Articolo metodologico

Isolamento, propagazione e identificazione di specie batteriche con proprietà metabolizzanti di idrocarburi da habitat acquatici

DOI:

10.3791/63101

⸱

7 dicembre 2021

 , 
1Department of Life Sciences, School of Natural Sciences, Shiv Nadar University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Presentiamo il processo di isolamento, propagazione e caratterizzazione dei batteri che degradano gli idrocarburi dagli habitat acquatici. Il protocollo delinea l'isolamento batterico, l'identificazione con il metodo 16S rRNA e il test del loro potenziale di degradazione degli idrocarburi. Questo articolo aiuterebbe i ricercatori a caratterizzare la biodiversità microbica nei campioni ambientali e in particolare a selezionare i microbi con potenziale di biorisanamento.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli inquinanti idrocarburici sono recalcitranti alla degradazione e il loro accumulo nell'ambiente è tossico per tutte le forme di vita. I batteri codificano numerosi enzimi catalitici e sono naturalmente in grado di metabolizzare gli idrocarburi. Gli scienziati sfruttano la biodiversità negli ecosistemi acquatici per isolare i batteri con potenziale di biodegradazione e biorisanamento. Tali isolati dall'ambiente forniscono un ricco insieme di percorsi metabolici ed enzimi, che possono essere ulteriormente utilizzati per aumentare il processo di degradazione su scala industriale. In questo articolo, delineiamo il processo generale di isolamento, propagazione e identificazione delle specie batteriche dagli habitat acquatici e analizziamo la loro capacità di utilizzare gli idrocarburi come unica fonte di carbonio in vitro utilizzando tecniche semplici. Il presente protocollo descrive l'isolamento di varie specie batteriche e la loro successiva identificazione utilizzando l'analisi dell'rRNA 16S. Il protocollo presenta anche misure per caratterizzare il potenziale di degradazione degli idrocarburi degli isolati batterici. Questo protocollo sarà utile per i ricercatori che cercano di isolare le specie batteriche dagli habitat ambientali per le loro applicazioni biotecnologiche.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli idrocarburi (HC) sono ampiamente utilizzati sia come combustibili che in applicazioni chimiche. Gli idrocarburi aromatici come benzene, toluene e xilene sono ampiamente utilizzati come solventi1. Alcheni come etilene e propilene fungono da precursori nella sintesi di polimeri di polietilene e polipropilene, rispettivamente. Polimerizzazione di un altro idrocarburo, lo stirene forma polistirene. Le attività antropiche introducono idrocarburi nell'ambiente durante la loro produzione e trasporto. La contaminazione da idrocarburi del suolo e dell'acqua è fonte di gravi preoccupazioni per l'ambiente e la salute umana. I microbi svolgono un ruolo importante nel mantenimento dell'ecosistema regolando i cicli biogeochimici e utilizzando una vasta gamma di substrati, che includono anche inquinanti e xenobiotici, convertendoli in carbonio e fonte di energia. Questo processo di disintossicazione dei contaminanti ambientali da parte di microrganismi è noto come biorisanamento 3,4,5,6,7.

I microrganismi con la capacità di degradare gli idrocarburi si trovano negli habitat acquatici e del suolo 8,9,10. Sono stati identificati molti batteri con il potenziale di degradare alcani e HC aromatici, come Pseudomonas, Acinetobacter, Rhodococcus, Marinobacter e Oleibacter11. Lo sviluppo di approcci tecnologicamente avanzati indipendenti dalla coltura ha contribuito alla scoperta di nuove comunità microbiche che degradano l'HC12. Il materiale genomico isolato direttamente dai campioni sorgente viene amplificato e sequenziato con metodi ad alta produttività come il sequenziamento di nuova generazione (NGS), seguito dall'analisi eliminando la necessità di coltivare microrganismi. I metodi NGS, come l'analisi del metagenoma, sono costosi e presentano inconvenienti legati al processo di amplificazione13. Le tecniche di coltivazione come la coltura dell'arricchimento selettivo14 che mirano all'isolamento dei microbi che degradano gli idrocarburi sono ancora utili in quanto consentono ai ricercatori di sondare e manipolare le vie metaboliche negli isolati batterici.

L'isolamento del DNA genomico e il successivo sequenziamento del materiale genomico rivelano informazioni preziose su qualsiasi organismo. Il sequenziamento dell'intero genoma aiuta nell'identificazione di geni che codificano per la resistenza agli antibiotici, potenziali bersagli farmacologici, fattori di virulenza, trasportatori, enzimi che metabolizzano gli xenobiotici, ecc15,16,17. Il sequenziamento del gene codificante 16SrRNA ha dimostrato di essere una tecnica robusta per identificare la filogenesi batterica. La conservazione della sequenza e della funzione genica nel corso degli anni lo rende uno strumento affidabile per identificare batteri sconosciuti e confrontare un isolato con le specie più vicine. Inoltre, la lunghezza di questo gene è ottimale per l'analisi bioinformatica18. Tutte queste caratteristiche, insieme alla facilità di amplificazione genica utilizzando primer universali e al miglioramento della tecnologia di sequenziamento genico, lo rendono un gold standard per l'identificazione dei microbi.

Qui, descriviamo una procedura per recuperare microrganismi coltivabili con potenziale di degradazione dell'HC da campioni ambientali. Il metodo descritto di seguito delinea la raccolta e l'identificazione dei batteri che degradano l'HC ed è diviso in cinque sezioni: (1) raccolta di batteri da campioni d'acqua, (2) isolamento di colture pure, (3) esplorazione della capacità di degradazione dell'HC di isolati batterici (4) isolamento del DNA genomico e (5) identificazione basata sul sequenziamento del gene rRNA 16S e analisi BLAST. Questa procedura può essere adattata per isolare batteri per molte diverse applicazioni biotecnologiche.

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Protocollo

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1. Raccolta, elaborazione e analisi dei campioni

NOTA: Qui presentiamo un protocollo per isolare i batteri dagli habitat acquatici. Alcuni degli isolati possono essere patogeni, quindi indossare guanti e disinfettare l'area di lavoro prima e dopo l'uso.

  1. Raccogliere 500 ml di campione d'acqua in cinque bottiglie di vetro sterili da diversi siti del corpo idrico. Misurare il pH e la temperatura di ciascun campione utilizzando rispettivamente un pHmetro e un termometro.
    NOTA: Il protocollo non è specifico del sito e può essere facilmente adattato per isolare gli organismi anche dai corpi idrici contaminati da idrocarburi.
  2. Filtrare il campione in un lotto di fogli filtranti da 100 mL a 0,22 μm di pori di dimensioni ridotte, in condizioni asettiche.
    NOTA: il diametro della carta da filtro non deve superare il diametro della piastra di Petri. Ad esempio, la carta da filtro non superiore a 85 mm di diametro è ottimale per una capsula di Petri da 100-120 mm.
  3. Conservare la carta da filtro su diverse piastre di supporti nutritivi (PYE 19, R2A 20,M9, LB, NB, TSB, M63 21 e M2G22). I diversi tipi di terreni di crescita consentono la selezione e l'arricchimento di diversi microrganismi. Le composizioni di vari terreni di crescita sono elencate nella Tabella 1. Utilizzare una carta per ogni piastra multimediale e staccare dopo 2 ore con una pinza sterile.
  4. Diluire in serie i campioni di acqua non filtrata (106 diluizione) in acqua sterile bidistillata aggiungendo 100 μL del campione d'acqua raccolto in 900 μL di acqua sterile. Ciò si traduce in una diluizione 1:10. Da questo campione, prelevare 100 μL e aggiungere 900 μL di acqua sterile per ottenere una diluizione 1:100. Ripetere la diluizione fino a quando la piega di diluizione è 1:1.000.000. Miscelare mediante pipettaggio. Il volume finale di ogni diluizione sarà di 1 ml.
  5. Distribuire singolarmente 100 μL del campione di acqua diluita su tutte le piastre di terreno di crescita menzionate nella fase 3 in triplice copia.
  6. Incubare le piastre a 30 °C per 24-48 ore a seconda della crescita delle colonie.
    NOTA: La maggior parte degli isolati ambientali cresce ad una temperatura ottimale di 30 °C. Se si isolano i campioni da un ambiente con temperature estreme, incubare le piastre alla stessa temperatura di quella del sito di raccolta.
  7. Quindi, scegliere le colonie usando uno stuzzicadenti sterile o una punta di pipetta ed eseguire la striatura del quadrante per ottenere colonie isolate.
  8. Incubare i piatti durante la notte. Il giorno successivo, esamina le colonie in base alle loro caratteristiche morfologiche come colore, consistenza, forma, dimensione, margine, elevazione, ecc. Restreak le colonie per ottenere colture pure.
  9. Eseguire la colorazione di ogni coltura pura23 e procedere con la preparazione del brodo di glicerolo.
  10. Per preparare le scorte di glicerolo, inoculare una singola colonia in 3 ml di terreno di coltura appropriato e incubare a 30 °C. Dalla coltura notturna, prendere 700 μL e aggiungere 300 μL di glicerolo al 100% (sterilizzato in autoclave) nei crioviali24. Congelare i flaconcini a -80 °C per una conservazione a lungo termine.

2. Degradazione degli idrocarburi

NOTA: L'esempio seguente serve a schermare gli isolati che possono degradare lo stirene. Si tratta di una leggera modifica del metodo adattato in una precedente relazione25. Seguire i passaggi in condizioni asettiche.

  1. Da un piatto appena striato, prelevare una colonia e inoculare 5 ml di brodo di soia triptico (TSB)/brodo nutriente (NB). Coltivare la coltura durante la notte a 30 °C agitando a 200 giri/min fino a quando l'assorbanza raggiunge ~2.
    NOTA: Oltre a TSB / NB, è possibile scegliere qualsiasi mezzo di crescita in cui i batteri raggiungano un'alta densità cellulare.
  2. Il giorno successivo, pellettare le cellule a 2862 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
  3. Lavare il pellet due volte con 2 mL di soluzione salina autoclavata (0,9% NaCl) e centrifugare a 2862 x g per 5 minuti a 4 °C.
    NOTA: La soluzione salina è isotonica e, quindi, mantiene la pressione osmotica all'interno delle cellule batteriche.
  4. Risospendere il pellet in 2 ml di mezzo basale liquido privo di carbonio (LCFBM). Misurare l'assorbanza (OD600).
  5. Prendere due palloni sterili di Erlenmeyer con capacità di controllo di 150 ml e il gruppo sperimentale. Etichettali come A e B.
  6. Nel gruppo non inoculato/di controllo, (pallone A), aggiungere 40 mL di LCFBM e stirene (5 mM).
  7. Nel matraccio B, aggiungere 35 mL di LCFBM e stirene (regolare la concentrazione finale di stirene a 5 mM). Aggiungere la sospensione cellulare con un OD finale600 di cellule ≈ 0,1 e comporre il volume rimanente con LCFBM fino a 40 ml. Incubare i matraccio a 30 °C agitando a 200 giri/min per 30 giorni.
    NOTA: Gli idrocarburi in eccesso possono essere tossici per i microbi, quindi, iniziare con bassa concentrazione e aumentarla gradualmente.
  8. Ripetere quanto sopra per ogni ceppo aggiuntivo che deve essere valutato per la degradazione degli idrocarburi.
  9. Misurare l'OD600 di ciascun matraccio ogni 5 giorni e tracciare una curva di crescita. Aumentare l'incubazione fino a 45 giorni se i batteri possono utilizzare lo stirene. Un aumento di OD600 indica che il batterio può metabolizzare lo stirene.

3. Screening della degradazione del catecolo da parte di isolati batterici

NOTA: La degradazione di idrocarburi aromatici come stirene, benzene, xilene, naftalene, fenoli, ecc. produce catecoli come intermedi di reazione. I catecoli sono ulteriormente metabolizzati dai batteri con l'aiuto degli enzimi catecolo 1,2-diossigenasi e catecolo 2,3-diossigenasi attraverso le vie orto- e meta-scissione, rispettivamente26. Questi enzimi sono anche coinvolti nella degradazione di altri idrocarburi come il clorobenzene27. Il protocollo menzionato di seguito utilizza il lisato di cellule intere per il saggio enzimatico catecolo 2, 3-diossigenasi28. Lo stesso metodo di lisi può essere utilizzato per schermare l'attività della catecolo 1, 2-diossigenasi. Tuttavia, la composizione della miscela di reazione varierà. Entrambi gli enzimi sono inducibili in natura e possono essere indotti dall'aggiunta di fenolo ai mezzi di crescita.

  1. Con l'aiuto di un ciclo sterile, inoculare la colonia batterica da una piastra appena striata in sali minerali (MSM) integrati con 1-4 mM di fenolo. Incubare la coltura a 30 °C e 200 giri/min. Raccogliere la coltura a 4 °C quando OD 600 raggiunge tra 1,4-1,6 (cioè in fase esponenziale avanzata) centrifugando a4500 x g per 20 minuti.
  2. Lavare il pellet cellulare con tampone fosfato (0,5 M, pH 7,5).
  3. Risospendere le cellule nel tampone fosfato sopra menzionato e regolare l'OD600 finale ≈ 1.0.
  4. Lisare le cellule mediante sonicazione pulsata per 1,5 minuti, la durata di ciascun impulso è di 15 s. Dopo questo passaggio, la sospensione deve essere chiara o meno torbida. In caso contrario, aumentare il numero di impulsi e verificare se la sospensione è libera. Dopo ogni impulso, conservare il campione sul ghiaccio per evitare la degradazione delle proteine.
  5. Rimuovere i detriti cellulari e le cellule ininterrotte mediante centrifugazione a 9.000 x g per 30 minuti, mantenendo la temperatura fredda (4 °C).
  6. Pipettare con attenzione il surnatante chiaro. Questa frazione ha l'estratto grezzo per il saggio enzimatico.
  7. Determinare la concentrazione proteica dell'estratto grezzo con il metodo di Bradford o Lowry29,30.
  8. Per determinare l'attività della catecolo 2,3-diossigenasi, misurare la formazione del prodotto finale di reazione (semialdeide 2-idrossimuconica) mediante uno spettrofotometro.
  9. Preparare la miscela di reazione aggiungendo 20 μL di catecolo (50 mM), 960 μL di tampone fosfato (50 mM, pH 7,5) e 20 μL di estratto grezzo.
  10. Per il controllo negativo, sostituire l'estratto grezzo con tampone fosfato e regolare il volume finale a 1 ml.
  11. Incubare la miscela di reazione per 30 minuti. A intervalli di tempo impostati, misurare l'assorbanza a 375 nm. Un aumento dell'assorbanza indica la formazione del prodotto finale di reazione, semialdeide dell'acido 2-idrossimuconico (2-HMS). Eseguire l'esperimento in triplice copia.
    NOTA: Catechol è sensibile alla luce e all'ossigeno. Conservare la miscela di reazione al buio e chiudere ermeticamente i tubi per evitare la naturale degradazione del catecolo.

4. Isolamento genomico del DNA della coltura pura

NOTA: Questo è il protocollo generale per l'isolamento del DNA genomico. La colorazione di Gram è stata eseguita durante la fase di raccolta, elaborazione e analisi del campione. A causa della variazione dello spessore della parete cellulare dei batteri gram-positivi e gram-negativi, il metodo di lisi cellulare viene modificato di conseguenza. Indossare guanti durante l'isolamento e disinfettare il banco di lavoro con etanolo al 70% per evitare che le nucleasi degradino il DNA. Alcune delle sostanze chimiche menzionate di seguito possono causare gravi ustioni sulla pelle e deve essere presa la dovuta attenzione durante la loro manipolazione.

  1. Isolamento del DNA genomico da batteri Gram-negativi31.
    1. Scegli una singola colonia e inocula in un terreno di crescita fresco in provette sterili.
    2. Posizionare i tubi in uno scuotitore incubatore a 200 giri / min e lasciare che i batteri crescano durante la notte a 30 ° C.
    3. Il giorno successivo, pellet 1,5 ml di coltura coltivata durante la notte a 12.400 x g per 3 minuti.
    4. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 200 μL di tampone di lisi (40 mM di Tris-acetato, pH 7,8, 20 mM di acetato di sodio, 1 mM EDTA, 1% SDS).
    5. Aggiungere 66 μL di soluzione di NaCl (5 M) e mescolare bene.
    6. Pellettare la miscela risultante a 12.400 x g per 10 minuti (4 °C).
    7. Pipettare il surnatante trasparente in una provetta di microcentrifuga fresca e aggiungere un volume uguale di cloroformio.
    8. Capovolgere la soluzione più volte fino a quando non si osserva una soluzione lattiginosa.
    9. Ruotare a 12.400 x g per 3 minuti e trasferire il surnatante in un flaconcino pulito.
    10. Aggiungere 1 ml di etanolo ghiacciato al 100%; mescolare per inversione fino a quando i filamenti bianchi di DNA precipitano.
    11. Centrifugare il DNA precipitato a 2.200 x g per 10 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
    12. Lavare il pellet di DNA con 1 mL di etanolo al 70% e lasciare asciugare il pellet di DNA per 5 minuti a temperatura ambiente.
    13. Una volta essiccato, risospendere il pellet in 100 μL di tampone 1x Tris-EDTA(TE) e conservare il DNA a -20 °C.
    14. Misurare la concentrazione (A260/280) utilizzando lo spettrofotometro ed eseguire il DNA su gel di agarosio (1%) per valutare la qualità del DNA24.
  2. Isolamento del DNA genomico dal ceppo gram-positivo32
    1. Scegli una singola colonia e inocula in terreno di crescita fresco in provette sterili.
    2. Posizionare i tubi in uno scuotitore incubatore a 200 giri / min e consentire ai batteri di crescere durante la notte ad una temperatura di crescita adeguata.
    3. Il giorno successivo, prendere 1,5 ml della coltura coltivata e centrifugare a 8.600 x g per 5 minuti.
    4. Rimuovere il surnatante e risospendere le celle nel buffer TE.
    5. Regolare l'OD600 = 1,0 con tampone TE e trasferire 740 μL della sospensione cellulare in un tubo di microfuge pulito.
    6. Aggiungere 20 μL di lisozima (100 mg/mL di brodo) e mescolare bene mediante pipettaggio. Incubare a 37 °C per 30 minuti (in bagno asciutto).
    7. Aggiungere 40 μL di SDS al 10% e mescolare bene.
    8. Aggiungere 8 μL di proteinasi K (10 mg/ml). Mescolare bene e incubare a 56 °C per 1-3 ore (in bagno asciutto). La sospensione dovrebbe diventare chiara ora con una maggiore viscosità, segnando un'efficiente lisi cellulare.
      NOTA: La sospensione può essere lasciata durante la notte se le cellule non sono lisate correttamente.
    9. Preriscaldare la miscela CTAB/NaCl a 65 °C (in bagno asciutto) e aggiungere 100 μL di questa miscela alla sospensione cellulare. Mescolare bene.
    10. Incubare a 65 °C per 10 minuti (in bagno asciutto).
    11. Aggiungere 500 μL di cloroformio:alcool isoamilico (24:1) e mescolare bene. Centrifugare a 16.900 x g per 10 minuti a 25 °C.
    12. Trasferire la fase acquosa in una provetta di microcentrifuga fresca evitando la fase organica (fase viscosa sul fondo).
    13. Aggiungere con cautela 500 μL di fenolo:cloroformio:alcool isoamilico (25:24:1) e mescolare bene. Centrifugare a 16.900 x g per 10 minuti a 25 °C.
    14. Prendere la fase acquosa in una provetta di microcentrifuga fresca. Aggiungere 500 μL di cloroformio:alcool isoamilico (24:1) e mescolare bene.
    15. Trasferire la fase acquosa e aggiungere 0,6 volume di isopropanolo (prerefrigerato a -20 °C).
    16. I filamenti di DNA precipitati devono essere visibili sotto forma filiforme. Incubare a -20 °C per 2 ore fino a tutta la notte.
    17. Centrifugare a 16.900 x g per 15 minuti a 4 °C per pellettare il DNA.
    18. Decantare accuratamente l'isopropanolo e lavare il pellet con 1 mL di etanolo freddo al 70% (prerefrigerato a -20 °C) per rimuovere eventuali impurità.
    19. Centrifugare a 16.900 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante.
    20. Lasciare asciugare il pellet a temperatura ambiente per 20 minuti o mantenere il tubo a 37 °C. Assicurarsi che il pellet non sia troppo essiccato.
    21. Risospendere in 100 μL di tampone 1x TE e conservare il DNA a -20 °C.
      NOTA: Se il pellet diventa troppo secco ed è difficile da risospendere, incubare la provetta della microcentrifuga con pellet di DNA e acqua priva di nucleasi a 37 °C per 15-20 minuti e risospendere nuovamente mediante pipettaggio.
    22. Misurare la concentrazione (A260/280) utilizzando uno spettrofotometro dopo aver effettuato la diluizione 1:100 in tampone 1x TE ed eseguire il DNA su gel di agarosio (1%) per valutare la qualità del DNA24.

5. Sequenziamento dell'rRNA 16S

NOTA: Il protocollo descritto di seguito è per l'amplificazione e il sequenziamento dell'rRNA 16S per l'identificazione batterica. Le informazioni derivate dalla sequenza di rRNA 16S vengono utilizzate per l'identificazione di un organismo sconosciuto e per trovare la correlazione tra diversi organismi.

  1. Per identificare i ceppi, amplificare il DNA isolato dalle colture batteriche pure mediante PCR con primer universali mirati alla sequenza di rRNA 16S per i batteri: 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') e 1492R (5'- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')33.
  2. Preparare la miscela PCR (reazioni da 25 μL) su ghiaccio con 18 μL di acqua autoclavata/priva di nucleasi, 2,5 μL di tampone 10x, 0,5 μL di primer sia diretti che inversi (100 μM stock), 2 μL della miscela dNTPs (100 μM stock), 1 μL di DNA template (2-15 ng/μL) e 1 U di Taq Polimerasi.
  3. Utilizzare le seguenti condizioni cicliche per l'amplificazione del gene 16S rRNA: Denaturazione iniziale a 94 °C per 10 min, (denaturazione finale a 94 °C per 40 s, ricottura primer a 56 °C per 1 min, estensione a 74 °C per 2 min) x 30 cicli, estensione finale a 74 °C per 10 min.
  4. Al termine del ciclo, mescolare 5 μL di campione e 1 μL di colorante caricante DNA 5x. Eseguire su gel di agarosio all'1% per verificare l'amplificazione. Conservare i prodotti PCR a 4 °C per un breve periodo o congelarli a -20°C fino a nuovo utilizzo.
  5. Per il sequenziamento del gene 16S rRNA, impostare la stessa reazione di cui sopra per un volume maggiore (100 μL).
  6. Purificare gli ampliconi per il sequenziamento Sanger24,34 utilizzando il kit di purificazione del prodotto PCR o mescolare l'intero campione con colorante caricante DNA e caricare su un gel di agarosio per eseguire il metodo di estrazione del gel.
  7. Una volta terminata la sequenziazione, convertire il file dei risultati in formato FASTA e verificare la somiglianza della sequenza con lo strumento di ricerca di allineamento locale di base (BLAST) su NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)35.

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Risultati

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Lo schema che delinea l'intera procedura per l'isolamento e lo screening dei batteri dagli habitat acquatici e la loro successiva identificazione mediante analisi dell'rRNA 16S è rappresentato nella Figura 1. I campioni d'acqua provenienti da una zona umida a Dadri, in India, sono stati raccolti in bottiglie di vetro sterili e immediatamente portati in laboratorio per l'elaborazione. I campioni sono stati fatti passare attraverso fogli filtranti con una dimensione dei pori d...

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Discussione

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È ben noto che solo circa l'1% dei batteri sulla Terra può essere facilmente coltivato in laboratorio6. Anche tra i batteri coltivabili, molti rimangono non caratterizzati. I miglioramenti nei metodi molecolari hanno dato una nuova dimensione all'analisi e alla valutazione delle comunità batteriche. Tuttavia, tali tecniche hanno dei limiti, ma non rendono superflue le analisi colturali. Le tecniche di coltura pura per isolare le singole specie batteriche rimangono il meccanismo primario per la car...

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Dichiarazioni

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Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo il Dr. Karthik Krishnan e i membri del laboratorio RP per i loro utili commenti e suggerimenti. DS è supportato da SNU-Doctoral fellowship e Earthwatch Institute India Fellowship. Il laboratorio RP è supportato da una sovvenzione CSIR-EMR e da fondi di start-up della Shiv Nadar University.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AgarosioSigma-AldrichA4718Elettroforesi su gel
Cloruro di ammonio (NH4Cl)Sigma-AldrichA9434Componente del mezzo di crescita
Solfato di ammonioSigma-AldrichA4418Componente del mezzo di crescita
Bacto-AgarMillipore1016141000Preparazione del terreno solido
Cloruro di calcio (CaCl2)MERCKC4901-500GComponente del mezzo di crescita
CatecholSigma-Aldrich135011Saggio di degradazione degli idrocarburi
Bromuro di cetiltrimetilammonio, CTABSigma-AldrichH6269Isolamento genomico del DNA
CloroformioHIMEDIAMB109Isolamento genomico del DNA
Fosfato disodico (Na2HPO4)Sigma-AldrichS5136Componente del mezzo di crescita
EDTASigma-AldrichE9884componente tampone gDNA
Solfato ferroso, eptaidrato (FeSO4.7H20)Sigma-Aldrich215422Componente del mezzo di crescita
GlucosioSigma-AldrichG7021Componente del mezzo di crescita
GliceroloSigma-AldrichG5516Componente del mezzo di crescita; Stock di glicerolo
IsopropanoloHIMEDIAMB063Isolamento genomico del DNA
LB AgarDifco244520Terreno di crescita
Luria-Bertani (LB)Difco244620Terreno di crescita
Solfato di magnesio (MgSO4)MERCKM2643Componente
del mezzo di crescitaSolfato di manganese (II) monoidrato (MnSO4. H20)Sigma-Aldrich221287Componente del mezzo di crescita
Brodo nutritivo (NB)Merck (Millipore)03856-500GMezzo di crescita
PeptoneMerck91249-500GComponente del mezzo di crescita
FenoloSigma-AldrichP1037Isolamento genomico del DNA
Fosfato di potassio, bibasico (K2HPO4)Sigma-AldrichP3786Componente del mezzo di crescita
Fosfato di potassio, monobasico (KH2PO4)Sigma-AldrichP9791Componente del mezzo di crescita
Proteinasi KThermoFisher ScientificAM2546Isolamento genomico del DNA
QIAquick Kit di estrazione del gel QIAGEN160016235DNA di purificazione
QIAquick PCR Kit di purificazioneQIAGEN163038783Purificazione del DNA
R2A AgarMillipore1004160500Terreno di crescita
Spettrofotometro SmartSpec Plus4006221Misura dell'assorbanzaAcetato
sodioSigma-AldrichS2889Isolamento genomico del DNA
Cloruro di sodio (NaCl)Sigma-AldrichS9888Componente del mezzo di crescita
Sodio dodecil solfato (SDS)Sigma-AldrichL3771Isolamento genomico del DNA
StireneSigma-AldrichS4972Biodegradazione dello stirene
Taq DNA polimerasiNEBM0273X16s rRNA PCR
Tris-EDTA (TE)Sigma-Aldrich93283Risospensione del DNA
Brodo di soia triptico (TSB)Merck22092-500GTerreno di crescita
Estratto di lievitoSigma-AldrichY1625-1KGComponente del mezzo di crescita
Solfato di zinco eptaidrato (ZnSO4.7H20)Sigma-Aldrich 221376Componente del mezzo di crescita
di genomico

Riferimenti

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