione, che indica la rimozione sia dell'idrogel (verde) che dei batteri (rosso) dai pozzetti bersaglio. (E) Z-stack, immagine a fluorescenza a due colori dei pozzi bersaglio. La linea rossa in (D) denota il piano xz ripreso in (E), e la linea verde in (E) denota il piano xy ripreso in (D). I campioni nelle immagini (C-E) sono stati lavati per la rimozione delle cellule rilasciate, quindi fissati e ripresi. Barra della scala = 40 μm. Ristampato (adattato) con il permesso di van der Vlies et al.¹⁷. Copyright 2019 American Chemical Soceity. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per quantificare la vitalità delle cellule batteriche e la qualità del DNA dopo l'estrazione in questo formato, le cellule di B. subtilis ed E. coli sono state seminate, coltivate e quindi rilasciate da array di microwell utilizzando modelli di cerchi e anelli (Figura 8A, B). Le cellule rilasciate sono state quindi placcate su piastre di agar ATGN e la qualità del DNA delle cellule estratte è stata quantificata. Per garantire che un numero consistente di cellule fosse presente durante ogni estrazione, microwell con intensità fluorescenti simili (~ 6000 U.A.) e quindi un numero simile di cellule sono stati presi di mira per il rilascio. Il numero di cellule vitali estratte utilizzando un modello circolare non era significativamente diverso dal numero di cellule vitali estratte utilizzando il modello ad anello per entrambi i batteri (Figura 8C). Inoltre, i livelli di qualità del DNA non erano significativamente diversi tra i modelli di cerchio e anello per entrambi i batteri (Figura 8D). Quindi, simile ai risultati degli idrogel sfusi, l'applicazione della luce UV all'intensità e alla durata qui specificate ha avuto un impatto trascurabile sulla vitalità e sulla qualità del DNA delle cellule estratte dagli array di microwell. Questi risultati dimostrano che le cellule batteriche vitali possono essere recuperate selettivamente dai micro pozzetti con danni minimi per l'analisi a valle.

Figura 8: Impatto di diversi modelli di esposizione alla luce sulla vitalità cellulare e sulla qualità del DNA dei batteri rilasciati dagli array di microwell. (A,B) Sia per E. coli che per B. subtilis,sono stati utilizzati modelli circolari e modelli ad anello per l'estrazione cellulare da microwell da 10 μm. Il modello circolare con un diametro di 10 μm e il modello ad anello con un diametro interno di 10 μm e un diametro esterno di 20 μm sono stati utilizzati in questo esperimento per l'estrazione cellulare. Sono stati utilizzati micro pozzetti con gli stessi diametri per garantire che il numero di cellule rilasciate da ciascun microwell fosse lo stesso. (C) Le soluzioni estratte sono state quindi placcate per calcolare i CFU/mL acquisiti da ciascun modello di esposizione. L'analisi statistica non ha mostrato differenze significative nei CFU/mL ottenuti dal modello circolare e ad anello sia per E. coli che per B. subtilis (valore P > 0,05, n = 6 per entrambi i ceppi). (D) La spettrofotometria è stata utilizzata per misurare la qualità del DNA di entrambe le cellule di E. coli e B. subtilis usando modelli di cerchi e anelli. Qui, l'analisi statistica non ha mostrato alcuna differenza significativa nella qualità del DNA per i modelli utilizzati (valore P > 0,05, n = 6 per entrambi i ceppi). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: Progettazione e fabbricazione di array di microwell. (A) Sono state applicate tecniche standard di microfabbricazione per fabbricare array di microwell su wafer di silicio. (B) Ogni substrato era costituito da 7 x 7 matrici di pozzi da 10 μm di diametro con profondità di 20 μm e passo di 30 μm. (C) Ogni array era costituito da 225 microwell. Questa cifra è stata modificata da Barua et al.¹⁸. Copyright 2021 Frontiers Media. Fare clic qui per scaricare questo file.

Discussion

Questo manoscritto dimostra l'uso di idrogel fotodegradabili per lo screening e l'isolamento dei batteri. Il materiale e l'approccio consentono una coltura ad alta produttività, il controllo sui terreni di crescita e sulle condizioni di crescita e l'estrazione delle cellule pulita e precisa in modo semplice ed economico. L'estrazione richiede solo un microscopio fluorescente accoppiato con lo strumento di illuminazione modellata e può essere eseguita in modo sequenziale per isolare più bersagli cellulari. Ogni estrazione richiede 5-10 minuti per essere eseguita e fino a 30 colonie mirate sono state rimosse da un singolo idrogel. Un vantaggio chiave dell'approccio è la sua adattabilità a una varietà di diversi formati di test, come dimostrato qui con lo screening sia da idrogel sfusi che da array di microwell. Il processo di separazione in entrambi i formati è stato utilizzato con successo per isolare i batteri che mostrano un comportamento di crescita unico per la genotipizzazione a valle dopo la coltura e l'osservazione microscopica, una capacità critica per collegare il genotipo cellulare al fenotipo. Ad oggi, le caratterizzazioni genomiche dei batteri estratti da queste interfacce hanno incluso il sequenziamento amplicon 16S per identificare collezioni multi-specie di batteri da microbiomi ambientali che generano un comportamento di crescita emergente¹⁸e per il sequenziamento dell'intero genoma per identificare con successo mutazioni genetiche che causano rari profili di crescita nelle cellule presenti all'interno di librerie mutanti¹⁹.

L'utilizzo di idrogel sfusi per lo screening e l'isolamento cellulare è il formato più semplice e diretto. Gli idrogel fotodegradabili alla rinfusa si formano rapidamente (25 minuti) dopo aver miscelato i precursori su coperture di vetro trasparente per incapsulare le cellule in una matrice di coltura cellulare 3D che viene ripresa con un microscopio a fluorescenza verticale o invertita standard. Pertanto, il metodo ha il potenziale per essere traslazionale per i comuni laboratori di microbiologia che non dispongono di risorse o competenze di microfabbricazione. Uno svantaggio di questo formato è che le cellule sono orientate in modo casuale attraverso l'idrogel tridimensionale. Pertanto, le cellule possono apparire fuori dal piano focale quando l'imaging con obiettivi di ingrandimento più elevati e l'estrazione può essere difficile se le colonie cellulari sono orientate troppo vicine l'una all'altra o se c'è una sovrapposizione verticale di colonie. Depositare un idrogel sottile (<13 μm) come descritto è fondamentale per mitigare questo inconveniente. L'esposizione in modelli di luce incrociata spezzata (Figura 4B) è preferibile qui, poiché questo modello si traduce in cellule prive di idrogel che hanno un'esposizione minima alla luce UV e possono essere facilmente recuperate attraverso la placcatura.

Al contrario, il formato dell'array microwell fornisce un'interfaccia più ben controllata, poiché le cellule batteriche sono suddivise in microwell discreti che fungono da piccoli siti di coltura o^{co-colture 17,18,26.} Le dimensioni, il passo e la densità di Microwell sono fabbricati con precisione utilizzando tecniche fotolitografiche standard. Rispetto agli idrogel sfusi, i batteri possono essere estratti da array di microwell con un più alto grado di specificità e una minore possibilità di contaminazione incrociata, poiché le cellule sono presenti solo in posizioni predefinite, non disperse casualmente in tutto l'idrogel. La concentrazione e i rapporti delle cellule batteriche nella soluzione di semina possono anche essere variati per controllare la quantità e la composizione dell'inoculo del microwell attraverso un processo di semina che è stato caratterizzato in precedenti rapporti²⁶, dando all'utente flessibilità nella progettazione sperimentale dello schermo. Lo svantaggio principale dello screening con il formato array microwell è il tempo e le competenze aggiuntivi necessari per la microfabbricazione. La fabbricazione di micro pozzi è stata stimata a un costo di ~ $ 10 per array, che include i costi dei materiali e le spese per le camere bianche. Inoltre, gli array di microwell sono tradizionalmente realizzati in silicio, il che può causare difficoltà di imaging poiché i substrati non sono trasparenti. Inoltre, un'elevata quantità di diffusione della luce dalla superficie del silicio può limitare l'imaging all'interno dei micro pozzetti e può ridurre la risoluzione del modello durante l'esposizione all'idrogel con la luce UV dallo strumento di illuminazione modellata (visto nella Figura 8A,B). Microwell simili sono stati fabbricati su substrati di quarzo trasparente per affrontare questi tipi di limitazioni²⁷; tuttavia, questa fabbricazione è considerevolmente più difficile. L'esposizione a modelli ad anello che illuminano il perimetro del pozzo è preferibile qui per rilasciare cellule libere dai pozzetti riducendo al minimo l'esposizione ai raggi UV.

Il problema più comune che si verifica in entrambi i formati è il distacco dell'idrogel dal substrato sottostante durante la coltura a causa del gonfiore dell'idrogel. Se questo è un problema per gli idrogel sfusi, la presenza, la densità e l'uniformità dei gruppi tiolici nello strato di attacco chimico (MTPS) attraverso la superficie del coperchio di vetro di base devono essere verificate utilizzando una tecnica di caratterizzazione superficiale appropriata (XPS, ATR-FTIR, AFM, ecc.). Basse densità di gruppi tiolici superficiali a causa di una funzionalizzazione superficiale inefficiente possono portare a una debole interazione tra il substrato e l'idrogel. Se si verifica un basso livello di tiolazione superficiale, deve essere controllata la stabilità della soluzione MTPS. Si deve prestare attenzione nella pulizia iniziale del vetrino per assicurare una superficie pulita prima del trattamento MTPS e si deve prestare attenzione per garantire l'uso di toluene anidro durante la reazione superficiale MTPS (Protocollo Sezione 4). Nel caso di array di microwell, le superfici non sono tiolate e gli idrogel si attaccano invece attraverso il riempimento parziale dei pozzetti con l'idrogel, che ancora l'idrogel al substrato di silicio¹⁷. Se il distacco dell'idrogel è un problema in questo sistema, è possibile incidere più microwell o altre caratteristiche su microscala nell'array per ancorare ulteriormente l'idrogel al substrato per promuovere un attacco più forte.

Una limitazione della tecnica in entrambi i formati è la limitata stabilità degli idrogel in presenza di batteri. È stato notato che alcuni batteri, come A. tumefaciens, possono degradare l'idrogel nel corso di 5-7 giorni¹⁷,^19,il che limita il tempo dell'esperimento. Sono in corso le attuali indagini sui meccanismi di degradazione batterica; si ipotizza che i gruppi estere presenti dai monomeri diacrilato siano soggetti a idrolisi mediata da batteri e/o degradazione enzimatica, come notato in altri sistemi¹⁷. Lo sviluppo di sostanze chimiche idrogel più stabili prolungherà il tempo in cui i batteri possono rimanere nell'idrogel e estenderà lo schermo ai microrganismi con tassi di crescita più lenti. Una seconda limitazione è che in entrambi i formati, il recupero e l'estrazione cellulare avvengono in un ambiente aperto, con conseguenti volumi di estrazione relativamente elevati (30-100 μL), che possono essere suscettibili alla contaminazione esterna. Pertanto, è necessario prestare attenzione per garantire che siano presenti abbastanza cellule dalle colonie bersaglio riducendo al minimo il volume della soluzione di estrazione. Per ottenere abbastanza cellule per la placcatura e il recupero o per l'estrazione di materiale del DNA, è stato osservato che negli idrogel sfusi, le cellule devono essere coltivate abbastanza a lungo da raggiungere diametri di colonie di almeno 10 μm. Per ridurre il volume richiesto per l'estrazione cellulare, è stato osservato che l'uso di una siringa e di un tubo a microlitri (Figura 2) era più efficiente del pipettaggio. Il tubo ha permesso di prelevare gli isolati dal punto di rilascio in modo più accurato, richiedendo meno volume di soluzione e riducendo la possibilità di contaminazione.

Il lavoro futuro prevede la comprensione dell'effetto delle proprietà meccaniche dell'idrogel sulla crescita cellulare, poiché le caratteristiche meccaniche di questi idrogel sono ben controllate dalla selezione di appropriati precursori monomerici a base di PEG di vari pesi molecolari²⁸e le interazioni meccaniche probabilmente svolgono un ruolo importante nel comportamento dei batteri²⁹. Poiché i materiali idrogel possono essere facilmente incorporati in una varietà di sistemi e dispositivi diversi, l'ulteriore sviluppo si concentra anche sull'integrazione di questo materiale in sistemi microfluidici. Ciò ridurrebbe la soluzione di estrazione a volumi da femtoliter a picoliter, rispetto ai tradizionali volumi da 30-100 μL attualmente richiesti nel formato a raccolta aperta. Volumi di soluzioni più piccoli ridurrebbero notevolmente la potenziale contaminazione e sposterebbero l'approccio verso l'isolamento e la caratterizzazione di singole cellule.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Mercaptopropil)trietossisilano	Sigma-Aldrich	175617-25G	> 95%
Alconox detersivo in polvere	Alconox	1104
Solfato di ammonio	Fisher Chemical	A702-500	Autoclave granulare ACS certificata
SK300C	Yamato Scientific	18016
Bacillus subtilis 1A1135	Bacillus Genetic Stock Center	1A1135
Microscopio verticale a campo chiaro	Olympus Corporation	BX51
Cloruro di calcio, anidro	Fisher Chemical	C614-500	Per essiccatori Pellet, centrifuga a 4-20 maglie
5702	Eppendorf	5702
Acido citrico monoidrato	Sigma-Aldrich	C1909-500G	Reagente ACS, > 99,0%
D-glucosio ( Destrosio)	VWR Amresco Life Science	0188-1KG
Dneasy Blood & Kit di tessuti	Qiagen	69504	Kit di purificazione del DNA
DOWSIL 184 base in elastomero siliconico	Dow Silicones Corporation		Temperatura di stoccaggio: -30-60 ... C
DOWSIL 184 agente indurente in elastomero siliconico	Dow Silicones Corporation		Temperatura di stoccaggio: < 32 C
Spettrofotometro per micropiastre EPOCH2	BioTek Instruments	EPOCH2
Escherichia coli ATCC 25922	Thermo Fisher Scientific	R19020
Etanolo, anidro	Fisher Chemical	459844
Fisherbrand vetro di copertura per microscopio	Fisher Scientific	12540A
Fisherfinest vetrini per microscopio premium plain	Fisher Scientific	12-544-4
Soluzione di perossido di idrogeno	Sigma-Aldrich	216763-500ML	Contiene inibitore, 30% in peso in H2O
Incu-Shaker Mini	Benchmark	E5-0014-01
Isopropanolo	Sigma-Aldrich	190764
Solfato di magnesio, 7-idrato	Macron Fine Chemicals	6066-04	Avantor Performance Materials, Inc.
Metanolo	Sigma-Aldrich	179337-4L	reagente ACS, > spettrofotometro 99,8%
NanoDrop One	Thermo Scientific	ND-ONEC-W
Azoto, compresso	Matheson	UN1066
Detergente al plasma di ossigeno	Harrick Plasma	PDC-001-HP
Pentaeritritolo tetra (mercaptoetile) poliossietilene (4 bracci-PEG)	NOF America Corporation	PTE-100SH	Sunbright-PTE-100SH
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), 10X	VWR Amresco Life Science	K813-500ML	Conservare tra 15 ° C– 30 gradi C
Polidimetilsilossano (PDMS) Slygard 184	Dow Corning	4019862
Polygon400	Mightex	DSI-D-000
Vetrini per microscopio Premium	Fisher Scientific	12-544-4	25 x 75 x 1 mm
Bicarbonato di sodio	Sigma-Aldrich	S5761-500G
Cloruro di sodio	Sigma Life Science	S5886-500G	Bioreagente, adatto per colture cellulari
Idrossido di sodio	Sigma-Aldrich	S8045-500G	BioXtra, > 98%, pellet (anidro)
Sodio fosfato monobasico diidrato	Sigma-Aldrich	71505-250G	BioUltra, per biologia molecolare, > 99,0% (T)
Misuratore di spessore in acciaio inossidabile	Precision Brand Products	77739
Acido solforico	Sigma-Aldrich	320501-2.5L
Toluene, anidro, 99.8%	Sigma-Aldrich	244511-1L	Anidro, > 99.8%
Tricloro (1H,1H,2H,2H perfluoroottil) silano (TPS), 97%	Sigma-Aldrich	448931-10G
Brodo di soia triptico	Sigma-Aldrich	22092-500G	Per microbiologia
Super Nuova Agitatore Digitale con Piastra Riscaldante	Thermo Scientific	S131825
Sonicatore ad ultrasuoni	Fischer Scientific	FS-110H