Articolo metodologico

Raccolta, espansione e differenziazione di modelli primari di cellule epiteliali nasali umane per la quantificazione della frequenza del battito delle ciglia

DOI:

10.3791/63090

⸱

10 novembre 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Women's and Children's Health, Faculty of Medicine and Health, University of New South Wales, 2Molecular and Integrative Cystic Fibrosis Research Centre (miCF RC), Faculty of Medicine and Health, University of New South Wales, 3Department of Respiratory Medicine, Sydney Children's Hospital, 4Department of Pathology, School of Medical Sciences, University of New South Wales Australia, 5Katharina Gaus Light Microscopy Facility, Mark Wainwright Analytical Centre, University of New South Wales

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive la raccolta, l'espansione e la differenziazione delle cellule epiteliali nasali in modelli organotipici di cellule epiteliali delle vie aeree e la quantificazione della frequenza del battito delle ciglia tramite imaging di cellule vive e script personalizzati.

Abstract

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Le misurazioni della funzione delle ciglia (frequenza del battito, pattern) sono state stabilite come strumenti diagnostici per le malattie respiratorie come la discinesia ciliare primaria. Tuttavia, l'applicazione più ampia di queste tecniche è limitata dall'estrema suscettibilità della funzione ciliare ai cambiamenti dei fattori ambientali, ad esempio temperatura, umidità e pH. Nelle vie aeree dei pazienti con fibrosi cistica (FC), l'accumulo di muco impedisce il battito delle ciglia. La funzione delle ciglia è stata studiata in modelli cellulari primari delle vie aeree come indicatore dell'attività del canale CFTR (Transmembrane Conductance Regulator). Tuttavia, una notevole variabilità da paziente a paziente nella frequenza di battitura delle ciglia è stata riscontrata in risposta ai farmaci modulanti CFTR, anche per i pazienti con le stesse mutazioni CFTR . Inoltre, l'impatto della secrezione disfunzionale di cloruro regolata da CFTR sulla funzione ciliare è poco compreso. Attualmente non esiste un protocollo completo che dimostri la preparazione del campione di modelli in vitro delle vie aeree, l'acquisizione di immagini e l'analisi della frequenza del battito delle ciglia (CBF). Le condizioni di coltura standardizzate e l'acquisizione di immagini eseguite in una condizione controllata dal punto di vista ambientale consentirebbero una quantificazione coerente e riproducibile del CBF tra individui e in risposta ai farmaci modulanti CFTR. Questo protocollo descrive la quantificazione del CBF in tre diversi sistemi modello di cellule epiteliali delle vie aeree: 1) fogli epiteliali nativi, 2) modelli di interfaccia aria-liquido ripresi su inserti di supporto permeabili e 3) organoidi tridimensionali incorporati in matrice extracellulare. Questi ultimi due replicano la fisiologia polmonare in vivo , con ciglia battenti e produzione di muco. La funzione ciliare viene catturata utilizzando una videocamera ad alta velocità in una camera controllata dall'ambiente. Per l'analisi di CBF vengono utilizzati script personalizzati. La traduzione delle misurazioni CBF in clinica è considerata un importante strumento clinico per prevedere la risposta ai farmaci modulanti CFTR su base paziente.

Introduzione

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Le misurazioni della frequenza e del pattern del battito delle ciglia (CBF) sono state stabilite come strumenti diagnostici per malattie respiratorie come la discinesia ciliare primaria (PCD)1. Nella fibrosi cistica (FC), la disfunzione del canale del cloruro CFTR (Transmembrane Conductance Regulator) CFTR causa disidratazione del liquido superficiale delle vie aeree e compromissione della clearance mucociliare2. La funzione ciliare è stata studiata in vitro in modelli cellulari primari delle vie aeree come indicatore dell'attività del canale CFTR3. Tuttavia, esiste una notevole variabilità da paziente a paziente nel CBF in risposta ai farmaci modulanti CFTR, anche per i pazienti con le stesse mutazioni CFTR 3. Inoltre, l'impatto della secrezione disfunzionale di cloruro regolata da CFTR sulla funzione ciliare è poco compreso. Attualmente non esiste un protocollo completo che dimostri la preparazione del campione di modelli in vitro delle vie aeree, l'acquisizione di immagini e l'analisi del CBF.

I fogli epiteliali nasali isolati dalle spazzolature della mucosa nasale sono utilizzati direttamente per le misurazioni della funzione ciliare per la diagnosi di PCD4. Tuttavia, mentre non vi è alcun controllo sulle dimensioni o sulla qualità dei fogli epiteliali nasali ottenuti, il CBF varia a seconda che venga misurato su singole cellule o fogli cellulari e su bordi ciliati del foglio epiteliale che sono interrotti o ininterrotti5. Pertanto, le discinesie secondarie causate da danni alle cellule durante la raccolta delle spazzolature della mucosa nasale possono influenzare il CBF. La coltura cellulare primaria di cellule epiteliali nasali e la loro differenziazione all'interfaccia aria-liquido (ALI) o nella matrice tridimensionale della membrana basale in organoidi epiteliali delle vie aeree ciliate danno origine a ciglia esenti da discinesie secondarie 4,6,7,8. Le cellule epiteliali delle vie aeree differenziate all'ALI (d'ora in poi denominate modelli ALI) sono state considerate un importante aiuto diagnostico secondario che replica i pattern del battito ciliare e la frequenza delle spazzolature ex vivo della mucosa nasale6 e consente l'analisi dell'ultrastruttura ciliare, del pattern del battito e della frequenza del battito mantenendo i difetti specifici del paziente9 . Tuttavia, esistono discrepanze nelle metodologie utilizzate per creare questi modelli cellulari differenziati pseudostratificati e mucociliari. Diversi protocolli di espansione o differenziazione della coltura potrebbero indurre fenotipi epiteliali distinti (ciliati o secretori)10 e determinare differenze significative nel CBF11. La CBF è stata quantificata in spazzolature epiteliali nasali 4,6,12,13,14,15,16, organoidi epiteliali delle vie aeree 14,17,18 e modelli ALI 3,4,6,13,19,20, 21. Tuttavia, tra questi protocolli, ci sono grandi variabilità e spesso molti parametri non sono controllati. Ad esempio, in alcuni studi, il CBF viene ripreso in situ mentre le cellule del modello ALI rimangono sull'inserto di supporto permeabile 3,19,20,21, altre ancora raschiano le cellule dall'inserto di supporto permeabile e le visualizzano sospese nei media 4,6,13.

Inoltre, la più ampia applicazione di tecniche che misurano la funzione ciliare è limitata dall'estrema suscettibilità della funzione ciliare ai cambiamenti dei fattori ambientali. Fattori ambientali come la temperatura22, l'umidità 23,24 e il pH 25,26 influenzano la funzione ciliare e devono essere regolati per quantificare accuratamente il CBF. I vari parametri fisiologici utilizzati in diversi laboratori e il modo in cui influenzano il CBF sono stati rivisti in precedenza27.

In letteratura sono riportate varie tecnologie di imaging e approcci alle misurazioni CBF. Per la diagnostica PCD, la microscopia video viene utilizzata per misurare la funzione ciliare28,29. Recentemente, un algoritmo di analisi video basato sulla microscopia dinamica differenziale è stato utilizzato per quantificare sia il CBF che la coordinazione delle ciglianei modelli ALI 3,30 delle cellule epiteliali delle vie aeree. Questo metodo consente la caratterizzazione del battito ciliare nelle cellule epiteliali delle vie aeree in modo rapido e completamente automatizzato, senza la necessità di segmentare o selezionare regioni. Vari metodi per l'imaging e la quantificazione del CBF possono aggiungere alle differenze riportate in CBF in letteratura (Supplementary File 1).

Un protocollo dalla coltura alla quantificazione per semplificare i metodi esistenti, la standardizzazione delle condizioni di coltura e l'acquisizione di immagini, eseguite in rigorose condizioni di controllo ambientale, consentirebbero una quantificazione coerente e riproducibile del CBF all'interno e tra gli individui.

Questo protocollo fornisce una descrizione completa della raccolta di cellule epiteliali, delle condizioni di crescita di espansione e differenziazione e della quantificazione del CBF in tre diversi sistemi modello di cellule epiteliali delle vie aeree di origine nasale: 1) fogli epiteliali nativi, 2) modelli ALI ripresi su inserti di supporto permeabili e 3) organoidi tridimensionali incorporati nella matrice extracellulare (ECM) (Figura 1 ). Le cellule epiteliali nasali ottenute da spazzolature dei turbinati inferiori nasali sono utilizzate come rappresentanti dell'epitelio delle vie aeree poiché sono un surrogato efficace per le cellule epiteliali bronchiali31 superando la procedura invasiva associata alla raccolta di spazzolature bronchiali. Il metodo Conditional Reprogramming Cell (CRC) viene utilizzato per espandere le cellule epiteliali primarie delle vie aeree per la creazione di modelli ALI e organoidi tridimensionali. La riprogrammazione condizionale delle cellule epiteliali delle vie aeree in uno stato simile alle cellule staminali è indotta dalla co-coltura con il sistema cellulare alimentatore di fibroblasti arrestato dalla crescita e l'inibitore della chinasi Rho-associata (ROCK)32. È importante sottolineare che il metodo CRC aumenta il raddoppio della popolazione nelle cellule epiteliali delle vie aeree mantenendo il loro potenziale di differenziazione tessuto-specifico33,34. In tutti i modelli di cellule epiteliali delle vie aeree, la funzione ciliare viene catturata in una camera a temperatura controllata utilizzando una videocamera ad alta velocità con impostazioni di acquisizione delle immagini standardizzate. Per la quantificazione del CBF vengono utilizzati script personalizzati.

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Figura 1: Schema del flusso di lavoro. Dopo aver spazzolato il turbinato inferiore nasale dei partecipanti, le cellule epiteliali delle vie aeree vengono utilizzate in uno dei due modi. I fogli epiteliali delle vie aeree sono isolati e la frequenza del battito delle ciglia viene immediatamente visualizzata, oppure le cellule epiteliali delle vie aeree vengono espanse tramite il metodo della cellula di riprogrammazione condizionale. Le cellule epiteliali delle vie aeree espanse con CRC sono differenziate per stabilire cellule epiteliali delle vie aeree in un'interfaccia aria-liquido o colture organoidi epiteliali delle vie aeree. L'imaging della frequenza del battito ciliare viene acquisito utilizzando un microscopio di imaging a cellule vive con una camera ambientale di riscaldamento e umidità e una fotocamera scientifica ad alta frequenza di fotogrammi (>100Hz). L'analisi dei dati viene eseguita utilizzando script personalizzati. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Protocollo

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L'approvazione dello studio è stata ricevuta dal Sydney Children's Hospital Network Ethics Review Board (HREC/16/SCHN/120). Il consenso scritto è stato ottenuto da tutti i partecipanti (o dal tutore dei partecipanti) prima della raccolta dei campioni biologici.

1. Preparativi per stabilire modelli di cellule epiteliali delle vie aeree

  1. Preparare i mezzi di raccolta delle cellule nasali combinando l'80% di Modified Eagle Medium di Dulbecco e il 20% di siero bovino fetale. Supplemento con 1 μL/mL di penicillina/streptomicina. Conservare a 4 °C per un massimo di 3 mesi.
  2. Rivestire i matraccio o gli inserti di supporto permeabili con una soluzione di collagene secondo necessità seguendo le fasi da 1.2.1 a 1.2.4. Non conservare i vasi rivestiti di collagene a lungo termine.
    1. Effettuare una diluizione 1:100 della soluzione di collagene di tipo I (3 mg/mL di brodo) con soluzione salina tamponata fosfato (PBS) ad una concentrazione finale di 0,03 mg/ml. Mescolare bene.
    2. Rivestire i palloni per coltura cellulare (sezione 4) con 160 μL/cm 2 (cioè 4 ml per matraccio T25) e inserti di supporto permeabili (sezione 5) con 455 μL/cm2 (cioè 150 μL per inserto da 6,5 mm) della soluzione di collagene preparata.
    3. Incubare a 37 °C per 2-24 h.
    4. Rimuovere la soluzione di collagene mediante pipetta o aspiratore sottovuoto prima di seminare le cellule. Non lavare il recipiente prima di seminare le cellule.
  3. Preparare i supporti CRC (Conditional Reprogramming Cell) combinando i componenti32 elencati nella Tabella 1. Sterilizzare il filtro utilizzando un sistema di filtraggio a vuoto con tappo di bottiglia. Conservare a 4 °C per un massimo di 2 mesi.
  4. Il giorno dell'uso, aggiungere il fattore di crescita epidermico umano, l'inibitore ROCK e gli antibiotici come indicato nella Tabella 1.
ComponenteVolume
DMEM, alto glucosio156,7 ml
DMEM/F-12, HEPES313,3 ml
Idrocortisone55,6 μL
Insulina1,25 ml
Tossina del colera21 μL
Adenina1,2 ml
HI-FBS25 ml
Penicillina-streptomicina5 ml
Fattore di crescita epidermico umano1 μL/mL
Inibitore di ROCK1 μL/mL
Fungizone2 μl/ml
Tobramicina2 μL/mL
Ceftazidima idrato4 μL/mL
Soluzione di gentamicina1 μL/mL

Tabella 1: Componenti per 500 mL di supporti cellulari di riprogrammazione condizionale

2. Raccolta di spazzole di turbinati inferiori nasali

NOTA: Questa sezione del protocollo richiede una provetta di raccolta (50 ml) con mezzi di raccolta delle cellule nasali, spazzole citologiche, tessuti e dispositivi di protezione individuale appropriati. Evitare di spazzolare durante un'infezione del tratto respiratorio superiore. C'è un piccolo rischio di sanguinamento, che aumenta se è presente l'infiammazione. Se lo scopo della spazzolatura è quello di ottenere fogli epiteliali delle vie aeree per misurazioni ex vivo CBF, la spazzolatura dovrebbe avvenire almeno 6 settimane dopo qualsiasi infezione delle vie respiratorie superiori; Idealmente, più di 10 settimane dopo l'infezione35.

  1. Preparare il mezzo di raccolta delle cellule nasali (sezione 1) e mantenere il tubo sul ghiaccio.
  2. Descrivi la procedura al partecipante come scomoda. Spiega che durante la spazzolatura si avverte una sensazione piena nella narice, simile al salto nell'oceano / piscina e all'acqua che scorre nel passaggio nasale. Avvisare i partecipanti che la procedura indurrà la produzione di lacrime come riflesso.
  3. Valutare quale posizionamento è appropriato per il partecipante. Mettere il partecipante in posizione supina se è disponibile un lettino da esame poiché il posizionamento supino impedisce il movimento della testa del partecipante lontano dal pennello durante la procedura. In alternativa, fai sedere il partecipante vicino a un muro, contro il quale può premere la testa all'indietro.
  4. Ispezionare il passaggio nasale. Nota la deviazione del setto, i polipi e qualsiasi altra anomalia anatomica che può influenzare il passaggio del pennello nel passaggio nasale e aumentare il rischio di sanguinamento.
  5. Pulire il naso dal muco in eccesso chiedendo ai partecipanti di soffiare il naso in un tessuto.
  6. Chiedi al partecipante di respirare attraverso la bocca. Prendi un pennello citologico nella mano dominante. Mentre si appoggia la quinta cifra sul mento del partecipante per ancorare la mano, inserire il pennello citologico nel passaggio nasale del partecipante (Figura 2). Inserire il pennello a ~45° sul viso del partecipante per passare attraverso il meato nasale.
  7. Ruotare il pennello in posizione verticale in modo che sia perpendicolare al viso del partecipante. Avanzare delicatamente ma con fermezza il pennello contro la parete laterale del naso sotto il turbinato inferiore fino a quando non si trova nella parte medio-posteriore del turbinato inferiore.
    NOTA: evitare l'inserimento eccessivo; Se si avverte un improvviso calo della resistenza, è stata inserita la faringe nasale e il pennello deve essere retratto fino a quando la resistenza non viene nuovamente percepita dal proceduralista.
  8. Ruotare il pennello di 360° fino a tre volte. Rimuovere delicatamente il pennello al contrario della manovra di inserimento, in modo che le cellule non vengano spostate dal pennello.
  9. Posizionare il pennello nel tubo di raccolta preparato con il mezzo di raccolta delle cellule nasali. Posizionare il tubo di raccolta sul ghiaccio.
  10. Ripetere la spazzolatura nella seconda narice se il partecipante è d'accordo / è necessario un gran numero di cellule (ad esempio, per avviare la coltura cellulare).
    NOTA: La stessa narice può essere spazzolata di nuovo se non ci fossero cellule del sangue visibili sul pennello, notando, tuttavia, che il rischio di sanguinamento è leggermente aumentato con una seconda spazzolatura nella stessa narice.

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Figura 2: Raccolta di cellule epiteliali nasali. Illustrazione della posizione del pennello citologico nella parte medio-posteriore del turbinato inferiore. Questa posizione si raggiunge inserendo il pennello attraverso le narici, ruotando il pennello con un angolo di 90° rispetto al viso e guidando il pennello lungo il passaggio nasale sotto il turbinato inferiore. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

3. Preparazione dei fogli epiteliali delle vie aeree

NOTA: Questa sezione del protocollo richiede un tubo di raccolta (spazzola/i citologia/i + 1 mL di terreno di raccolta delle cellule nasali) (sezione 2) e una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti. Se si raccolgono spazzole di turbinato nasale allo scopo di visualizzare i fogli epiteliali delle vie aeree, utilizzare solo 1 ml di mezzi di raccolta delle cellule nasali privi di antibiotici; Altrimenti, i fogli epiteliali saranno troppo dispersi per l'imaging.

  1. Ruotare delicatamente il tubo di raccolta contenente la/e spazzola/i citologia/i per rimuovere i fogli epiteliali delle vie aeree dallo spazzolino/i.
  2. Raccogliere tutti i supporti e le celle con una pipetta P1000. Erogare 5-6 gocce in un pozzetto di una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti. Ripetere l'operazione per circa sette pozzi.
  3. Trasferire la piastra al microscopio come da punto 7.1.4 e seguire il resto della sezione 7 per visualizzare la frequenza del battito delle ciglia.
  4. Immagini di fogli epiteliali (Figura 1) e non singole cellule non attaccate poiché è stato dimostrato che la funzione ciliare differisce tra fogli epiteliali e singole cellule non attaccate5.

4. Espansione e mantenimento delle cellule epiteliali delle vie aeree

  1. Riprogrammazione condizionale delle vie aeree Coltura di espansione cellulare di riprogrammazione condizionale delle vie aeree
    NOTA: Vaso rivestito in soluzione di collagene (sezione 1), cellule di alimentazione embrionale di topo irradiate (NIH-3T3), mezzi di riprogrammazione condizionale (CRC) (sezione 1), spazzole citologiche in terreni di raccolta delle cellule nasali (paragrafo 2).
    1. Cellule alimentatrici irradiate su piastra in recipienti di coltura preparati rivestiti di soluzione di collagene ad una densità di semina di 8.000 cellule/cm 2 almeno2 ore e non più di 72 ore prima della co-coltura con cellule epiteliali delle vie aeree (vedere36 per la coltura cellulare alimentatrice e l'irradiazione).
    2. Trasferire le cellule spazzolate nel tubo di raccolta (spazzola/i citologia/i + mezzo di raccolta delle cellule nasali) nel vortice sul ghiaccio. A bassa velocità, tubo vortice 10 s on, 10 s off (tenere sul ghiaccio in mezzo) per rimuovere le cellule dalle spazzole. Il vortice vigoroso può ridurre la vitalità cellulare. Ispezionare le spazzole per verificare se il muco è ancora aderente. Se è così, ripeti il vortice.
    3. Trasferire i tubi sul ghiaccio nell'armadio di biosicurezza. Utilizzare una pipetta sierologica per trasferire il mezzo dalla provetta di raccolta a una nuova provetta (Tube B), lasciando dietro di sé i pennelli citologici. Tubo B da centrifuga a 300 × g per 7 minuti a 4 °C.
    4. Rimuovere il tubo B dalla centrifuga, eliminare il surnatante. Se il muco è visibile, lavare il pellet con altri 5 ml di terreno di raccolta delle cellule nasali e centrifugare nuovamente.
    5. Aggiungere 1 mL di materiale CRC per risospendere il pellet cellulare nel tubo B. Utilizzando una pipetta sierologica da 5 ml, far passare le cellule attraverso un setaccio cellulare posto sopra un tubo da 50 ml (tubo C) con un movimento circolare.
    6. Ripetere più volte per formare una sospensione a cella singola. Raccogliere il materiale residuo dal fondo del setaccio e incorporarlo con il supporto. Scartare il setaccio cellulare.
    7. Utilizzando una pipetta sierologica da 5 ml, prelevare 1 mL di fluido dal tubo C e trasferirlo in una provetta per microcentrifuga.
    8. Prelevare 10 μL di questa sospensione cellulare e aggiungerla al tubo della microcentrifuga pre-aliquotato con 10 μL di tripano blu. Mescolare bene e utilizzare immediatamente un contatore automatico delle celle per registrare il conteggio delle cellule e la vitalità.
    9. Seminare le cellule epiteliali delle vie aeree nel pallone T25 pre-seminato con cellule alimentatrici irradiate.
  2. Mantenimento e dissociazione delle cellule epiteliali delle vie aeree
    NOTA: il materiale CRC deve essere riscaldato a 37 °C collocandolo in un bagno d'acqua da laboratorio a temperatura controllata o in un dispositivo a bagno di perline prima di essere aggiunto alle celle.
    1. Controllare regolarmente le cellule sotto il microscopio per colture cellulari (lente obiettiva 4×) per l'attaccamento, la contaminazione, la morfologia e la confluenza.
    2. Cambia i supporti CRC ogni due giorni. Quando si osservano cellule riprogrammate (Figura 1) e non è presente alcuna contaminazione, ridurre o sospendere gli antibiotici.
    3. Quando le cellule raggiungono il 90% di confluenza, utilizzare un metodo32 a doppia tripsina per dissociare le cellule ed eseguire un conteggio delle cellule come descritto al punto 4.1.8 (fare riferimento al file supplementare 2 per la dissociazione e il congelamento delle cellule).

5. Semina e differenziamento di cellule epiteliali delle vie aeree e mantenimento di modelli differenziati di ALI

  1. Semina di cellule epiteliali delle vie aeree in inserti di supporto permeabili
    1. Trasferire gli inserti di supporto permeabili rivestiti in soluzione di collagene (sezione 1) dall'incubatore di CO2 all'armadio di biosicurezza. Aspirare la soluzione di collagene ed eliminarla. Aggiungere un mezzo di espansione da 750 μL (senza antibiotici) al compartimento basale degli inserti di supporto permeabili.
    2. Trasferire le cellule dissociate o le cellule scongelate sul ghiaccio nell'armadio di biosicurezza. Aggiungere il volume di mezzo di dilatazione necessario per seminare 200.000-250.000 cellule in 150 μL al compartimento apicale di ciascun inserto di supporto permeabile.
    3. Fare attenzione a non creare bolle; Mescolare bene per garantire che le cellule siano omogenee e in sospensione. Aggiungere 150 μL della sospensione cellulare sul lato apicale di ciascun inserto di supporto permeabile.
    4. Risospendere le cellule dopo aver seminato ogni tre inserti di supporto permeabili per mantenere una sospensione cellulare omogenea.
    5. Ogni due giorni fino a quando non si forma un monostrato a cellule confluenti (di solito entro il giorno 4 dopo la semina), scartare il mezzo e aggiungere un nuovo mezzo di espansione riscaldato a temperatura ambiente (RT, 15-25 °C).
  2. Differenziazione delle cellule epiteliali delle vie aeree all'interfaccia aria-liquido
    1. Terreni ALI caldi (senza antibiotici) a RT (15-25 °C).
    2. Rimuovere il mezzo di dilatazione e passare al mezzo di differenziazione (ALI) su entrambi i compartimenti apicale e basale.
    3. Dopo 2 giorni di coltura in terreni ALI sommersi, aspirare e scartare i media.
    4. Aggiungere 750 μL di fluido ALI al compartimento basale solo per creare un'interfaccia aria-liquido.
      NOTA: Se dopo 1 settimana di coltura, il monostrato non è confluente e si osservano ancora dei fori, le cellule potrebbero non avere più la capacità di espandersi nelle regioni vuote, considerare lo scarto delle cellule epiteliali delle vie aeree.
  3. Mantenimento del modello ALI differenziato e rimozione del muco
    1. Cambiare i mezzi apicali e basali ogni due giorni fino alla completa differenziazione (giorno 21-25 post-creazione dell'interfaccia aria-liquido).
    2. Una volta alla settimana, lavare il muco dal lato apicale seguendo i passaggi 5.3.3-5.3.4.
    3. PBS caldo a RT (15-25 °C).
    4. Aggiungere 200 μL di PBS al compartimento apicale. Incubare nell'incubatore CO2 per 10 min. Utilizzare un dispositivo di aspirazione o una pipetta per rimuovere il PBS.

6. Organoidi epiteliali tridimensionali delle vie aeree

  1. Preparati per la coltura di organoidi epiteliali delle vie aeree
    1. Collocare una o più piastre a 24 pozzetti in un incubatore a CO2 per riscaldarle a 37 °C durante la notte.
    2. Scongelare una fiala da 10 mL di ECM (Table of Materials) sul ghiaccio secondo le istruzioni del produttore. Preparare aliquote da 500 μL (uso una tantum) per ridurre al minimo il numero di cicli di congelamento-scongelamento.
      NOTA: Si raccomanda l'uso di ECM con concentrazione proteica >10,5 mg/ml per ottenere i migliori risultati di coltura. Una concentrazione inferiore accelererà la disintegrazione della cupola ECM e aumenterà la presenza di organoidi rivolti verso l'esterno.
    3. Utilizzare il kit organoidi delle vie aeree (tabella dei materiali) per preparare Airway Organoid Seeding Media (AOSM) e Differentiation Media (AODM) secondo le istruzioni del produttore.
    4. Preparare i mezzi basali organoidi delle vie aeree come da Tabella 2.
ComponenteVolume
DMEM/F-12 avanzato500 ml
HEPES5 ml
Alanil-glutammina5 ml
Penicillina-streptomicina5 ml

Tabella 2: Componenti dei mezzi basali organoidi delle vie aeree

  1. Utilizzare il numero di cellule epiteliali vive delle vie aeree dissociate nella sezione 4.2 per calcolare quanti pozzetti possono essere seminati con una densità di semina di 10.000 cellule (vedere Tabella 3).
  2. Calcolare il volume totale di ECM e AOSM necessario per creare 1 x 50 μL di cupola ECM al 90% (45 μL di ECM e 5 μL di AOSM) per pozzetto.
    NOTA: La densità di semina raccomandata di 10.000 cellule per pozzetto è per le cellule epiteliali nasali espanse con CRC nel passaggio 1. Le celle di passaggio successivo possono richiedere una maggiore densità di semina per ottenere la formazione dello stesso numero di organoidi.
Numero di pozziNumero di celleNumero di cupoleVol di Matrigel ECMVol di AOSM
110.000 cellule145 μL x 1,15 μL x 1,1
220.000 cellule290 μL x 1,110 μL x 1,1
550.000 cellule5225 μL x 1,125 μL x 1,1
.................. cellule..................μL x 1,1.........μL x 1,1

Tabella 3: Calcoli per la semina di cellule epiteliali delle vie aeree nelle cupole ECM

  1. Semina di cellule epiteliali delle vie aeree nelle cupole ECM
    NOTA: Mantenere l'ECM sul ghiaccio in ogni momento ed eseguire tutte le fasi che coinvolgono l'ECM sul ghiaccio, poiché l'ECM inizierà a solidificarsi a temperature >10 ° C.
    1. Risospendere le cellule epiteliali delle vie aeree dissociate nel paragrafo 4.2 con il volume calcolato del 90% di ECM come da Tabella 3.
    2. Tenendo la pipetta con un angolo di 90° (verticale) il più vicino possibile al fondo del pozzetto, erogare 50 μL (fino al primo stop per evitare di creare bolle) della sospensione della cella ECM al centro del pozzetto. Evitare di toccare il muro del pozzo.
    3. Incubare la piastra a 37 °C per 20 minuti fino a quando l'ECM non si solidifica. Mentre l'ECM si sta solidificando, riscaldare AOSM a RT (15-25 °C) per evitare che causi la ri-liquefazione e la disintegrazione della cupola ECM dopo l'aggiunta.
    4. Aggiungere 500 μL di AOSM riscaldato a ciascun pozzetto erogando lungo la parete del pozzetto. Non pipettare i fluidi direttamente sulla cupola ECM.
    5. Cambiare il supporto ogni 2 giorni per 4-7 giorni. Per aspirare il fluido, inclinare la piastra con un angolo di 45° e aspirare dal bordo inferiore del pozzo lontano dalla cupola ECM.
    6. Dopo 4-7 giorni, iniziare la differenziazione organoide aggiungendo 500 μL di AODM (15-25 °C) a ciascun pozzetto e cambiare terreno ogni 2 giorni per 7 giorni.
  2. Riplaccatura degli organoidi epiteliali delle vie aeree al Giorno 7 della differenziazione
    NOTA: La riplaccatura degli organoidi epiteliali delle vie aeree è necessaria perché il bordo delle cupole ECM si disintegra gradualmente durante il periodo di coltura di 2 settimane. Gli organoidi epiteliali delle vie aeree sul bordo della cupola possono essere persi (spostati nei media) o avere un orientamento apicale rivolto verso l'esterno quando non completamente incorporati nella ECM. La fase di riplaccatura "pulisce" anche la cupola ECM rimuovendo cellule / detriti che non formano con successo organoidi.
    1. Aspirare il supporto da ciascun pozzetto. Aggiungere 500 μL di mezzi basali organoidi delle vie aeree fredde (d'ora in poi denominati mezzi basali) a ciascun pozzetto.
    2. Utilizzare la pipetta P1000 poiché questa punta della pipetta ha l'orifizio più grande e riduce la probabilità di scoppio di organoidi durante il pipettaggio. Regolare la pipetta a 350 μL per evitare di creare bolle, quindi pipettare delicatamente su e giù per interrompere la cupola ECM in ciascun pozzetto. Raccogliere tutti i mezzi ECM/basali in una provetta da centrifuga da 15 ml.
    3. Risciacquare abbondantemente con 500 μL di mezzo basale freddo. Raccogliere i mezzi basali contenenti eventuali ECM e organoidi rimanenti nella stessa provetta da centrifuga da 15 mL di cui sopra.
    4. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Dei tre strati visibili dopo la centrifugazione - (1) surnatante, (2) ECM contenente detriti cellulari (soffici) e (3) pellet contenente organoidi - scartare lo strato di surnatante e ECM e preservare il pellet organoide.
    5. Aggiungere 1 mL di mezzo basale freddo al pellet organoide e pipettare delicatamente su e giù per separare eventuali residui di ECM. Aggiungere 6 ml di mezzo basale freddo al tubo e mescolare delicatamente.
    6. Centrifugare a 300 × g per 5 min a 4 °C. Scartare il surnatante.
    7. Se l'ECM in eccesso è ancora visibile, ripetere i passaggi 6.3.5-6.3.6 per eseguire un altro lavaggio.
    8. Risospendere il pellet organoide con un volume appropriato di ECM al 90% (utilizzare AODM anziché AOSM) per placcare ~ 30 organoidi per 50 μL della cupola.
    9. Controllare la densità degli organoidi al microscopio per colture cellulari (lente obiettivo 4x) dopo aver placcato la prima cupola. Se troppo denso, aggiungere un ulteriore 90% ECM per ottenere la densità desiderata di ~ 30 organoidi.
    10. Seguire i passaggi 6.2.3- 6.2.4 per solidificare la ECM e alimentare le cellule ogni due giorni con 500 μL di AODM riscaldato in ciascun pozzetto per altri 14 giorni fino a raggiungere la maturità (dopo 21 giorni di differenziazione) con formazione di lume circondato da epitelio pseudostratificato rivolto verso l'interno contenente cellule basali, cellule ciliate e cellule caliciformi.
      NOTA: Gli organoidi epiteliali delle vie aeree qui descritti sono differenziati terminalmente e non possono essere fatti passare o crioconservati.

7. Imaging della frequenza del battito delle ciglia

NOTA: questa sezione del protocollo richiede un microscopio di imaging a cellule vive con una camera ambientale di riscaldamento e umidità, una fotocamera scientifica con frame rate rapido (>100 Hz), un obiettivo a lunga distanza di lavoro 20x e un software di imaging (fare riferimento alla Tabella dei materiali per le apparecchiature consigliate utilizzate in questo protocollo).

  1. Configurazione del microscopio
    1. Assicurarsi che il sistema di riscaldamento del microscopio sia acceso e bilanciato a 37 °C. Accendi il microscopio. Regolare il gas al 5% di CO 2 tramite il miscelatore di gas CO2/aria.
    2. Rabboccare la bottiglia del modulo di umidità che la CO2 attraversa con acqua purificata. Impostare l'umidità relativa all'85% tramite il controller superiore dello stadio in modo che l'acqua venga riscaldata e le celle siano alimentate con aria umidificata. Equilibrare la camera per 30 min.
    3. Posizionare l'inserto della piastra del microscopio nel supporto del microscopio.
    4. Trasferire i modelli di cellule epiteliali delle vie aeree dall'incubatore al microscopio su un blocco termico o sfere termiche equilibrate a 37 °C per mantenere il campione a una temperatura fisiologica.
    5. Posizionare la piastra di coltura contenente i modelli di cellule epiteliali delle vie aeree nell'inserto della piastra del microscopio. Chiudere la camera ambientale del microscopio.
    6. Lasciare equilibrare il campione nella camera del microscopio preriscaldata a 37 °C, riempita al 5% di CO2 per 30 minuti.
      NOTA: un tempo di equilibrio più breve può essere sufficiente. Questo può essere determinato eseguendo un esperimento per identificare il tempo necessario per la stabilizzazione del CBF (fare riferimento alla Figura 3).

figure-protocol-2
Figura 3: Stabilizzazione della frequenza del battito ciliare nel microscopio di imaging a cellule vive. Grafici a punti della frequenza media di battimento delle ciglia (CBF) nelle cellule epiteliali delle vie aeree all'interfaccia aria-liquido (modelli ALI) dopo il trasferimento in un microscopio di imaging a cellule vive con una camera ambientale. La camera è stata equilibrata e mantenuta a 37 °C, 5% di CO2 e umidità relativa dell'85% per 30 minuti prima di aprire lo sportello della camera e posizionare la piastra di coltura nell'inserto della piastra del microscopio. I modelli cellulari sono stati ripresi per 60 minuti a intervalli indicati. I modelli ALI sono stati derivati da due partecipanti con CF. Sono state acquisite sei immagini del campo visivo (FOV) per modello ALI. Ogni punto (blu) rappresenta la media CBF in 12-36 immagini FOV. I dati sono rappresentati come media ± SEM, con media collegata da una linea tratteggiata. L'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) è stata utilizzata per determinare le differenze statistiche. P < 0.0001, ns: nessuna significatività. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

  1. Durante il periodo di equilibrio, al computer, aprire il software di acquisizione. Selezionare l'obiettivo a lunga distanza di lavoro 20x.
  2. All'oculare del microscopio, concentrarsi sul modello cellulare (~Z = 8000 μm).
  3. Assicurarsi che il microscopio sia impostato per l'illuminazione Kohler in modo che i filamenti della lampadina della sorgente luminosa di trasmissione non siano focalizzati sul piano del campione, evitando artefatti nell'imaging. Per questo seguire i passaggi 7.1.10-7.1.13
  4. Chiudere completamente il diaframma del diaframma del diaframma del campo sopra il condensatore. Aprire lentamente il diaframma del diaframma del diaframma del campo e spostare il condensatore verso l'alto / verso il basso fino a quando non appare una forma ottagonale.
  5. Se il diaframma del diaframma del diaframma di campo non è allineato (cioè, l'ottagono non è al centro del campo visivo (FOV)), allinearlo al centro usando i tasti a brugola.
  6. Una volta allineato il diaframma del diaframma del diaframma di campo, regolare la messa a fuoco del condensatore per mettere a fuoco l'ottagono.
  7. Aprire il diaframma dell'iride di campo fino a quando non può più essere visto all'interno del FOV.
  8. Utilizzando il software di acquisizione, fare clic su L100 per commutare il percorso della luce sulla porta in cui è montata la telecamera. Fare clic sul pulsante verde play (Esegui) per visualizzare il FOV del microscopio tramite il software. Controllare che le ciglia siano a fuoco e regolare se necessario.
  9. Utilizzando il software di acquisizione, impostare il microscopio con le seguenti impostazioni: Filtri: vuoto; Condensatore: vuoto; Formato: no binning; Tempo di esposizione: 0,003 s; Modalità di lettura: rolling shutter; ROI: 512 × 512 pixel.
    NOTA: il tempo di esposizione si basa sulla frequenza più alta che deve essere misurata poiché 1/tempo di esposizione deve essere almeno il doppio di questa frequenza. Ad esempio, se l'intervallo fisiologico massimo di battito delle ciglia = 30 Hz, allora 1/tempo di esposizione = 60 e il tempo di esposizione deve essere ≤ 0,016 s. Il ROI dipende dalle specifiche del frame rate della fotocamera. Seleziona un ROI che acquisisca frame rate >100 Hz.
  1. Acquisizione di immagini
    1. Per acquisire immagini time-lapse dal menu, fare clic su Acquisisci e quindi fare clic su Fast Time Lapse. Nella finestra popup, selezionare un percorso di salvataggio e un nome file. Acquisisci 1000 fotogrammi.
    2. Fare clic su Applica. Fare clic sul pulsante verde play (Esegui) per visualizzare in anteprima le ciglia nel FOV del microscopio e regolare la messa a fuoco Z se necessario. Fare clic su Esegui ora per acquisire il time-lapse veloce.
    3. Una volta catturato il time-lapse veloce, fare clic sul pulsante verde di riproduzione (Esegui) per visualizzare il FOV del microscopio. Utilizzando il joystick del microscopio, spostarsi lungo l'asse X/Y verso un altro FOV.
    4. Regolare la messa a fuoco Z per mettere a fuoco le ciglia. Fai clic su Esegui ora per catturare un altro time-lapse veloce.
    5. Ripetere i passaggi 7.2.3-7.2.4. Per i modelli ALI e gli organoidi delle vie aeree, immagine 6x FOV in ciascuno dei 3 campioni replicati. Per i fogli epiteliali delle vie aeree, immagine di almeno 4 immagini replicate per partecipante.

8. Analisi dei dati e quantificazione del CBF

  1. Preparativi per l'analisi dei dati
    NOTA: questa sezione del protocollo richiede script di analisi personalizzati (file supplementare 3), file di immagini raw (acquisiti nella sezione 7.2), un software di elaborazione e un software di analisi.
    1. Installare il software informatico, preferibilmente la versione più recente, sul computer di analisi. Assicurarsi che siano installati toolbox software di elaborazione standard (elmat, ops, datafun, uitools, datatypes, iofun, iotools, audiovideo) e toolbox di elaborazione di immagini e segnali.
    2. Copiare gli script di analisi personalizzati 'BeatingCiliaBatchOMEfiles_JOVE.m' e 'LoadRawDataExportFilteredMovies_JOVE.m' e 'support scripts' nell'unità locale del computer.
    3. Nel software informatico, fare clic sulla scheda Home. Quindi fare clic su Imposta percorso (Figura 4A-B).
    4. Nella finestra pop-up, fare clic su Aggiungi con sottocartelle (Figura 4C). In 'Percorso di ricerca MATLAB', selezionare le cartelle mostrate in Figura 4D, quindi fare clic su Salva e chiudi (Figura 4E-F).
    5. Verificare che gli script di analisi siano collegati al software di elaborazione controllando che appaiano nel pannello di sinistra (Figura 4G).
    6. Trasferire i file di immagine raw (formato ambiente di microscopia aperta (OME)) acquisiti nella sezione 7.2 sull'unità locale del computer.
      NOTA: è possibile accedere ai file di immagine raw di esempio all'indirizzo: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.16649878.v1.

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Figura 4: Configurazione del software di elaborazione per l'analisi dei dati. (A) Aprire la scheda Home . (B) Selezionare Imposta percorso. (C) Selezionare Aggiungi con sottocartelle. (D) Selezionare le cartelle contenenti gli script di analisi. (E) Selezionare Salva. (f) Selezionare Chiudi. (G) Gli script di analisi appariranno nel pannello di sinistra. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

  1. Quantificazione del CBF mediante rilevazione del picco dello spettro di intensità dei singoli pixel
    1. Aprire il software informatico. Fare clic sul file di script di analisi 'BeatingCiliaBatchOMEfiles_JOVE.m' (Figura 5A).
    2. Fare clic sulla scheda Editor e quindi fare clic sul pulsante verde di riproduzione (Esegui) per eseguire lo script (Figura 5B-C). Nella finestra del prompt, selezionare i file di immagine raw da analizzare (Figura 5D).
    3. Immettere il tempo di esposizione dal punto 7.1.15 nella finestra del prompt per il tempo di acquisizione per fotogramma, quindi fare clic su OK (Figura 5E).
    4. Attendere ~ 15 minuti per file mentre lo script calcola e restituisce il CBF nel file 'AveSpectrum' (file supplementare 4), che viene automaticamente salvato nella stessa cartella dei file di immagine raw. Visualizzare l'avanzamento tramite la barra di avanzamento (Figura 5F).

figure-protocol-4
Figura 5: Esecuzione di script di analisi mediante software informatico. (A) Aprire lo script per l'analisi di CBF ('BeatingCiliaBatchOMEfiles_JOVE.m') o la creazione di un filmato di battitura delle ciglia ('LoadRawDataExportFilteredMovies_JOVE.m'). (B) Aprire la scheda Editor. (C) Selezionare il pulsante verde di riproduzione (Esegui) per eseguire lo script di analisi. (D) Una finestra di prompt richiederà la selezione dei file per l'analisi o la creazione di filmati. (E) Durante l'esecuzione dello script 'BeatingCiliaBatchOMEfiles_JOVE.m', verrà visualizzato un prompt per inserire manualmente il tempo di acquisizione per fotogramma (i) nel caso in cui lo script di lettura dei file non legga correttamente i metadati. (F) Barra di avanzamento che indica la frequenza del battito delle ciglia calcolata. (G) Durante l'esecuzione dello script 'LoadRawDataExportFilteredMovies_JOVE.m', verrà visualizzato un prompt per inserire manualmente il tipo di filmato da produrre (mp4 o avi), il frame rate del filmato (fps), se il componente immobile viene rimosso dai dati del filmato ('y' o 'n'), il tempo fotogramma (s) e la dimensione dei pixel (micron) dei dati esportati nel filmato. Si consiglia di utilizzare 'y' per il filtraggio immobile in quanto rimuoverà il muco o qualsiasi altro strato immobile che ostruisce i dati. (H) Barra di avanzamento per indicare il filmato in esportazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

  1. Eseguire lo script 'GetFirstAmplitude.m' sulla cartella che contiene i file 'AveSpectrum' utilizzando il processo nei passaggi 8.2.1-8.2.2. Attendi che lo script produca il file 'FirstAmplitudeStacked.xlsx', che contiene la frequenza che ha la massima ampiezza e rientra nell'intervallo fisiologico del battito delle ciglia dell'epitelio delle vie aeree, ≥3 e <30 Hz.
  2. Copiare i valori di frequenza dal file 'FirstAmplitudeStacked.xlsx' e tracciare utilizzando un software di analisi scientifica.
    NOTA: una spiegazione di come lo script di analisi personalizzato quantifica CBF è fornita nel file supplementare 5. È possibile accedere ai set di dati analizzati di esempio all'indirizzo: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.16649815.
  1. Esportazione di un video di ciglia che battono
    1. Aprire il software informatico. Fare clic sul file di script 'LoadRawDataExportFilteredMovies_JOVE.m' (Figura 5A) per caricare lo script.
    2. Fare clic sulla scheda Editor e quindi fare clic sul pulsante verde di riproduzione (Esegui) per eseguire lo script (Figura 5C). Nella finestra del prompt, selezionare i file di immagine raw da esportare in file filmato (Figura 5D).
    3. Inserire le impostazioni dettagliate nella Tabella 4 nella finestra pop-up "Crea filmato" (Figura 5G).
    4. Attendere ~ 8 minuti per file mentre lo script crea i file del filmato e li restituisce nella posizione dei file di immagine raw. Visualizza l'avanzamento tramite la barra di avanzamento (Figura 5H).
Ingressi filmatiDescrizione
Tipo di fileInserisci il tipo di file che desideri esportare (mp4 o avi).
Frequenza fotogrammiImmettere la frequenza fotogrammi alla quale il filmato deve essere esportato. Se hai acquisito ~ 1000 fotogrammi per serie temporale, si consiglia di impostare la frequenza fotogrammi ~ 30 fps.
Filtraggio immobileLe opzioni sono 'y' o 'n'. Il valore predefinito è 'y' e lo script di filtraggio temporale rimuove, utilizzando lo spazio di Fourier, tutti i componenti immobili dai dati del filmato. Tipicamente, qualsiasi strato di cellule sotto le ciglia o il muco immobile contribuirà a una componente di offset a frequenza zero o una componente invariante nel tempo nel segnale che può essere filtrato.
Tempo di acquisizione per fotogrammaIl tempo di acquisizione per frame dei dati acquisiti. Viene utilizzato per visualizzare un timestamp nel filmato in pochi secondi.
Dimensione pixelLa dimensione in pixel in micrometri viene utilizzata per visualizzare una barra di scala nel filmato in micrometri.

Tabella 4: impostazioni di input per la creazione di filmati

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Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Per dimostrare l'efficienza di questo protocollo nella quantificazione del CBF, vengono presentati i risultati del CBF misurati in modelli ALI di cellule epiteliali delle vie aeree derivati da tre partecipanti con FC e tre partecipanti sani di controllo. Il giorno 14 della differenziazione della cultura, erano presenti ciglia battenti (Figura 6). Dal giorno 14 al 21 della differenziazione della cultura, è stato osservato un aumento statisticamente significativo (P < 0,0345) del CBF all'in...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ci sono molteplici fattori che potrebbero oscurare la quantificazione del CBF nei fogli epiteliali nasali. I fogli epiteliali devono essere visualizzati entro 3-9 ore dalla raccolta del campione poiché la funzione ciliare è più stabile durante questo periodo37. Meno globuli rossi e detriti sono più ottimali per l'imaging poiché interferiscono con l'acquisizione dei dati. Quando si seleziona un ROI per l'imaging, è importante selezionare un foglio epiteliale che non sia stato danneggiato o interrot...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo i partecipanti allo studio e le loro famiglie per i loro contributi. Apprezziamo l'assistenza del dipartimento respiratorio di Randwick del Sydney Children's Hospitals (SCH) nell'organizzazione e nella raccolta di campioni biologici dei pazienti - un ringraziamento speciale al Dr. John Widger, alla dottoressa Yvonne Belessis, Leanne Plush, Amanda Thompson e Rhonda Bell. Riconosciamo l'assistenza di Iveta Slapetova e Renee Whan della Katharina Gaus Light Microscopy Facility all'interno del Mark Wainwright Analytical Centre presso UNSW Sydney. Questo lavoro è supportato dal National Health and Medical Research Council (NHMRC) Australia (GNT1188987), CF Foundation Australia e Sydney Children's Hospital Foundation. Gli autori desiderano riconoscere Luminesce Alliance - Innovation for Children's Health per il suo contributo e supporto. Luminesce Alliance - Innovation for Children's Health è una joint venture cooperativa senza scopo di lucro tra il Sydney Children's Hospitals Network, il Children's Medical Research Institute e il Children's Cancer Institute. È stato istituito con il supporto del governo del NSW per coordinare e integrare la ricerca pediatrica. Luminesce Alliance è anche affiliata con l'Università di Sydney e l'Università del New South Wales Sydney. KMA è supportata da una borsa di studio del programma di formazione per la ricerca del governo australiano. LKF è sostenuta dal Rotary Club di Sydney Cove/Sydney Children's Hospital Foundation e dalle borse di studio post-laurea dell'UNSW University.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AdeninaSigma-AldrichA278610 mg/mL
Advanced DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific12634-010
Alanil-glutamminaSigma-AldrichG8541200 mM
Andor Zyla 4.2 sCMOSOxford Instruments Fotocamerascientifica con frame rate elevato (>100 Hz)
Sistema di filtri sottovuoto per flaconiSigma-Aldrich
Ceftazidima idratoSigma-AldrichA698750 mg/mL
Microscopio per colture cellulariOlympusCKX53
CFI S Plan Fluor ELWD 20XCNikon Instruments Inc.MRH08230Obiettivo a lunga distanza di lavoro. NA0.45 WD 8.2-6.9
Tossina del coleraSigma-AldrichC8052-1MG200 µ g/mL
Filtro per gel Corning 40 UMSigma-AldrichCLS431750Dimensione dei pori 40 μ m
Corning Matrigel Matrix (senza rosso fenolo)Corning356231Matrice extracellulare (ECM)
Corning sistema di filtraggio sottovuoto per flaconiSigma-AldrichCLS431098
Corning CoolCell LX Cell Freezing ContainerSigma-AldrichCLS432002
Corning Transwell inserti per colture cellulari con membrana in poliestereSigma-AldrichCLS3470Inserti di supporto permeabili. Pozzetto da 6,5 mm con 0,4 μ Inserto in membrana poliestere a poro M.
Countess Conta Cellule Conta VetriniThermo Fisher ScientificC10228
Countess II Contatore Cellulare AutomatizzatoThermoFisher ScientificAMQAX1000Contatore Cellulare Automatico
SpazzoleCitologia McFarlane Medical33009
DMEM/F12-HamThermo Fisher Scientific11330032
DMEM/F12-HamThermo Fisher Scientific11330032
DMEM-Alto glucosioThermo Fisher Scientific11965-092
Dulbecco′ s Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Sigma-AldrichD8537
Eclipse Ti2-E.
Siero fetale bovino, certificato, inattivato a caldo, Stati UnitiThermo Fisher Scientific10082147
Fungizone (Amfotericina B)Thermo Fisher Scientific15290018250 µ g/mL
Soluzione di gentamicinaSigma-AldrichG139750 mg/mL
Graphpad PrismSoftwaredi analisi scientifica
Greiner Cryo.s FialeSigma-AldrichV3135Fiale criogeniche
Soluzione HEPES Sigma-AldrichH08871 M
HI-FBSThermo Fisher Scientific10082-147
IdrocortisoneSigma-AldrichH08883,6 mg/mL
Incubatore NL Ti2 BLACK 2000PeConCamera climatica per microscopio. Consente l'incubazione con aria calda e la gassificazione locale di CO2 e O2
InsulinaSigma-AldrichI26432 mg/mL
Lab Armor 74220 706 Bagno di perline senz'acqua 6LJohn Morris Group74220 706Bagno di perline
Lab Armor BeadsThermo Fisher ScientificA1254302Perle termiche
MATLABMathWorksSoftware
di calcolo Microsoft Excelfogli di calcoloMicroscoft
NIH/3T3Collezione di colture di tipo americanoCRL-1658Cellule di alimentazione embrionale di topo NIH-3T3 irradiate
NIS-Elements ARNikon Instruments Inc.Software di acquisizione immagini
Penicillina-StreptomicinaSigma-AldrichP433310.000 unità penicillina e 10  mg di streptomicina/mL
Dulbecco′ s Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Sigma-AldrichD8537
PneumaKit di organoidi per le vie aeree Cultorganoidi per le vie aereeStemCell Technologies5060
PneumaCult-ALIMedium Stem Cell Technologies5001
PneumaCult-Ex Plus MediumStem Cell Technologies5040
PureCol-SAdvanced BioMatrix5015Tipo I Soluzione di collagene
ReagentPack Reagenti per sottocolturaLonzaCC-5034
rhEGF (Epidermal Growth Factor, human)Sigma-AldrichE964425 &; g/mL
Y-27632 2HCl (inibitore ROCK)SelleckchemS104910 mM
TobramicinaSigma-AldrichT4014100 mg/mL
Soluzione di tripano bluSigma-AldrichT81540,4%
UNO Stage Top IncubatorOkolabIncubatore per microscopio. Consente il condizionamento di temperatura, umidità e CO2
CLS431098Microscopio per imaging di cellule vive Software per Kit di

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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