Method Article

Generazione di organoidi cardiaci umani auto-assemblanti derivati da cellule staminali pluripotenti

DOI:

10.3791/63097

⸱

September 15th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Division of Developmental and Stem Cell Biology, Michigan State University, 2Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, Michigan State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, descriviamo un protocollo per creare organoidi cardiaci umani rilevanti per lo sviluppo (hHO) in modo efficiente utilizzando cellule staminali pluripotenti umane mediante auto-organizzazione. Il protocollo si basa sull'attivazione sequenziale dei segnali di sviluppo e produce tessuti cardiaci umani altamente complessi e funzionalmente rilevanti.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La capacità di studiare lo sviluppo cardiaco umano in salute e malattia è fortemente limitata dalla capacità di modellare la complessità del cuore umano in vitro. Lo sviluppo di piattaforme simili a organi più efficienti in grado di modellare fenotipi complessi in vivo , come organoidi e organi su chip, migliorerà la capacità di studiare lo sviluppo e le malattie del cuore umano. Questo documento descrive un protocollo per generare organoidi cardiaci umani (hHO) altamente complessi mediante auto-organizzazione utilizzando cellule staminali pluripotenti umane e attivazione graduale del percorso di sviluppo utilizzando inibitori di piccole molecole. I corpi embrioidi (EB) sono generati in una piastra a 96 pozzetti con fondo tondo e pozzi di attacco ultra-bassi, facilitando la coltura in sospensione di costrutti individualizzati.

Gli EB subiscono la differenziazione in hHO mediante una strategia di modulazione del segnale Wnt in tre fasi, che prevede un'attivazione iniziale della via Wnt per indurre il destino del mesoderma cardiaco, una seconda fase di inibizione Wnt per creare linee cardiache definitive e una terza fase di attivazione Wnt per indurre tessuti d'organo proepiardici. Questi passaggi, eseguiti in un formato a 96 pozzetti, sono altamente efficienti, riproducibili e producono grandi quantità di organoidi per corsa. L'analisi mediante imaging a immunofluorescenza dal giorno 3 al giorno 11 della differenziazione rivela le specifiche del primo e del secondo campo cardiaco e tessuti altamente complessi all'interno degli hHO al giorno 15, incluso il tessuto miocardico con regioni di cardiomiociti atriali e ventricolari, nonché camere interne rivestite di tessuto endocardico. Gli organoidi presentano anche un'intricata rete vascolare in tutta la struttura e un rivestimento esterno di tessuto epicardico. Da un punto di vista funzionale, gli hHO battono in modo robusto e presentano una normale attività del calcio come determinato dall'imaging dal vivo Fluo-4. Nel complesso, questo protocollo costituisce una solida piattaforma per studi in vitro in tessuti cardiaci simili a organi umani.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I difetti cardiaci congeniti (CHD) sono il tipo più comune di difetto congenito nell'uomo e colpiscono circa l'1% di tutti i nati vivi1,2,3. Nella maggior parte dei casi, le ragioni dei CHD rimangono sconosciute. La capacità di creare modelli di cuore umano in laboratorio che assomigliano molto al cuore umano in via di sviluppo costituisce un significativo passo avanti per studiare direttamente le cause alla base dei CHD negli esseri umani piuttosto che in modelli animali surrogati.

L'epitome dei modelli tissutali cresciuti in laboratorio sono gli organoidi, costrutti cellulari 3D che assomigliano a un organo di interesse per la composizione cellulare e la funzione fisiologica. Gli organoidi sono spesso derivati da cellule staminali o cellule progenitrici e sono stati utilizzati con successo per modellare molti organi come il cervello4,5, il rene6,7, l'intestino8,9, il polmone10,11, il fegato12,13 e il pancreas14,15 , solo per citarne alcuni. Recenti studi sono emersi dimostrando la fattibilità della creazione di organoidi cardiaci auto-assemblanti per studiare lo sviluppo del cuore in vitro. Questi modelli includono l'utilizzo di cellule staminali embrionali di topo (mESC) per modellare lo sviluppo cardiaco precoce16,17 fino alla specifica atrioventricolare18 e cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) per generare organoidi cardiaco-endodermici multi-strato germinale19 e cardioidi camerati20 con composizione cellulare altamente complessa.

Questo documento presenta un nuovo protocollo di modulazione WNT in 3 fasi per generare hHO altamente complessi in modo efficiente ed economico. Gli organoidi sono generati in piastre a 96 pozzetti, risultando in un sistema scalabile e ad alta produttività che può essere facilmente automatizzato. Questo metodo si basa sulla creazione di aggregati hPSC e sull'innesco di fasi di sviluppo della cardiogenesi, tra cui la formazione di mesoderma e mesoderma cardiaco, la specifica del primo e del secondo campo cardiaco, la formazione di organi proepiardici e la specifica atrioventricolare. Dopo 15 giorni di differenziazione, gli hHO contengono tutte le principali linee cellulari presenti nel cuore, camere interne ben definite, camere atriali e ventricolari e una rete vascolare in tutto l'organoide. Questo sistema organoide cardiaco altamente sofisticato e riproducibile è in grado di studiare analisi strutturali, funzionali, molecolari e trascrittomiche nello studio dello sviluppo cardiaco e delle malattie e dello screening farmacologico.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Coltura e manutenzione hPSC

NOTA: Le PSC indotte dall'uomo (hiPSC) o le cellule staminali embrionali umane (hESC) devono essere coltivate per almeno 2 passaggi consecutivi dopo lo scongelamento prima di essere utilizzate per generare EB per differenziazione o ulteriore crioconservazione. Le hPSC sono coltivate in terreno PSC (vedi tabella dei materiali) su piastre di coltura a 6 pozzetti rivestite con membrana basale (BM-ECM). Quando si eseguono cambiamenti del mezzo sulle hPSC in piastre a 6 pozzetti, aggiungere il mezzo direttamente sul lato interno del pozzo piuttosto che direttamente sopra le cellule per evitare il distacco o lo stress cellulare indesiderato. Gli utenti dovrebbero diffidare dei supporti PSC pre-riscaldamento che non dovrebbero essere riscaldati a 37 ° C; tutti i supporti PSC utilizzati in questo protocollo erano termostabili.

  1. Per rivestire le piastre del pozzo con il BM-ECM, scongelare un'aliquota del BM-ECM (conservato a -20 °C secondo le istruzioni del produttore) sul ghiaccio e mescolare 0,5 mg del BM-ECM con 12 ml di mezzo eagle modificato (DMEM)/F12 di Dulbecco freddo (conservato a 4 °C). Distribuire 2 mL della miscela DMEM/F12-BM-ECM su ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e incubare a 37 °C per almeno 2 ore.
  2. Per scongelare le cellule, in primo luogo, scongelare il crioviale hPSC in un tallone a 37 ° C o a bagnomaria per 1-2 minuti fino a quando non è visibile solo una piccola quantità di ghiaccio. Trasferire le cellule scongelate in un tubo di centrifuga e aggiungere lentamente 8-9 mL del mezzo PSC integrato con 2 μM dell'inibitore ROCK, tiazovivina (Thiaz), e centrifugare a 300 × g per 5 minuti. Rimuovere il surnatante e risospescere il pellet cellulare nel mezzo PSC integrato con 2 μM di Thiaz. Distribuire le cellule nel terreno di coltura in 1-2 pozzetti a seconda della concentrazione e della coltura crioviale a 37 °C, 5% CO2 per 24 ore prima di cambiare il mezzo PSC.
  3. Cambiare il mezzo sulle celle a intervalli di 48 ore. Eseguire lavaggi e cambi di mezzo utilizzando dmEM/F12 (1 mL/pozzetto) e il mezzo PSC (2 ml/pozzetto), rispettivamente.
    NOTA: i lavaggi aiutano a rimuovere i rifiuti cellulari e i detriti, mentre i cambiamenti dei mezzi freschi forniscono alle cellule una rinnovata fonte di sostanze nutritive.
  4. Passare le cellule al subunondanza (60-80% confluente) aspirando il mezzo, quindi lavando ciascun pozzetto con 1 mL di 1x soluzione tamponata con fosfato di Dulbecco (senza calcio, senza magnesio; DPBS). Aspirare il DPBS e aggiungere 1 mL del reagente di dissociazione per le hPSC (vedere la tabella dei materiali), seguito dall'aspirazione di tutti tranne un film sottile del reagente dopo 10 s.
  5. Incubare per 2-5 minuti con il film sottile del reagente di dissociazione per hPSC fino a quando non si formano spazi tra le cellule.
    NOTA: il tempo per interrompere la dissociazione dipende dalla linea cellulare.
  6. Aggiungere 1 mL del mezzo PSC integrato con 2 μM di Thiaz (PSC medium + Thiaz) al pozzo e picchiettare delicatamente la piastra per indurre il distacco cellulare. Pipettare le cellule staccate nel mezzo 1-2 volte per rompere eventuali colonie di grandi dimensioni e risospese le cellule in mezzo PSC + Thiaz in un rapporto pozzo 1: 6 (cellule da 1 pozzo risospese in 12 ml di terreno di coltura). Riplazionare le cellule su pozzetti rivestiti di BM-ECM.

2. Generazione di organoidi cardiaci umani autoassemblanti 3D

  1. Formazione del corpo embrionale (EB):
    NOTA: È imperativo limitare le cellule differenziate osservabili prima della formazione del corpo embrioide. Due o tre pozzetti di una piastra a 6 pozzetti con una confluenza del 60-80% produrranno abbastanza cellule per una singola piastra di organoidi da 96 pozzetti. Tutti i fluidi devono essere aliquotati e riscaldati a 37 °C a bagnomaria prima di qualsiasi cambiamento del mezzo per ridurre al minimo lo shock termico degli EB o degli organoidi (questo non include i reagenti di dissociazione cellulare). Vedere la Figura 1A,B.
    1. Giorno -2
      1. Per creare EB, il giorno -2, lavare hPSC sub-confluenti (60-80% confluenti) con DPBS per almeno 10 s per lavare eventuali detriti cellulari e aspirare il DPBS.
      2. Per staccare le cellule e rilasciarle in uno stato a cella singola, aggiungere 1 mL di reagente di dissociazione cellulare a temperatura ambiente (vedere la Tabella dei materiali) a ciascun pozzetto per 3-6 minuti. Picchiettare delicatamente la piastra ~ 5 volte al minuto per indurre il distacco durante il controllo al microscopio. Aggiungere 1 mL di PSC medium+Thiaz per fermare la reazione.
      3. Per raccogliere le cellule e rompere eventuali aggregati rimanenti, pipettare il fluido su e giù nel pozzo 2-3 volte per generare una sospensione a cella singola. Trasferire la sospensione monocellulare in un tubo centrifuga e ruotare per 5 minuti a 300 × g.
      4. Per ottenere la concentrazione cellulare desiderata, scartare il surnatante e risospese le cellule in 1 mL di PSC medio + Thiaz. Contare le cellule usando un contatore cellulare o un emocitometro e diluire le cellule in mezzo PSC + Thiaz ad una concentrazione di 100.000 cellule / mL.
      5. Per distribuire le celle per la formazione di EB, utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 100 μL (10.000 celle) a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con attacco ultra-basso a fondo tondo. Centrifugare la piastra a 100 × g per 3 min e incubare per 24 ore a 37 °C, 5% CO2.
    2. Giorno -1
      1. Rimuovere con cautela 50 μL di terreno da ciascun pozzetto e aggiungere 200 μL di terreno PSC fresco riscaldato a 37 °C per ottenere un volume finale di 250 μL per pozzetto. Incubare le cellule per 24 ore a 37 °C, 5% CO2.
        NOTA: Rimuovere e aggiungere il mezzo con attenzione sul lato del pozzetto per evitare di disturbare gli EB nella parte inferiore del pozzo. A causa della natura delicata degli EB e della coltura di sospensione, è necessario lasciare un piccolo volume di liquido in ciascun pozzetto quando si cambia il mezzo per evitare di disturbare gli EB.
  2. Differenziazione dell'organoide del cuore umano (hHO):
    NOTA: tutti i supporti devono essere riscaldati a 37 °C a bagnomaria prima di qualsiasi cambio di supporto. Rimuovere e aggiungere il mezzo con attenzione sul lato del pozzetto per evitare di disturbare gli organoidi in via di sviluppo sul fondo del pozzo. I lavaggi non sono necessari tra i cambiamenti dei media per ridurre al minimo l'agitazione e consentire la graduale rimozione di inibitori e fattori di crescita. RPMI con supplemento B-27 al 2% (Table of Materials) è stato utilizzato in tutto il protocollo di differenziazione. Il supplemento di B-27 contiene insulina se non specificato (senza insulina nei giorni 0-5). Vedere la Figura 1C.
    1. Giorno 0
      1. Per avviare la differenziazione verso un lignaggio mesodermico, rimuovere 166 μL di mezzo da ciascun pozzetto (~2/3 del volume totale del pozzo) e aggiungere 166 μL di RPMI 1640 contenente integratore B-27 insulino-libero, 6 μM CHIR99021, 1.875 ng/mL proteina morfogenetica ossea 4 (BMP4) e 1,5 ng/mL Activin A per una concentrazione finale del pozzo di 4 μM CHIR99021, 1,25 ng/mL BMP4 e 1 ng/mL Activin A. Incubare per 24 ore a 37 °C, 5% CO2.
    2. Giorno 1
      1. Rimuovere 166 μL di mezzo da ciascun pozzetto e aggiungere 166 μL di RPMI 1640 fresco con integratore B-27 senza insulina. Incubare per 24 ore a 37 °C, 5% CO2.
    3. Giorno 2
      1. Per indurre la specifica del mesoderma cardiaco, rimuovere 166 μL di mezzo da ciascun pozzetto e aggiungere 166 μL di RPMI 1640 contenente integratore B-27 senza insulina e 3 μM Wnt-C59 per una concentrazione finale del pozzo di 2 μM Wnt-C59. Incubare per 48 ore a 37 °C, 5% CO2.
    4. Giorno 4
      1. Rimuovere 166 μL di mezzo da ciascun pozzetto e aggiungere 166 μL di RPMI 1640 fresco con integratore B-27 senza insulina. Incubare per 48 ore a 37 °C, 5% CO2.
    5. Giorno 6
      1. Rimuovere 166 μL di mezzo da ciascun pozzetto e aggiungere 166 μL di RPMI 1640 con supplemento B-27. Incubare per 24 ore a 37 °C, 5% CO2.
    6. Giorno 7
      1. Per indurre la differenziazione proepiardiale, rimuovere 166 μL di mezzo da ciascun pozzetto e aggiungere 166 μL di RPMI 1640 fresco contenente integratore B-27 e 3 μM CHIR99021 per una concentrazione finale del pozzo di 2 μM CHIR99021. Incubare per 1 ora a 37 °C, 5% CO2.
      2. Rimuovere 166 μL di mezzo da ciascun pozzetto e aggiungere 166 μL di RPMI 1640 fresco contenente supplemento B-27. Incubare per 48 ore a 37 °C, 5% CO2.
        NOTA: Si consiglia maggiore cautela in questo secondo cambio medio il giorno 7 poiché gli organoidi sono più inclini al movimento a causa dei cambiamenti dei media.
      3. Dal giorno 7 in poi fino alla raccolta o al trasferimento per analisi o sperimentazioni, eseguire cambi di mezzo ogni 48 ore rimuovendo 166 μL di terreno da ciascun pozzetto e aggiungere 166 μL di RPMI 1640 fresco contenente supplemento B-27.
        NOTA: gli organoidi sono pronti per l'analisi e la sperimentazione al giorno 15, a meno che le fasi di sviluppo precedenti non siano di interesse. Possono essere coltivati oltre il giorno 15 per esperimenti di coltura o maturazione a lungo termine.

3. Analisi organoide

  1. Trasferimento di organoidi interi (vivi o fissi)
    NOTA: per il trasferimento di organoidi vivi, assicurarsi che le punte delle pipette utilizzate siano sterili.
    1. Tagliare la punta di una punta della pipetta P200 a 5-10 mm dall'apertura della punta, con conseguente ampia apertura di ~ 2-3 mm di diametro.
    2. Inserire la punta direttamente nel pozzetto a fondo tondo contenente l'organoide in modo che la pipetta sia completamente verticale (perpendicolare alla piastra). Assicurarsi che lo stantuffo della pipetta sia già premuto completamente prima di inserire la punta nel mezzo.
    3. Rilasciare lentamente lo stantuffo della pipetta, occupando abbastanza mezzo (100-200 μL) per raccogliere l'organoide.
    4. Trasferire l'organoide in mezzo alla destinazione target (ad esempio, per il fissaggio, l'imaging dal vivo, la registrazione elettrofisiologica, la nuova coltura di piastre).
  2. Organoidi di fissaggio
    NOTA: il fissaggio e la colorazione degli organoidi possono essere eseguiti sia nella piastra di coltura a 96 pozzetti che nei tubi di microcentrifuga. La paraformaldeide (PFA) deve essere maneggiata solo in una cappa aspirante.
    1. Per la fissazione in tubi microcentrifuga, trasferire organoidi vivi in tubi separati con 1-8 organoidi per tubo.
      NOTA: Non superare gli 8 organoidi per tubo.
    2. Rimuovere con cura e scartare il più possibile il mezzo dal tubo senza toccare gli organoidi.
    3. Aggiungere il 4% di PFA a ciascun tubo o pozzetto (300-400 μL per tubo di microcentrifuga e 100-200 μL per pozzetto di una piastra da 96 pozzetti). Incubare a temperatura ambiente per 30-45 min.
      NOTA: i tempi di incubazione superiori a 1 ora possono richiedere passaggi di recupero dell'antigene e non sono raccomandati.
    4. Scartare in modo sicuro il PFA senza disturbare gli organoidi. Eseguire 3 lavaggi con DPBS integrato con 1,5 g/L di glicina (DPBS/Gly), utilizzando lo stesso volume utilizzato per il PFA al 4%, aspettando 5 minuti tra un lavaggio e l'altro. Rimuovere DPBS/Gly e procedere all'immunocolorazione o ad altre analisi o aggiungere DPBS e conservare a 4 °C per un uso futuro fino a 2 settimane.
      NOTA: la conservazione di organoidi fissi per più di 2 settimane può causare degradazione e contaminazione dei tessuti e non è raccomandata.
  3. Colorazione immunofluorescente a tutto monte
    1. Aggiungere 100 μL di soluzione di bloccante/permeabilizzazione (10% di siero d'asino normale + 0,5% di albumina sierica bovina (BSA) + 0,5% di Triton X-100 in 1x DPBS) a ciascun pozzetto o tubo contenente gli organoidi fissi. Incubare a temperatura ambiente durante la notte su uno shaker.
      NOTA: Non superare gli 8 organoidi per tubo.
    2. Rimuovere con cura e scartare il più possibile la soluzione bloccante senza toccare gli organoidi. Esegui 3 lavaggi con DPBS, aspettando 5 minuti tra un lavaggio e l'altro.
    3. Preparare la soluzione anticorpale primaria (1% di siero d'asino normale + 0,5% BSA + 0,5% Triton X-100 in 1x DPBS) con gli anticorpi primari desiderati alle concentrazioni raccomandate. Incubare a 4 °C per 24 ore su uno shaker.
    4. Rimuovere con attenzione ed eliminare il più possibile la soluzione anticorpale senza toccare gli organoidi. Esegui 3 lavaggi con DPBS, aspettando 5 minuti tra un lavaggio e l'altro.
    5. Preparare una soluzione anticorpale secondaria (1% di siero d'asino normale + 0,5% BSA + 0,5% Triton X-100 in 1x DPBS) con gli anticorpi secondari desiderati alle concentrazioni raccomandate. Se gli anticorpi sono marcati in modo fluorescente, incubare a 4 °C al buio (ad esempio, coperto da un foglio di alluminio) per 24 ore su uno shaker.
    6. Rimuovere con attenzione ed eliminare il più possibile la soluzione anticorpale senza toccare gli organoidi. Esegui 3 lavaggi con DPBS, aspettando 5 minuti tra un lavaggio e l'altro.
    7. Preparare vetrini con perline (90-300 μm di diametro) montate in un mezzo di montaggio (vedi tabella dei materiali) vicino ai bordi della slitta dove verrà posizionato il coperchio con gli organoidi.
      NOTA: Si consiglia di lasciare asciugare il mezzo di montaggio attorno alle perline prima di procedere; questo impedirà alle perline di muoversi. Vedere la Figura 2.
    8. Trasferire gli organoidi colorati utilizzando una punta di pipetta tagliata sul vetrino, tra le perline, assicurando la spaziatura per evitare il contatto tra gli organoidi una volta sul vetrino. Utilizzare l'angolo di una salvietta da laboratorio arrotolata per rimuovere con cura il liquido in eccesso intorno all'organoide.
    9. Coprire gli organoidi con un mezzo di compensazione del fruttosio-glicerolo (la soluzione di compensazione del fruttosio-glicerolo è al 60% (vol/vol) e 2,5 M di fruttosio)37 utilizzando 120-150 μL del mezzo di montaggio-clearing per vetrino.
      NOTA: si consiglia di utilizzare una punta della pipetta tagliata quando si lavora con il mezzo di montaggio-clearing in quanto è molto viscoso.
    10. Passare il coperchio sopra la slitta con gli organoidi coperti con la soluzione di montaggio-clearing e premere lentamente il coperchio sopra la diapositiva, assicurandosi che gli organoidi si trovino tra le perline montate.
    11. Sigillare il perimetro del coverslip sulla diapositiva usando lo smalto per unghie top coat. Lasciare asciugare la diapositiva al buio a temperatura ambiente per 1 ora. Conservare a 4 °C al buio per la conservazione a lungo termine.
  4. Imaging transitorio del calcio in organoidi cardiaci vivi
    NOTA: Secondo le istruzioni del produttore, Fluo4-AM è stato ricostituito in dimetilsolfossido (DMSO) ad una concentrazione finale di soluzione madre di 0,5 mM. Fluo4-AM è stato aggiunto direttamente al pozzetto organoide nella piastra a 96 pozzetti.
    1. Eseguire 2 lavaggi sugli organoidi utilizzando il mezzo RPMI 1640.
      1. Rimuovere 166 μL del mezzo esaurito dal pozzo.
      2. Aggiungere 166 μL di mezzo RPMI 1640 riscaldato, rimuovere 166 μL di mezzo e aggiungere 166 μL di mezzo RPMI 1640 fresco.
        NOTA: I lavaggi vengono eseguiti per rimuovere il materiale di scarto e i detriti cellulari. Due terzi del mezzo vengono rimossi dai pozzetti durante i lavaggi per evitare di disturbare gli organoidi sul fondo del pozzo prima del saggio funzionale.
    2. Aggiungere Fluo4-AM medium agli organoidi.
      1. Aggiungere Fluo4-AM ricostituito in DMSO a RPMI 1640 contenente supplemento B-27 per preparare una soluzione da 1,5 μM.
      2. Rimuovere 166 μL di mezzo dal pozzo.
      3. Aggiungere 166 μL di 1,5 μM Fluo4-AM in RPMI 1640 contenente integratore B-27 per una concentrazione finale del pozzo di 1 μM. Incubare a 37 °C, 5% CO2 per 30 min.
    3. Eseguire 2 lavaggi come nel passaggio 3.4.1.
    4. Aggiungere 166 μL di RPMI 1640 contenente supplemento B-27 al pozzo.
    5. Utilizzando una punta tagliata di una punta per pipetta P200, trasferire l'organoide in una capsula di Petri con fondo di vetro (ad esempio, vetro di copertura a 8 pozzetti con vetro di copertura ad alte prestazioni #1.5) con 100-200 μL di mezzo.
      NOTA: Vedere paragrafo 3.1 sul trasferimento di organoidi interi.
    6. Immagina che gli organoidi vivano al microscopio con una camera a temperatura e CO2 controllata a 37 °C, 5% CO2.
    7. Registra diversi video di 10-20 s in varie posizioni attraverso l'organoide, mostrando l'aumento e la diminuzione dei livelli di intensità di fluorescenza quando il calcio entra ed esce dalle cellule.
      NOTA: per le registrazioni ad alta risoluzione, si consiglia di registrare a una velocità di 10 fps o superiore; Si consigliano 50 fps.
    8. Analizza i video utilizzando un software di analisi delle immagini (ad esempio, ImageJ) selezionando le regioni di interesse e misurando i livelli di intensità nel tempo.
    9. Normalizza le registrazioni di intensità usando ΔF/F0 rispetto al tempo in millisecondi e traccia.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Per ottenere hHO auto-organizzante in vitro, abbiamo modificato e combinato i protocolli di differenziazione precedentemente descritti per la differenziazione monostrato 2D di cardiomiociti21 e cellule epicardiche22 utilizzando modulatori di pathway Wnt e per organoidi precardiac 3D16 utilizzando i fattori di crescita BMP4 e Activin A. Utilizzando il protocollo di differenziazione EB e hHO a piastre a 96 pozzetti descritto qui e mostrato nel...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I recenti progressi nei cardiomiociti derivati da cellule staminali umane e in altre cellule di origine cardiaca sono stati utilizzati per modellare lo sviluppo del cuore umano22,24,25 e la malattia26,27,28 e come strumenti per lo screening di terapie29,30 e agenti

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato supportato dal National Heart, Lung, and Blood Institute del National Institutes of Health con i numeri di premio K01HL135464 e R01HL151505 e dall'American Heart Association con il numero di premio 19IPLOI34660342. Desideriamo ringraziare il MSU Advanced Microscopy Core e il Dr. William Jackson presso il Dipartimento di Farmacologia e Tossicologia della MSU per l'accesso ai microscopi confocali, al Nucleo di Microscopia QI e al Nucleo di Genomica MSU per i servizi di sequenziamento. Desideriamo anche ringraziare tutti i membri dell'Aguirre Lab per i loro preziosi commenti e consigli.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Anticorpi
Alexa Fluor 488 Asino anti-topoInvitrogenA-212021:200
Alexa Fluor 488 Asino anti-coniglioInvitrogenA-212061:200
Alexa Fluor 594 Asino anti-topoInvitrogenA-212031:200
Alexa Fluor 594 Asino anti-coniglioInvitrogenA-212071:200
Alexa Fluor 647 Asino anti-capraInvitrogenA328491:200
HAND1Abcamab196622Coniglio; 1:200
HAND2Abcamab200040Coniglio; 1:200
NFAT2Abcamab25916Coniglio; 1:100
PECAM1DSHBP2B1Coniglio; 1:50
TNNT2Abcamab8295Topo; 1:200
THY1Abcamab133350Coniglio; 1:200
TJP1InvitrogenPA5-19090Capra; 1:250
VIMAbcamab11256Capra; 1:250
WT1Abcamab89901Coniglio; 1:200
Terreni e reagenti
AccutaseInnovative Cell TechnologiesNC9464543reagente per dissociazione cellulare
Activin AR& D Systems338AC010
Integratore B-27 (Meno insulina)Integratore GibcoA1895601per colture cellulari senza insulina
Integratore B-27 IntegratoreGibco17504-044Integratore per colture cellulari
BMP-4GibcoPHC9534
Albumina sierica bovinaBioworld50253966
CHIR-99021Selleck442310
D-(-)-FruttosioMillipore SigmaF0127
DAPIThermo Scientific622481:1000
Dimetil solfossidoMillipore SigmaD2650
DMEM/F12Gibco10566016
Essential 8 Flex Medium KitGibcoA2858501terreno per cellule staminali pluripotenti (PSC) contenente l'1% penicillina-streptomicina
Fluo4-AMInvitrogenF14201
GliceroloMillipore SigmaG5516
GlicinaMillipore Sigma410225
Matrigel GFRCorningCB40230Matrice extracellulare della membrana basale (BM-ECM)
Siero d'asino normaleMillipore SigmaS30-100mL
ParaformaldeideMP BiomedicalsIC15014601Polvere disciolta in tampone PBS - utilizzare al 4%
di penicillina-streptomicinaGibco15140122
soluzione tampone fosfatoGibco10010049
soluzione tampone fosfato (10x)Gibco70011044
Polybead MicrospheresPolysciences, Inc.7315590 & micro; m
ReLeSRStem Cell TechnologiesNC0729236reagente di dissociazione per hPSC
RPMI 1640Gibco11875093
ThiazovivinMillipore SigmaSML1045
Triton X-100Millipore SigmaT8787
Soluzione blu di tripanoGibco1525006
VECTASHIELD Vibrance Antifade Terreno di montaggioVector LaboratoriesH170010
WNT-C59SelleckNC0710557
altre
provette per microcentrifuga da 1,5 mLFisher Scientific02682002
Provette Falcon da 15 mLFisher Scientific1495970C
Fiale criogeniche da 2 mLCorning13-700-500
Serbatoi di reagenti da 50 mL Fisherbrand13681502
Piastre per colture cellulari a fondo piatto a 6 pozzetti Corning0720083
Vetro con coperchio a camera a 8 pozzetti con vetro di copertura ad alte prestazioni #1,5CellvisC8-1,5H-N Micropiastre
trasparenti a 96 pozzetti con attacco ultra bassoCostar07201680
ImageJNIHImage software di elaborazione
KimwipesKimberly-Clark Professional06-666salviette da laboratorio
Micro Cover GlassVWR48393-24124 x 50 mm N. 1.5
Vetrini per microscopioFisherbrand1255015
Moxi Cell CounterOrflo Technologies  MXZ001
Cassetta per conteggio cellule Moxi Z – Tipo MOrflo  TecnologieMXC001
Pipette multicanaleFisherbrandFBE120030030-300 &; L
Olympus cellVivoOlympusper Caclium Imaging, analisi con Imagej
Sorvall Legend X1 CentrifugaThermoFisher Scientific75004261
Thermal MixerThermoFisher Scientific13-687-717
Top Coat Nail VarishSeche VitePuò acquistare da qualsiasi supermercato

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