È stata determinata una concentrazione ottimale di saccarosio per l'estrazione del glicogeno epatico utilizzando la centrifugazione a gradiente di densità del saccarosio. L'aggiunta di una fase di ebollizione di 10 minuti per inibire gli enzimi che degradano il glicogeno si è rivelata utile.
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Articolo metodologico
L'estrazione di molecole di glicogeno epatico per la determinazione della struttura del glicogeno
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il glicogeno epatico è un polimero di glucosio iperramificato coinvolto nel mantenimento dei livelli di zucchero nel sangue negli animali. Le proprietà del glicogeno sono influenzate dalla sua struttura. Quindi, un metodo di estrazione adatto che isoli campioni rappresentativi di glicogeno è fondamentale per lo studio di questa macromolecola. Rispetto ad altri metodi di estrazione, un metodo che impiega una fase di centrifugazione a gradiente di densità del saccarosio può ridurre al minimo il danno molecolare. Sulla base di questo metodo, una recente pubblicazione descrive come la densità della soluzione di saccarosio utilizzata durante la centrifugazione sia stata variata (30%, 50%, 72,5%) per trovare la concentrazione più adatta per estrarre particelle di glicogeno di un'ampia varietà di dimensioni, limitando la perdita di particelle più piccole. È stata introdotta una fase di ebollizione di 10 minuti per testare la sua capacità di denaturare gli enzimi che degradano il glicogeno, preservando così il glicogeno. La più bassa concentrazione di saccarosio (30%) e l'aggiunta della fase di ebollizione hanno dimostrato di estrarre i campioni più rappresentativi di glicogeno.
Introduzione
Il glicogeno è un polimero complesso e iperramificato del glucosio che si trova negli animali, nei funghi e nei batteri1. Nei mammiferi, il glicogeno epatico funziona come un tampone glicemico, preservando l'omeostasi, mentre il glicogeno muscolare agisce come un serbatoio di glucosio a breve termine per fornire energia direttamente2. La struttura del glicogeno è spesso descritta da tre livelli (mostrati nella Figura 1): 1. Le catene lineari sono formate da monomeri di glucosio tramite legami glicosidici (1→4)-α, con punti di diramazione collegati tramite legami glicosidici (1→6)-α; 2. parti....
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Protocollo
Fegati di topo utilizzati per ottimizzare questa procedura,21 provenivano da 12 topi maschi BKS-DB/Nju (7,2 settimane di età, vedere la tabella dei materiali). L'uso degli animali è stato approvato dal Comitato Etico e per la Cura degli Animali dell'Università di Wuhan, IACUC Issue No. WDRM 20181113.
1 Tessuti animali
- Pesare il fegato di topo (1-1,8 g di fegato intero di ciascun topo).
- Congelare rapidamente il fegato di topo in azoto liquido e conservarlo a -80 °C.
2. Preparazione del tampone e dei reagenti
- Preparare un tampone di isolam....
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Risultati
Mentre la procedura sopra descritta è per il metodo più ottimale (30% di saccarosio con l'aggiunta di una fase di ebollizione di 10 minuti), i dati sono qui forniti per il glicogeno estratto tramite tre concentrazioni di saccarosio (30%, 50%, 72,5%), con e senza una fase di ebollizione, come descritto in precedenza21. Seguendo il protocollo, la purezza, la resa grezza e la resa di glicogeno del glicogeno secco estratto in condizioni diverse sono riportate nella Tabella 1, riprodot.......
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Discussione
Studi precedenti hanno dimostrato che la struttura del glicogeno è importante per le sue proprietà; Ad esempio, la dimensione molecolare influisce sulla velocità di degradazione del glicogeno10 e la distribuzione della lunghezza della catena influisce sulla sua solubilità26. Per comprendere correttamente queste relazioni, è importante estrarre il glicogeno con una procedura che isoli, per quanto possibile, un campione rappresentativo e non danneggiato. I metodi tradizionali.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori sono grati al signor Gaosheng Wu e alla signorina Yunwen Zhu per l'assistenza tecnica con FACE e al signor Zhenxia Hu e al signor Dengbin per l'assistenza tecnica con SEC. MAS è supportato da una borsa di studio per la ricerca industriale Advance Queensland, dalla Mater Foundation, da Equity Trustees e dai trust LG McCallam Est e George Weaber. Questo lavoro è stato sostenuto dal programma accademico prioritario degli istituti di istruzione superiore del Jiangsu, da una sovvenzione della Natural Science Foundation of China C1304013151101138 e dal programma di talenti per l'innovazione e l'imprenditorialità del Jiangsu del 2017. Le figure
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 8-amminopirene-1,3,6-trisolfonato (APTS) | SIGMA Aldrich | 9341 | 0,1 M soluzione |
| Acido acetico | SIGMA Aldrich | 695092 | 0,1 M, pH 3,5 |
| soluzione Agilent 1260 Infinity SEC sistema | Agilent, Santa Clara, CA, USA | Cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) | |
| BKS-DB/Nju topi di fondo | Nanjing Biomedical Research Institution dell'Università di Nanchino | ||
| Kit per il dosaggio del D-glucosio (formato GOPOD) | Megazyme | K-GLUC | |
| Acido etilendinitrilotetraacetico (EDTA) | Omogeneizzatore SIGMA Aldrich | 431788 | |
| IKA | T 25 | ||
| 0,1 M | |||
| Acido cloridrico | SIGMA Aldrich | 2104 | 0,1 M |
| Sistema P/ACE MDQ plus | Ab Sciex, US | Elettroforesi dei carboidrati assistita da fluorofori (FACE) | |
| Rivelatore dell'indice di rifrazione | Optilab UT-rEX, Wyatt, Santa Barbara, CA, USA) | Cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) | |
| Acetato di sodio | SIGMA Aldrich | 241245 | 1 M, soluzione pH 4,5 |
| Azoturo di sodio | SIGMA Aldrich | S2002 | |
| Cloruro di sodio | SIGMA Aldrich | S9888 | |
| Cianoboroidruro di sodio | SIGMA Aldrich | 156159 | soluzione 1 M |
| Fluoruro di sodio | SIGMA Aldrich | 201154 | |
| Idrossido di sodio | SIGMA Aldrich | 43617 | 0,1 M |
| soluzione Nitrato di sodio | SIGMA Aldrich | NISTRM8569 | |
| Pirofosfato di sodio | SIGMA Aldrich | 221368 | |
| Sucrose | SIGMA Aldrich | V90016 | |
| SUPREMA pre-colonna, 1.000 e 10.000 colonne | Polymer Standards Services, Mainz, Germania | Cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) | |
| Trizma | SIGMA Aldrich | T 1503 | |
| Provette per ultracentrifuga | Beckman | 4 mL, provetta ultra-trasparente a parete sottile Open-Top, 11 x 60 mm |
Riferimenti
- Hills, D. M., Heller, H. C., Hacker, S. D., Hall, D. W., Sadava, D., Laskowski, M. Life: the science of biology. 12th edn. Freeeman, W. H. , (2020).
- Calder, P. C., Geddes, R. Glycogen of high molecular weight from mammalian muscle. Carbohydrate Research. 135 (2), 249-256 (1985).
- Rybicka, K. K.
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Ristampe e permessi
