Presentiamo un protocollo per la determinazione della chiralità multicellulare in vitro, utilizzando la tecnica del micropatterning. Questo test consente la quantificazione automatica dei bias sinistra-destra di vari tipi di cellule e può essere utilizzato a scopo di screening.
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Articolo metodologico
Un test di micropatterning per la misurazione della chiralità cellulare
In questo articolo
Sommario
Abstract
La chiralità è una proprietà cellulare intrinseca, che raffigura l'asimmetria in termini di polarizzazione lungo l'asse sinistro-destro della cellula. Poiché questa proprietà unica attira sempre più attenzione a causa dei suoi ruoli importanti sia nello sviluppo che nella malattia, un metodo di quantificazione standardizzato per caratterizzare la chiralità cellulare farebbe progredire la ricerca e le potenziali applicazioni. In questo protocollo, descriviamo un test di caratterizzazione della chiralità multicellulare che utilizza array di cellule micropatterned. I micropattern cellulari sono fabbricati su vetrini rivestiti in titanio / oro tramite stampa a microcontatto. Dopo la semina sulle isole geometricamente definite (ad esempio, a forma di anello) rivestite di proteine, le cellule migrano direzionalmente e formano un allineamento distorto verso la direzione in senso orario o antiorario, che può essere automaticamente analizzato e quantificato da un programma MATLAB scritto su misura. Qui descriviamo in dettaglio la fabbricazione di substrati micropatterned, la semina cellulare, la raccolta di immagini e l'analisi dei dati e mostriamo risultati rappresentativi ottenuti utilizzando le celle NIH / 3T3. Questo protocollo è stato precedentemente convalidato in diversi studi pubblicati ed è uno strumento efficiente e affidabile per lo studio della chiralità cellulare in vitro.
Introduzione
L'asimmetria sinistra-destra (LR) della cellula, nota anche come manualità cellulare o chiralità, descrive la polarità cellulare nell'asse LR ed è riconosciuta come una proprietà biofisica fondamentale, conservata, 1,2,3,4,5. La chiralità cellulare è stata osservata sia in vivo che in vitro su più scale. Precedenti risultati hanno rivelato il vortice chirale del citoscheletro di actina in singole cellule seminate su isole circolari6, la migrazione distorta e l'allin....
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Protocollo
1. Fabbricazione di francobolli polidimetilsilossano (PDMS)16
- Disegna una serie di anelli su microscala utilizzando il software CAD, con un diametro interno di 250 μm e un diametro esterno di 450 μm. Il modello utilizzato in questo protocollo è un array 10 x 10 con una distanza di 850 μm tra gli anelli.
- Stampare una maschera di trasparenza del modello alla risoluzione desiderata utilizzando il servizio di stampa di maschere di un'azienda di microfabbricazione (vedere Tabella dei materiali).
NOTA: le dimensioni fornite dell'anello hanno dimostrato di funzionare per molti tipi di celle7
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Risultati
Quindici minuti dopo la semina delle cellule NIH/3T3, l'adesione cellulare sul modello ad anello è stata confermata visivamente dall'imaging a contrasto di fase. Dopo la successiva coltura di 24 ore, le cellule sui modelli sono diventate confluenti e allungate con allineamenti chiaramente asimmetrici, sbilanciati verso la direzione in senso orario (Figura 2). La migrazione direzionale delle cellule attaccate viene registrata mediante imaging time-lapse, la motilità cellulare e la morfogenesi.......
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Discussione
Il test di patterning a forma di anello qui descritto fornisce uno strumento di facile utilizzo per la caratterizzazione quantitativa della chiralità multicellulare, in grado di produrre risultati altamente affidabili e ripetibili. La rapida generazione di microambienti identici definiti e l'analisi imparziale consentono l'elaborazione automatizzata ad alta produttività di campioni di grandi dimensioni. Questo protocollo discute la fabbricazione dei micropattern ad anello, il pattern cellulare e l'analisi automatica dell.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health (OD/NICHD DP2HD083961 e NHBLI R01HL148104). Leo Q. Wan è un Pew Scholar in Biomedical Sciences (PEW 00026185), supportato dal Pew Charitable Trusts. Haokang Zhang è supportato dall'American Heart Association Predoctoral Fellowship (20PRE35210243).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 200 proof etanolo | Koptec | DSP-MD-43 | |
| BZX sistema di microscopio | Keyence | BZX-600 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM), alto glucosio | Gibco | 11965092 | |
| Evaporatore a fascio di elettroni | Temscal | BJD-1800 | Rivestimento in film d'oro-titanum |
| Siero fetale | bovino VWR | 89510-186 | |
| Fibronectina da plasma bovino | Sigma | F1141-5MG | |
| Vetrini per microscopio | VWR | 10024-048 | |
| Pinzette in vetro | Exelta | 390BSAPI | |
| Pellet di evaporazione d'oro International | Advanced Materials | AU18 | |
| HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3) | Prochimia | TH 001-m11.n3-0.2 | |
| MATLAB | Mathworks | MATLAB_R2020b | |
| Celle NIH/3T3 | ATCC | CRL-1658 | |
| Allineatore a contatto OAI | Fotolitografia UV | OAI | 200 |
| Ottadecanetiolo (C18) | Sigma | O1858-25ML | |
| Agitatore orbitale | VWR | 89032-088 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Prodotto di ricerca internazionale | P32080-100T | |
| Polidimetilsilossano Sylgard 184 | Dow Corning | DC4019862 | |
| Wafer di silicio | University Wafer | ID#809 | |
| Piruvato di sodio | Thermo fisher scientific | 11360-070 | |
| SU-8 3050 fotoresist | MicroChem | Y311075 0500L1GL | |
| Pellet di evaporazione in titanio | International Advanced Materiali | TI14 | |
| Maschera trasparente (con funzione) | Outputicity.com | N/A | Servizio di stampa maschera |
| Tripsina-EDTA (0,25%) | Thermo fisher scientific | 25200-072 |
Riferimenti
- Wan, L. Q., Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P. Cell chirality: emergence of asymmetry from cell culture. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371, 20150413(2016).
- Rahman, T., Zhang, H., Fan, J., Wan, L. Q.
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Ristampe e permessi
