Articolo metodologico

Isolamento, propagazione e identificazione di specie batteriche con proprietà metabolizzanti di idrocarburi da habitat acquatici

DOI:

10.3791/63101

⸱

7 dicembre 2021

 , 
1Department of Life Sciences, School of Natural Sciences, Shiv Nadar University

In questo articolo

Sommario

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Presentiamo il processo di isolamento, propagazione e caratterizzazione dei batteri che degradano gli idrocarburi dagli habitat acquatici. Il protocollo delinea l'isolamento batterico, l'identificazione con il metodo 16S rRNA e il test del loro potenziale di degradazione degli idrocarburi. Questo articolo aiuterebbe i ricercatori a caratterizzare la biodiversità microbica nei campioni ambientali e in particolare a selezionare i microbi con potenziale di biorisanamento.

Abstract

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Gli inquinanti idrocarburici sono recalcitranti alla degradazione e il loro accumulo nell'ambiente è tossico per tutte le forme di vita. I batteri codificano numerosi enzimi catalitici e sono naturalmente in grado di metabolizzare gli idrocarburi. Gli scienziati sfruttano la biodiversità negli ecosistemi acquatici per isolare i batteri con potenziale di biodegradazione e biorisanamento. Tali isolati dall'ambiente forniscono un ricco insieme di percorsi metabolici ed enzimi, che possono essere ulteriormente utilizzati per aumentare il processo di degradazione su scala industriale. In questo articolo, delineiamo il processo generale di isolamento, propagazione e identificazione delle specie batteriche dagli habitat acquatici e analizziamo la loro capacità di utilizzare gli idrocarburi come unica fonte di carbonio in vitro utilizzando tecniche semplici. Il presente protocollo descrive l'isolamento di varie specie batteriche e la loro successiva identificazione utilizzando l'analisi dell'rRNA 16S. Il protocollo presenta anche misure per caratterizzare il potenziale di degradazione degli idrocarburi degli isolati batterici. Questo protocollo sarà utile per i ricercatori che cercano di isolare le specie batteriche dagli habitat ambientali per le loro applicazioni biotecnologiche.

Introduzione

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Gli idrocarburi (HC) sono ampiamente utilizzati sia come combustibili che in applicazioni chimiche. Gli idrocarburi aromatici come benzene, toluene e xilene sono ampiamente utilizzati come solventi1. Alcheni come etilene e propilene fungono da precursori nella sintesi di polimeri di polietilene e polipropilene, rispettivamente. Polimerizzazione di un altro idrocarburo, lo stirene forma polistirene. Le attività antropiche introducono idrocarburi nell'ambiente durante la loro produzione e trasporto. La contaminazione da idrocarburi del suolo e dell'acqua è fonte di gravi preoccupazioni per l'ambiente e la salute umana. I microbi svolgono un ruolo....

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Protocollo

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1. Raccolta, elaborazione e analisi dei campioni

NOTA: Qui presentiamo un protocollo per isolare i batteri dagli habitat acquatici. Alcuni degli isolati possono essere patogeni, quindi indossare guanti e disinfettare l'area di lavoro prima e dopo l'uso.

  1. Raccogliere 500 ml di campione d'acqua in cinque bottiglie di vetro sterili da diversi siti del corpo idrico. Misurare il pH e la temperatura di ciascun campione utilizzando rispettivamente un pHmetro e un termometro.
    NOTA: Il protocollo non è specifico del sito e può essere facilmente adattato per isolare gli organismi anche dai corpi idrici contaminati da idro....

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Risultati

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Lo schema che delinea l'intera procedura per l'isolamento e lo screening dei batteri dagli habitat acquatici e la loro successiva identificazione mediante analisi dell'rRNA 16S è rappresentato nella Figura 1. I campioni d'acqua provenienti da una zona umida a Dadri, in India, sono stati raccolti in bottiglie di vetro sterili e immediatamente portati in laboratorio per l'elaborazione. I campioni sono stati fatti passare attraverso fogli filtranti con una dimensione dei pori d.......

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Discussione

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È ben noto che solo circa l'1% dei batteri sulla Terra può essere facilmente coltivato in laboratorio6. Anche tra i batteri coltivabili, molti rimangono non caratterizzati. I miglioramenti nei metodi molecolari hanno dato una nuova dimensione all'analisi e alla valutazione delle comunità batteriche. Tuttavia, tali tecniche hanno dei limiti, ma non rendono superflue le analisi colturali. Le tecniche di coltura pura per isolare le singole specie batteriche rimangono il meccanismo primario per la car.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Ringraziamo il Dr. Karthik Krishnan e i membri del laboratorio RP per i loro utili commenti e suggerimenti. DS è supportato da SNU-Doctoral fellowship e Earthwatch Institute India Fellowship. Il laboratorio RP è supportato da una sovvenzione CSIR-EMR e da fondi di start-up della Shiv Nadar University.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AgarosioSigma-AldrichA4718Elettroforesi su gel
Cloruro di ammonio (NH4Cl)Sigma-AldrichA9434Componente del mezzo di crescita
Solfato di ammonioSigma-AldrichA4418Componente del mezzo di crescita
Bacto-AgarMillipore1016141000Preparazione del terreno solido
Cloruro di calcio (CaCl2)MERCKC4901-500GComponente del mezzo di crescita
CatecholSigma-Aldrich135011Saggio di degradazione degli idrocarburi
Bromuro di cetiltrimetilammonio, CTABSigma-AldrichH6269Isolamento genomico del DNA
CloroformioHIMEDIAMB109Isolamento genomico del DNA
Fosfato disodico (Na2HPO4)Sigma-AldrichS5136Componente del mezzo di crescita
EDTASigma-AldrichE9884componente tampone gDNA
Solfato ferroso, eptaidrato (FeSO4.7H20)Sigma-Aldrich215422Componente del mezzo di crescita
GlucosioSigma-AldrichG7021Componente del mezzo di crescita
GliceroloSigma-AldrichG5516Componente del mezzo di crescita; Stock di glicerolo
IsopropanoloHIMEDIAMB063Isolamento genomico del DNA
LB AgarDifco244520Terreno di crescita
Luria-Bertani (LB)Difco244620Terreno di crescita
Solfato di magnesio (MgSO4)MERCKM2643Componente
del mezzo di crescitaSolfato di manganese (II) monoidrato (MnSO4. H20)Sigma-Aldrich221287Componente del mezzo di crescita
Brodo nutritivo (NB)Merck (Millipore)03856-500GMezzo di crescita
PeptoneMerck91249-500GComponente del mezzo di crescita
FenoloSigma-AldrichP1037Isolamento genomico del DNA
Fosfato di potassio, bibasico (K2HPO4)Sigma-AldrichP3786Componente del mezzo di crescita
Fosfato di potassio, monobasico (KH2PO4)Sigma-AldrichP9791Componente del mezzo di crescita
Proteinasi KThermoFisher ScientificAM2546Isolamento genomico del DNA
QIAquick Kit di estrazione del gel QIAGEN160016235DNA di purificazione
QIAquick PCR Kit di purificazioneQIAGEN163038783Purificazione del DNA
R2A AgarMillipore1004160500Terreno di crescita
Spettrofotometro SmartSpec Plus4006221Misura dell'assorbanzaAcetato
sodioSigma-AldrichS2889Isolamento genomico del DNA
Cloruro di sodio (NaCl)Sigma-AldrichS9888Componente del mezzo di crescita
Sodio dodecil solfato (SDS)Sigma-AldrichL3771Isolamento genomico del DNA
StireneSigma-AldrichS4972Biodegradazione dello stirene
Taq DNA polimerasiNEBM0273X16s rRNA PCR
Tris-EDTA (TE)Sigma-Aldrich93283Risospensione del DNA
Brodo di soia triptico (TSB)Merck22092-500GTerreno di crescita
Estratto di lievitoSigma-AldrichY1625-1KGComponente del mezzo di crescita
Solfato di zinco eptaidrato (ZnSO4.7H20)Sigma-Aldrich 221376Componente del mezzo di crescita
di genomico

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sirotkin, A. V. Reproductive effects of oil-related environmental pollutants. Encyclopedia of Environmental Health. , 493-498 (2019).
  2. Li, C., Busquets, R., Campos, L. C. Assessment of microplastics in freshwater systems: A review. Science of The Total Environme....

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