Method Article

Classificazione dello stato di attivazione delle cellule staminali neurali in vitro mediante autofluorescenza

DOI:

10.3791/63110

⸱

April 12th, 2024

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1Department of Neuroscience, University of Wisconsin-Madison, 2Morgridge Institute for Research, 3Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive le strategie per identificare e arricchire lo stato cellulare in colture primarie di cellule staminali neurali di topo adulto mediante imaging in autofluorescenza utilizzando i) un microscopio confocale, ii) un selezionatore cellulare attivato a fluorescenza per eseguire l'imaging dell'intensità o iii) un microscopio multifotone per eseguire l'imaging del tempo di vita in fluorescenza.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le cellule staminali neurali (NSC) si dividono e producono neuroni neonati nel cervello adulto attraverso un processo chiamato neurogenesi adulta. Le NSC adulte sono principalmente quiescenti, uno stato cellulare reversibile in cui sono uscite dal ciclo cellulare (G0) ma rimangono sensibili all'ambiente. Nella prima fase della neurogenesi adulta, le NSC quiescenti (qNSCs) ricevono un segnale e si attivano, uscendo dalla quiescenza e rientrando nel ciclo cellulare. Pertanto, comprendere i regolatori della quiescenza e dell'uscita dalla quiescenza delle NSC è fondamentale per le future strategie mirate alla neurogenesi adulta. Tuttavia, la nostra comprensione della quiescenza delle NSC è limitata da vincoli tecnici nell'identificazione delle NSC quiescenti (qNSC) e delle NSC attivate (aNSC). Questo protocollo descrive un nuovo approccio per identificare e arricchire qNSC e aNSCs generate in colture in vitro mediante imaging dell'autofluorescenza delle NSC. Innanzitutto, questo protocollo descrive come utilizzare un microscopio confocale per identificare i marcatori autofluorescenti di qNSC e aNSC per classificare lo stato di attivazione delle NSC utilizzando l'intensità dell'autofluorescenza. In secondo luogo, questo protocollo descrive come utilizzare un selezionatore di cellule attivate fluorescenti (FACS) per classificare lo stato di attivazione delle NSC e arricchire i campioni per qNSC o aNSC utilizzando l'intensità di autofluorescenza. In terzo luogo, questo protocollo descrive come utilizzare un microscopio multifotone per eseguire l'imaging del tempo di vita della fluorescenza (FLIM) con risoluzione di una singola cellula, classificare lo stato di attivazione delle NSC e tracciare la dinamica dell'uscita di quiescenza utilizzando sia le intensità di autofluorescenza che i tempi di vita della fluorescenza. Pertanto, questo protocollo fornisce un kit di strumenti per la risoluzione di singole cellule vive, senza marcatura, per lo studio della quiescenza e dell'uscita dalla quiescenza delle NSC.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le NSC creano neuroni neonati per tutta la vita in molti organismi in un processo denominato neurogenesi adulta 1,2. Per produrre neuroni neonati, una qNSC deve prima attivarsi, entrando nel ciclo cellulare per espandere la popolazione e produrre progenitori neurali 3,4,5,6. Sebbene si sappia molto sulla quiescenza delle NSC, la nostra capacità di identificare completamente i driver e i regolatori della quiescenza delle NSC è limitata dalle limitazioni tecniche esistenti per isolare e identificare le qNSC e la loro transizione all'attivazione. L'imaging in autofluorescenza ha precedentemente avuto successo nello studio dei cambiamenti nello stato cellulare in molti tipi di cellule diverse, come la microglia e le cellule T, risolvendo il rimodellamento metabolico, che influenza le proprietà ottiche dei cofattori metabolici autofluorescenti come la nicotinammide adenina dinucleotide fosfato (NAD(P)H) e la flavina adenina dinucleotide (FAD)7,8. Le NSC rimodellano sostanzialmente le loro reti metaboliche quando vanno incontro all'uscitadi quiescenza 9,10,11,12,13,14. Pertanto, per trarre vantaggio da queste differenze, l'autofluorescenza delle NSC è stata recentemente utilizzata per identificare e arricchire lo stato di attivazione delle NSC rilevando cambiamenti nell'autofluorescenza attribuiti al rimodellamento metabolico che si verifica quando le NSC escono dalla quiescenza15. L'autofluorescenza per immagini offre diversi vantaggi tecnici: i) non richiede l'aggiunta di etichette esogene, che possono influire sul comportamento cellulare; ii) può fornire dati ad alta risoluzione su singole cellule sullo stato di attivazione delle NSC; e iii) non richiede la distruzione della cella 7,16. Questo protocollo delinea tre strategie per sfruttare l'autofluorescenza delle NSC per studiare gli stati cellulari quiescenti e attivati delle NSC15.

Recentemente, è stato riscontrato che le NSC isolate da topi maschi di 6 settimane provenienti dalla zona subgranulare dell'ippocampo, coltivate e messe in quiescenza in vitro 10,13,17,18,19,20,21, mostrano livelli aumentati di autofluorescenza puntata (PAF) che eccitano tra 400-600 nm ed emettono tra 500-700 nm. Questo segnale era specifico per le qNSC rispetto alle NSC15 attivate e cicliche. La capacità di separare visivamente queste due popolazioni senza l'uso di ulteriori marcatori anticorpali o reporter è utile per molte domande sperimentali sulla natura delle qNSC e delle uscite di quiescenza. Quindi, in primo luogo, questo protocollo descrive le strategie per visualizzare il PAF nelle qNSC utilizzando un microscopio confocale, che può essere utilizzato per identificare lo stato di attivazione delle NSC. In secondo luogo, questo protocollo descrive le strategie per rilevare il PAF utilizzando la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) e descrive ulteriormente come ordinare in base a questo segnale per arricchire qNSC o aNSC. Queste strategie forniscono una misura che può essere utilizzata per raggruppare e separare le NSC in base allo stato cellulare.

Per sviluppare un metodo a più alta risoluzione per separare le NSC non solo in stati distinti, ma anche durante la transizione attraverso l'uscita di quiescenza verso la piena attivazione, l'imaging del tempo di vita della fluorescenza (FLIM) è stato eseguito utilizzando un microscopio multifotone per visualizzare i tempi di vita dell'autofluorescenza NAD(P)H (denominato Canale 1) e dell'autofluorescenza verde (denominata Canale 2; che rileva sia l'autofluorescenza FAD che il PAF nelle qNSC) insieme alla loro intensità. Questo approccio sfrutta il fatto che le proprietà ottiche delle molecole nella cellula dipendono dalle loro proprietà fisiche16,22. Ad esempio, NAD(P) (NAD e NADP sono otticamente indistinguibili, e quindi NAD(P) è usato per riferirsi a entrambe le specie) non è autofluorescente allo stato ossidato ma è autofluorescente allo stato ridotto (NAD(P)H)23. Inoltre, ulteriori proprietà fisiche delle molecole autofluorescenti, come il loro stato di legame agli enzimi, possono essere estrapolate eseguendo l'imaging del tempo di fluorescenza 7,22,24. Ad esempio, il NAD(P)H ha una durata di fluorescenza più breve quando non è legato a un enzima22. Poiché le molecole autofluorescenti come il NAD(P)H, che è coinvolto in centinaia di reazioni metaboliche, vengono utilizzate in modo diverso dalle cellule che progrediscono attraverso diversi stati o comportamenti cellulari, questi cambiamenti possono essere rilevati e quantificati utilizzando un microscopio multifotone che rileva il tempo di vita dell'autofluorescenza23. Insieme all'abbondanza, o intensità, dell'autofluorescenza, queste misure forniscono informazioni multidimensionali per separare le NSC in uno stato cellulare o nell'altro e attraverso le transizioni dinamiche tra gli stati. In terzo luogo, questo protocollo descrive l'esecuzione, l'analisi e l'interpretazione delle misure FLIM e di intensità dei segnali del canale 1 (NAD(P)H) e del canale 2 (PAF) utilizzando un microscopio multifotone. In sintesi, questo protocollo descrive un toolkit su cellule vive, senza marcatura, per lo studio della quiescenza delle NSC che fornisce dati ad alta risoluzione su singole cellule sullo stato delle NSC.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutte le procedure di questo protocollo sono approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del Wisconsin-Madison.

1. Utilizzo di un microscopio confocale per l'imaging di PAF in qNSC e aNSC per identificare lo stato cellulare delle NSC

  1. Generare qNSC e aNSCs in vitro da colture primarie di NSC.
    1. Colture di NSC purificate da cervelli di topo adulto in un mezzo proliferativo per l'espansione (Tabella 1)18,20,21. Pertanto, per impostazione predefinita, le colture di NSC in vitro sono aNSC.
    2. Per generare qNSC, utilizzare il seguente protocollo per placcare le aNSC su vetreria rivestita e quindi trattarle con terreno qNSC per indurre la quiescenza per 3 giorni.
    3. Preparare la vetreria con un indice di rifrazione adatto per obiettivi a immersione in olio per l'adesione di NSC rivestendo prima con una soluzione di poli-L-ornitina (PLO; 10 mg/mL in acqua per la plastica, 50 mg/mL in acqua per il vetro) sufficiente a coprire il fondo del piatto (per un pozzetto per cuvette di imaging da 1 cm2 , utilizzare ~150 μL) per 1 ora a 37 °C in ddH2O.
    4. Rimuovere la soluzione di OLP e lavare 3 volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
    5. Rivestire con una soluzione di laminina (5 mg/mL) sufficiente a coprire il fondo della piastra (per una pozzetto della cuvetta per imaging da 1 cm2 , utilizzare ~150 μL) in PBS e incubare per almeno 3 ore a 37 °C o durante la notte.
    6. Rimuovere la soluzione di laminina, quindi aggiungere un terreno di coltura sufficiente a coprire il fondo della piastra (per un pozzetto della cuvetta per immagini da 1 cm2 , utilizzare ~150 μL).
    7. Preparare le cellule per la tripsinizzazione centrifugando le aNSC (possono iniziare come monostrati o neurosfere) a 120 x g per 4 minuti a temperatura ambiente (RT, ~25 °C).
    8. Tripsinizzare le aNSC pellettate della fase precedente in 100 μL di miscela di tripsina per 5 minuti a 37 °C e quindi spegnere la tripsinizzazione con 200 μL di miscela di inibitori della tripsina (Tabella 1).
    9. Lasciare riposare le NSC per 2 minuti, quindi triturarle meccanicamente pipettandole su e giù 10 volte.
    10. Aggiungere 5 mL di terreno aNSC e centrifugare le cellule a 120 x g per 4 minuti.
    11. Risospendere le NSC in 1 mL di terreno aNSC e placcare le cellule al 10%-20% di confluenza in terreno aNSC. Ad esempio, è possibile disporre di una piastra di ~5.000 cellule in un pozzetto di una cuvetta di imaging da 1 cm2 con terreno da 150 μL.
    12. Dopo aver lasciato aderire 24 ore affinché le aNSC aderiscano alla superficie della piastra, rimuovere il terreno aNSC e sostituirlo con un terreno qNSC sufficiente a coprire il fondo della piastra (per una cuvetta di imaging da 1 cm2, utilizzare ~150 μL; Tabella 1 - come precedentemente descritto 10,13,17,18) in pozzi in cui verrà indotta la quiescenza.
    13. Cambiare il terreno aNSC e qNSC almeno una volta ogni 2 giorni. Dopo 3 giorni in terreno qNSC, le NSC sono quiescenti e possono essere utilizzate per esperimenti di imaging.
  2. Utilizzare un microscopio confocale per l'imaging di qNSC e aNSC in vitro.
    NOTA: Ogni microscopio ha il suo software proprietario; Pertanto, segui questi passaggi eseguendo azioni analoghe per configurare un microscopio specifico. Questo protocollo fornirà istruzioni per lavorare in NIS-Elements.
    1. Configura il microscopio confocale per l'imaging in autofluorescenza.
      1. Fare clic su 405 Laser e digitare nella finestra di emissione all'interno del menu 405 Laser . Fare clic su TD per raccogliere un'immagine a luce trasmessa e impostare il valore HV per visualizzare il campione.
      2. Imposta la potenza del laser al 3,5% e il guadagno al 75. Impostare Zoom su 2. Imposta i parametri di scansione confocale, imposta Pixel Dwell su 0,5 e imposta Risoluzione su 2048 x 2048 pixel.
    2. Metti a fuoco le cellule sotto un obiettivo a immersione in olio ~60x utilizzando il campo chiaro per mettere a fuoco.
    3. Passa alla modalità di scansione confocale facendo clic su Eye Port, assicurandoti che il percorso della luce vada ora alla testa di scansione e che non ci sia alcun cubo del filtro nel percorso della luce.
    4. Il PAF è arricchito in qNSC ed è ampiamente eccitabile ed emettibile (vedi Figura 1). Scegliere la migliore configurazione ottica in base alle capacità del sistema utilizzando la Figura 1 come guida. Per il segnale più forte e pulito, eccita con un laser tra ~400-500 nm, raccogli ~580-620 nm e utilizza un obiettivo a immersione in olio ~60x.
      NOTA: L'imaging in autofluorescenza richiede potenze laser più elevate per eccitare rispetto ai tipici esperimenti di imaging. Se si esegue l'imaging di altre molecole autofluorescenti o di altre etichette insieme al PAF, progettare attentamente la configurazione ottica per evitare il passaggio nei canali di autofluorescenza.
    5. Acquisizione di immagini di autofluorescenza in qNSCs e aNSCs. Fare clic su Scansione, quindi mettere a fuoco l'immagine, quindi fare clic su Acquisisci. Per ottenere le immagini migliori, raccogli immagini su un singolo piano con il citoplasma delle cellule (basato su un'autofluorescenza più debole diffusa in tutta la cellula) a fuoco per ottenere una sezione trasversale rappresentativa di ciascuna cellula.
    6. Utilizzare una configurazione ottica identica (ad esempio, la stessa potenza laser) e campioni di immagine nello stesso giorno se si desidera confrontare direttamente immagini diverse.
    7. Le potenze esatte del laser e del rivelatore dipenderanno da ciascun sistema specifico. Inizia utilizzando basse potenze laser e poi aumentando lentamente le potenze fino a quando il segnale è rilevabile senza essere saturo.
  3. Analizza PAF in qNSC in tempo reale e aNSC in vitro.
    1. Dopo aver acquisito le immagini in autofluorescenza in qNSC o aNSC, quantificare le immagini aprendo un file in ImageJ25.
    2. Utilizzare l'opzione Elabora > filtri > Sfocatura gaussiana (Sigma: 2) sull'immagine dell'autofluorescenza qNSC/aNSC per attenuare i pixel irregolari.
    3. Usa Image > Adjust > Threshold per selezionare i pixel che rappresentano PAF (elimina i pixel di sfondo) e fai clic su Applica. Utilizza gli stessi parametri di soglia per tutte le immagini che verranno confrontate direttamente.
    4. Utilizzare il processo > binario > spartiacque per separare i PAF in stretta prossimità spaziale.
    5. Utilizzando il mouse del computer, disegnare una regione di interesse (ROI) attorno a una cellula, come determinato osservando un'immagine in campo chiaro o osservando l'autofluorescenza diffusa presente uniformemente in tutto il citoplasma della cellula.
      NOTA: In genere va bene escludere i processi periferici sottili e includere il nucleo poiché l'autofluorescenza non è tipicamente presente in queste posizioni e quindi non interromperebbe l'analisi.
    6. Utilizzare Analizza > Analizza particelle (Dimensioni: 0,1-infinito μm; Circolarità: 0-1) con riassunto selezionato.
      NOTA: ImageJ produrrà quindi una finestra di output con i dati sulle particelle nella regione di interesse, che consente la tabulazione del numero di PAF in ciascuna cella. Altre molecole fluorescenti possono essere abbinate all'imaging PAF. Tuttavia, poiché il PAF è un segnale relativamente debole, è importante verificare che altri fluorofori non sanguinino nel canale PAF. In genere, i fluorofori che assorbono 600+ nm ed emettono 650+ nm possono essere accoppiati con l'imaging PAF, come LipidSpot 610.

2. Utilizzo di FACS per arricchire lo stato di attivazione delle NSC in colture di NSC in base all'autofluorescenza

  1. Generare qNSC e aNSC come descritto nella sezione 1.
  2. Ordina una miscela di qNSC e aNSC vive in base all'autofluorescenza.
    NOTA: A titolo di esempio, questo protocollo discuterà come arricchire aNSC o qNSC in un campione generato mescolando qNSC e aNSC con un rapporto 1:1.
    1. Prima della tripsinizzazione e della selezione cellulare, marcare le cellule che progrediscono attraverso la fase S aggiungendo 10 μM di 5-etinil-2'-deossiuridina (EdU; un analogo della timidina che si incorpora nelle cellule che sintetizzano il DNA, come nella fase S del ciclo cellulare) al terreno di coltura cellulare per 1 ora.
    2. Tripsinizzare le qNSC e le aNSC come discusso nei passaggi 1.1.8, risospendere in 0,5 mL di tampone FACS (Tabella 1) e quindi metterle su ghiaccio.
      NOTA: le qNSC aderiscono fortemente alla capsula. A una confluenza relativamente più elevata, le qNSC possono essere dissociate meccanicamente dalla parabola. Tuttavia, se le qNSC si trovano a una confluenza relativamente più bassa o sono difficili da rimuovere meccanicamente dalla piastra mediante pipettaggio, utilizzare la tripsina per rimuoverle dalla capsula.
      1. Rimuovere il terreno di coltura dalle qNSC e aggiungere lo 0,25% di tripsina sufficiente a coprire il fondo della piastra (per una cuvetta per immagini da 1 cm2 , utilizzare ~150 μL), incubando per 3 minuti a 37 °C.
      2. Dopo l'incubazione, estinguere la reazione della tripsina aggiungendo un terreno corrispondente a ciascun tipo di cellula pari al volume di tripsina aggiunto. Dissociare meccanicamente le cellule dalla piastra prima della raccolta e della centrifugazione.
    3. Utilizzando un ugello da ~130 μm, analizzare qNSC e aNSC utilizzando un citometro a flusso o FACS con condizioni ottiche basate sulle capacità dello strumento e rilevare PAF come mostrato nella Figura 1. Ad esempio, utilizzare un laser a 405 nm per eccitare il campione e utilizzare un filtro da 580-620 nm per il rilevamento.
    4. Raccogliere almeno 10.000 qNSC singoletto e aNSC in un file di dati e quindi utilizzarli per progettare gate per raccogliere un arricchimento di qNSC o aNSC. Ad esempio, impostare i gate per raccogliere il 25% superiore o inferiore delle NSC in base all'intensità dell'autofluorescenza nel campione misto aNSC:qNSC (1:1).
    5. Dopo aver impostato i cancelli per selezionare i singoletti con autofluorescenza più luminosa o più debole come descritto sopra, suddividere le cellule in pozzetti rivestiti di LAMININA riempiti con terreno aNSC (10.000 cellule/cm2, vedere il passaggio 1.1.3).
    6. Dopo il FACS, lasciare che le NSC rimangano per 3 ore nell'incubatrice. Fissare le cellule trattandole con il 4% di paraformaldeide sufficiente a coprire il fondo della capsula (per una cuvetta di imaging da 1 cm2 , utilizzare ~150 μL) per 15 minuti a RT.
      NOTA: Per visualizzare l'EdU nelle celle, è più semplice ottenere un kit commerciale per il rilevamento dell'EdU e seguire il protocollo raccomandato dal produttore.
    7. In primo luogo, permeabilizzare le cellule mediante trattamento con tritoni allo 0,25% in PBS per 15 minuti a RT.
    8. Successivamente, trattare le cellule con una soluzione colorante EdU a RT per 30 minuti.
      NOTA: La composizione precisa della soluzione di colorazione EdU varia a seconda della fonte dei reagenti, ma consiste approssimativamente in un tampone di reazione, un additivo tampone di reazione, solfato di rame e una molecola modificata con alchino o azide. Vedere la Tabella dei materiali per un kit consigliato.
    9. Dopo la colorazione per visualizzare l'EdU, lavare i campioni 3 volte per 10 minuti con PBS.

3. Utilizzo di un microscopio multifotone per rilevare l'autofluorescenza del canale 1 e del canale 2 ed eseguire FLIM su NSC in vitro per identificare le popolazioni e le transizioni dello stato cellulare delle NSC

NOTA: Ogni microscopio ha il suo software proprietario; Pertanto, segui questi passaggi eseguendo azioni analoghe per configurare un microscopio specifico. Questo protocollo fornirà le istruzioni per lavorare in Prairie View.

  1. Generare qNSC e aNSC come descritto nella sezione 1.
  2. Configura il microscopio multifotone per l'imaging della durata della fluorescenza.
    1. Utilizzare un obiettivo con ingrandimento 40x o superiore (~1,15 NA).
    2. Utilizzare un microscopio multifotone con i seguenti componenti o equivalenti: un laser ultraveloce sintonizzabile, un dicroico a passaggio lungo da 720 nm, un tubo fotomoltiplicatore (PMT) al fosfuro di arseniuro di gallio (GaAsP), un'elettronica di conteggio di singoli fotoni correlata al tempo e un misuratore di potenza analogico.
    3. Per l'imaging del canale 1, impostare il laser sintonizzabile su 750 nm e utilizzare un cubo con filtro di emissione da 440/80 nm. Per l'imaging del canale 2, impostare il laser su 890 nm e utilizzare un cubo con filtro di emissione da 550/100 nm.
      NOTA: Spegnere le luci della stanza prima che i PMT vengano accesi.
  3. Funzione di risposta dello strumento
    1. Acquisisci una funzione di risposta dello strumento (IRF) visualizzando un cristallo di urea frantumato per tenere conto della risposta temporale dello strumento nel decadimento misurato.
      NOTA: L'IRF è convoluto con il decadimento per calcolare con precisione la curva di adattamento del decadimento. Per l'acquisizione, il laser è impostato su 890 nm e viene utilizzato il cubo del filtro di emissione 440/80 nm. Il GaAsP PMT è impostato su un guadagno di 800 e i pockels (potenza laser) sono impostati inizialmente molto bassi, di solito 1.
    2. Selezionare un campo visivo con l'Urea cristallina e aumentare leggermente i buchi (fino a un massimo di 15).
    3. Successivamente, acquisire un'immagine utilizzando gli stessi parametri utilizzati per l'imaging cellulare: discriminatore a frazione costante (CFD) 1 x 104 - 1 x 105, risoluzione 256 x 256, tempo di permanenza impostato a 4,8 μs, zoom ottico impostato a 1,5x e un tempo di integrazione di 60 s.
  4. Esecuzione dell'imaging del tempo di vita della fluorescenza e dell'imaging dell'intensità per l'autofluorescenza del canale 1 e del canale 2 su qNSC e aNSC in vitro
    1. Trova un campo visivo per l'immagine: utilizza gli oculari per trovare un campo visivo adatto e modifica il percorso della luce verso il campione sul microscopio per consentire l'imaging.
      NOTA: Verrà acquisita per prima un'immagine del Canale 1, seguita da un'immagine del Canale 2 dello stesso campo visivo.
    2. Configurazione per la raccolta dell'immagine del canale 1: fare clic sulla scheda Potenza/Guadagno e impostare il guadagno sul PMT su 800, fare clic sulla scheda Laser 2-P e selezionare 750 nm per il laser e assicurarsi che venga utilizzato il cubo del filtro appropriato (440/80 nm).
    3. Raccogli l'immagine del canale 1.
      1. Avvia la modalità Anteprima andando alla scheda Potenza/Guadagno e impostando i Pockels su 30, quindi andando alla sezione Scansione di quella schermata e facendo clic su Live Scan.
      2. Aumentare i Pockels per trovare un buon campo visivo a bassa potenza laser (inferiore a 3,6 mW). Una volta trovato il campo visivo, regolare i Pockels in modo che il misuratore di potenza legga ~3,6 mW sulla potenza dopo la cella Pockel e il discriminatore a frazione costante (CFD) nella scheda Count Rates misuri 1 x 104 - 1 x 105.
    4. Vai alla sezione Scansione e fai clic su Scansione singola una volta soddisfatti questi parametri. Questo acquisirà un'immagine del Canale 1 oltre 60 s.
    5. Per raccogliere un'immagine del Canale 2, fare clic sulla scheda Laser 2-P e selezionare 890 nm per il laser, scambiare il cubo del filtro con il cubo di emissione del Canale 2 (550/100 nm).
    6. Avvia la modalità di anteprima come descritto in 3.4.3, aumenta i Pockels fino a quando il misuratore di potenza legge ~7 mW e i conteggi CFD sono di nuovo 1 x 104 -1 x 105.
    7. Vai alla sezione Scansione e fai clic su Scansione singola una volta soddisfatti questi parametri. Questo acquisirà un'immagine del Canale 2 oltre 60 s.
    8. Acquisire più immagini - Dopo aver acquisito un'immagine del Canale 1 e del Canale 2, trovare un nuovo campo visivo e ripetere i passaggi 3.4.2 - 3.4.4. In genere, la raccolta di 4-6 campi visivi per l'immagine di ~50-100 celle è sufficiente per una condizione in un esperimento.
      NOTA: mCherry può essere utilizzato come etichetta fluorescente aggiuntiva senza sbavature nei canali del Canale 1 e del Canale 2.
  5. Analizza le immagini fluorescenti a vita.
    1. Generare matrici di decadimento per immagini del tempo di vita della fluorescenza in SPCImage seguendo i passaggi 3.5.2-3.1.14.
      NOTA: Per ulteriori informazioni, consultare i manuali aggiornati disponibili gratuitamente online26.
    2. Aprire SPCImage e aprire l'immagine IRF FLIM raccolta nella sezione 3.3.
    3. Regolare le barre nere verticali nell'istogramma in modo che siano limitate alla curva di decadimento IRF. Dalla barra dei menu in alto, fai clic su IRF > Copia negli appunti.
    4. Aprire un file immagine FLIM all'interno del set di dati da analizzare, ottenuto nella sezione 3.4.
    5. Dalla barra dei menu in alto, fai clic su IRF > Incolla dagli appunti.
    6. In basso a destra del software, impostare Componenti su 2.
    7. Nella barra dei menu in alto del software, fai clic su Opzioni > modello. Selezionare quindi MLE per Metodo di adattamento, Binning spaziale al quadrato, Soglia al picco e in Impostazioni selezionare Decadimento multiesponenziale.
    8. In basso a sinistra del software, aumentare Bin fino a quando la conta dei fotoni non è almeno 100 nei pixel citoplasmatici rappresentativi al picco della conta dei fotoni immediatamente dopo l'eccitazione.
    9. In basso a sinistra del software, impostare la Soglia. Per il canale 1 utilizzare una soglia di "50". Per il canale 2, utilizzare una soglia pari a "0".
    10. Nella barra dei menu in alto del software (questo protocollo descrive come utilizzare la versione 8.3), fare clic su Calcola > matrice di decadimento.
      NOTA: Assicurarsi che i valori di Chi2 siano ~0,8-1,2 in tutta l'immagine. Ciò conferma che i dati saranno robusti convalidando la modellazione del decadimento biesponenziale.
    11. Nella barra dei menu in alto, fai clic su File > Salva.
    12. Nella barra dei menu in alto del software, fai clic su File > Esporta ed esporta quanto segue:
      Valore con codice colore, T1, T2, Chi2, intensità pixel, A1[%], A2[%] e immagine con codice colore (con legenda)
      NOTA: Ora SPCImage è impostato per eseguire un processo batch, analizzando tutte le immagini di un determinato canale (analizzare insieme le immagini FLIM del canale 1 e quindi ripetere a partire dal passaggio 3.5.2 per le immagini FLIM del canale 2).
    13. Per eseguire un'elaborazione batch, fare clic su Calcola > elaborazione batch e selezionare le immagini FLIM da elaborare.
    14. Nella barra dei menu in alto, fare clic su File > Esporta > Esportazione batch e selezionare le matrici di decadimento da esportare (generate nel passaggio precedente).
    15. Utilizzare CellProfiler per creare maschere citoplasmatiche seguendo i passaggi 3.5.16-3.5.24.
      NOTA: Per fare ciò, i nuclei saranno manualmente attorno alle immagini di intensità del Canale 1, dove il nucleo è nero e chiaramente visibile. Quindi una pipeline CellProfiler manual_segmentation.cpproj27 (File supplementare 1) produrrà automaticamente un'intera cellula e una maschera citoplasmatica, come indicato dalla maschera nucleare. In alternativa, i nuclei possono essere marcati con mCherry e visualizzati insieme all'autofluorescenza del canale 1 e del canale 2 per fornire la capacità di automatizzare l'identificazione dei nuclei. Molti coloranti nucleari convenzionali, tuttavia, sanguinano spettralmente nei canali di autofluorescenza e quindi sono incompatibili con questa tecnica.
    16. In R Studio usare R_ASCtoTIFF.rmd27 (file supplementare 2) per convertire i file X_photons.asc , dove X è il nome dell'immagine acquisita dall'immagine del canale 1 impostata sui file TIF.
    17. Aprire Cell Profiler e aprire manual_segmentation.cpproj.
    18. Caricare le TIF dei fotoni del canale 1 create nel passaggio 3.5.16 nel passaggio Immagini nella parte superiore della pipeline.
    19. Nei 3 passaggi inferiori della pipeline denominata SaveImages impostare un percorso di salvataggio per le maschere generate da CellProfiler.
    20. Fare clic su Avvia modalità test in basso a sinistra di CellProfiler.
    21. Fare clic su Esegui in basso a sinistra di CellProfiler. Quando CellProfiler arriva al passaggio IdentifyObjectsManually , viene visualizzata una finestra che mostra l'immagine corrente del Canale 1 in fase di elaborazione.
    22. Fare clic sul tasto F sulla tastiera, quindi disegnare manualmente una traccia dei nuclei di una cellula tenendo premuto il pulsante sinistro del mouse. Dopo aver tracciato i nuclei, rilasciare il pulsante sinistro del mouse. Ripeti questo passaggio per tutte le celle dell'immagine.
    23. Fare clic su Fine in basso a destra nella finestra pop-up con l'immagine dell'intensità. Il software completerà ora la pipeline ed esporterà maschere citoplasmatiche, nucleari e cellulari totali.
    24. In basso a sinistra, fai clic su Set immagini successivo e ripeti i passaggi 3.5.21-3.5.23 per tutte le immagini TIF del canale 1.
    25. Utilizzare lo script R (Integrate decay matrices and cytoplasmic masks.rmd) per integrare le matrici di decadimento generate nei passaggi 3.5.2-3.5.14 e le maschere citoplasmatiche generate nei passaggi 3.5.15-3.5.24 per ottenere le variabili di imaging del tempo medio di fluorescenza per il citoplasma di ciascuna cellula seguendo i passaggi 3.5.26-3.5.30
    26. Utilizzando un foglio di calcolo (ad esempio, Microsoft Excel), crea un documento .csv intitolato test_key27 [File supplementare 3] per un esempio) con 3 colonne.
    27. Assegnare alle colonne un titolo come Cartella, NADH e FAD. Compilare la tabella per elencare la posizione della cartella nella cartella, quindi il prefisso del titolo dell'immagine in NADH e FAD, rispettivamente, per collegare ciascuna immagine del canale 1 a ciascuna immagine del canale 2 (vedere i dati di esempio - Tabella 2).
  6. In R Studio, apri Integrate decay matrices and cytoplasmic masks.rmd27(Supplementary File 4).
    1. Impostare i seguenti percorsi di file come annotato nello script: Imposta directory di lavoro, Percorso file canale 1, Percorso file FAD, Percorso file maschera e Percorso e nome del file di output.
    2. Eseguire l'intero script. Una volta completato con successo lo script, verrà generato un file di output, inclusi i metadati e le variabili FLIM medie.
    3. Eseguire l'analisi utilizzando l'autofluorescenza FLIM data.rmd27 (Supplementary File 5) o utilizzando qualsiasi altro software di analisi.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Imaging confocale in autofluorescenza per separare lo stato delle cellule NSC (Figura 1)
Per utilizzare la microscopia confocale per risolvere lo stato di attivazione delle NSC, le qNSC e le aNSC sono state generate in vitro utilizzando un mezzo di attivazione o un mezzo di quiescenza, come descritto in precedenza 10,13,17,18. Per rilevare la PAF nelle NSC, le qNSC e le aNSC vive sono state acquisite utilizzando la stessa esposizione su un microscopio confocale (Es: 405 nm, Em: 580-620 nm). Le qNSC hanno mostrato un numero maggiore di PAF rispetto alle aNSC (Figura 1A, B). Questa scoperta illustra come le proprietà dell'autofluorescenza possano essere utilizzate come marcatori per identificare lo stato cellulare di qNSC e aNSCs.

Arricchimento FACS dello stato cellulare delle NSC mediante autofluorescenza (Figura 2)
Per arricchire lo stato del ciclo cellulare utilizzando FACS, qNSCs e aNSCs sono stati generati in vitro 10,13,17,18,19 come descritto in questo protocollo e pre-marcati con EdU per 1 ora prima della tripsinizzazione e analizzati nel citometro a flusso per marcare le cellule che progrediscono attraverso la fase S. Le qNSC e le aNSC sono state quindi analizzate mediante citometria a flusso, separatamente o miscelate con un rapporto di 1 qNSC:1 aNSC (Figura 2


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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive una tecnica di risoluzione di singole cellule su cellule vive, senza marcatura, non distruttiva, che consente la classificazione dello stato cellulare delle NSC in vitro attraverso l'imaging di segnali autofluorescenti nelle NSC. Questo approccio rileva i cambiamenti metabolici che si verificano durante l'uscita dalla quiescenza delle NSC, che influenzano le proprietà ottiche dei cofattori metabolici, come il NAD(P)H, e offre molti vantaggi rispetto alle tecnologie esistenti per studiare la quiescenza delle NSC. Ad esempio, molte tecniche convenzionali per lo studio di qNSC e aNSCs, come la marcatura con marcatori del ciclo cellulare come EdU, richiedono la fissazione dei campioni. I metodi attualmente esistenti in grado di studiare le NSC vive sono ulteriormente limitati dal richiedere l'introduzione di marcature esogene, tipicamente generando transgeni codificanti proteine fluorescenti. Questi strumenti sono limitati sia nelle risorse necessarie per generarli che in molti avvertimenti tecnici. Ad esempio, le proteine del filamento intermedio nestina e la proteina acida fibrillare gliale (GFAP) sono comunemente usate come marcatori di qNSC e aNSC 12,13,18,28,29. Tuttavia, è noto che la nestina e la GFAP sono espresse in modo differenziale tra qNSC e aNSC 12,13,18,28,29. Inoltre, l'imaging in autofluorescenza fornisce dati ad alta risoluzione su singole cellule, che possono svelare l'eterogeneità di singole cellule che viene persa o complicata da interpretare in esperimenti che culminano in un'analisi di massa di una popolazione di cellule.

Tuttavia, l'imaging in autofluorescenza presenta anche diverse limitazioni. Molti dei segnali autofluorescenti vengono persi con la fissazione cellulare. Pertanto, l'imaging in autofluorescenza è in gran parte limitato allo studio delle cellule viventi. L'imaging in autofluorescenza si basa anche sulla mancanza di fluorofori introdotti esogenamente, che possono sanguinare nei canali autofluorescenti. Sebbene molti fluorofori possano essere compatibili con l'imaging in autofluorescenza in situazioni specifiche, l'abbinamento dell'imaging in autofluorescenza con molti strumenti esistenti non è sempre possibile. L'imaging su cellule vive può anche indurre fototossicità. Un'iterazione dell'imaging che utilizza questo protocollo non induce una fototossicità sufficiente a ridurre la vitalità delle NSC. Tuttavia, l'imaging ripetuto delle cellule in un corso temporale a intervalli più frequenti molte volte al giorno può generare una fototossicità significativa e, quindi, non è una strategia praticabile per studiare la quiescenza delle NSC. Infine, sebbene l'imaging in autofluorescenza possa essere utilizzato per studiare le NSC da topi maschi di 6 settimane provenienti dall'ippocampo o dai ventricoli laterali, non è chiaro quanto ampiamente questa tecnica possa essere utilizzata per studiare le NSC da altre fonti, età o altri tipi di cellule staminali.

Il protocollo qui descritto presuppone anche una produzione accurata di qNSCs e aNSCs in vitro utilizzando i protocolli precedentemente stabiliti 10,13,17,18,19. Se la riproduzione dei risultati di questo protocollo è impegnativa, assicurarsi che le qNSC e le aNSC vengano generate correttamente sondando la presenza o l'assenza di vari marcatori di qNSC e aNSC, come descritto in precedenza 10,13,17,18,19. Nel complesso, l'imaging in autofluorescenza fornisce un nuovo approccio tecnico per identificare qNSC e aNSC e studiare le uscite di quiescenza delle NSC.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo il nucleo di citometria a flusso UW-Madison (P30 CA014520 e 1S10RR025483-01) e i membri del laboratorio Moore e della comunità UW-Madison per il loro contributo. Ringraziamo le nostre fonti di finanziamento: NIH T32 T32GM008688 (a C.S.M.), Diana Jacobs Kalman Fellowship di AFAR (a C.S.M.), Wisconsin Graduate Fellowship (a C.S.M.), DP2 NIH New Innovator Award (1DP2OD025783, a D.L.M.), Vallee Scholar Award (a D.L.M.), NIH 1R56NS130450 (a D.L.M e M.C.S.), R01 CA185747 (a M.C.S.), R01 CA205101 (a M.C.S.), R01 CA211082 (a M.C.S.) e la National Science Foundation Grant No. CBET-1642287 (a M.C.S.).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Obiettivo ad acqua 40xNikonMRD77410Obiettivo utilizzato nel microscopio multifotone nella Parte 3
Cuvetta a 8 pozzettiIbidi80826-90Per l'imaging di aNSC/qNSC
Misuratore di potenza analogicoThorlabsPM100AUtilizzato nel microscopio multifotone nella Parte 3
Antibiotico-Antimicotico (100X) (PSF)Thermo Fisher15240062Antibiotico per terreni NSC
B-27Invitrogen17504044Integratore nutritivo per terreni NSC
BMP4Fisher Scientific5020BP010Fattore per indurre la quiescenza
Albumina sierica bovinaSigmaA4919-25GPer la produzione di
laser ultraveloce BMP4 ChameleonLaser coerenteN/Autilizzato nel microscopio multifotone nel
microscopioconfocale Parte 3Microscopio NikonC2utilizzato per la Parte 1
DMEM/F-12 (senza GlutaMAX)Invitrogen11320033Terreni di base per NSC
DNAseSigma D5025-15KUAggiunto all'inibitore della tripsina
Kit di test EdUInvitrogenC10337Saggio di proliferazione per colture cellulari
EGFPeproTechAF-100-15-500UGFattore di crescita per terreni NSC
FGFPeproTech100-18BFattore di crescita per terreni NSC
Selezionatore di cellule attivate fluorescentiBDFACSAriaSelezionatore di cellule attivate fluorescenti utilizzato per la Parte 2
EparinaSigmaH3149-50KUAdditivo per terreni NSC
L-15Invitrogen21083027Per la preparazione della soluzione inibitrice della tripsina
LamininSigmaL2020-1MGPer il rivestimento della vetreria
Nikon TiE microscopio invertitoNikonN/ATelaio del microscopio Utilizzato per la Parte 3
PLOSigmaP3655-100MGPer il rivestimento della vetreria
SPC-150 Elettronica per il conteggio dei singoli fotoniBecker e HicklN/AUtilizzato nel microscopio multifotone nella Parte 3
Tripsina (per la tripsinizzazione di pellet di aNSC che crescevano come sfere o monostrati)Gibco15090046Per la tripsinizzazione di neurosfere o aNSC aderenti
Tripsina (per la tripsinizzazione di qNSC)Gibco25200072Per la tripsinizzazione di qNSC aderenti
Inibitore della tripsinaSigmaT6522-100MGPer l'inibizione della tripsinizzazione di aNSCs
Cristalli di ureaSigmaU5128-5GUtilizzato per raccogliere un IRF
VerseneThermo Fisher15040066Per preparare la tripsina

References

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