Method Article

Valutazione fisiopatologica retinica in un modello di ratto

DOI:

10.3791/63111

⸱

May 6th, 2022

 , 
1Translational Pharmaceutics Research Laboratory (TPRL), Department of Pharmacy, Birla Institute of Technology & Science — Pilani, Hyderabad Campus

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La retinopatia diabetica è una delle principali cause di cecità. L'istologia, il test di rottura della barriera emato-retinica e l'angiografia a fluorescenza sono tecniche preziose per comprendere la fisiopatologia della retina, che potrebbe migliorare ulteriormente l'efficiente screening farmacologico contro la retinopatia diabetica.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Una malattia dell'occhio del segmento posteriore come la retinopatia diabetica altera la fisiologia della retina. La retinopatia diabetica è caratterizzata da un distacco di retina, dalla rottura della barriera emato-retinica (BRB) e dall'angiogenesi retinica. Un modello di ratto in vivo è un prezioso strumento sperimentale per esaminare i cambiamenti nella struttura e nella funzione della retina. Proponiamo tre diverse tecniche sperimentali nel modello di ratto per identificare i cambiamenti morfologici delle cellule retiniche, della vascolarizzazione retinica e della BRB compromessa. L'istologia retinica viene utilizzata per studiare la morfologia di varie cellule retiniche. Inoltre, la misurazione quantitativa viene eseguita mediante conteggio delle cellule retiniche e misurazione dello spessore di diversi strati retinici. Un test di degradazione BRB viene utilizzato per determinare la perdita di proteine extraoculari dal plasma al tessuto vitreo a causa della rottura di BRB. L'angiografia a fluorescenza viene utilizzata per studiare l'angiogenesi e la perdita dei vasi sanguigni visualizzando la vascolarizzazione retinica utilizzando il colorante FITC-destrano.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La retinopatia diabetica (DR) è una delle complicanze secondarie più complesse del diabete mellito. È anche la principale causa di cecità prevenibile nella popolazione in età lavorativa in tutto il mondo. In una recente meta-analisi di 32,4 milioni di persone non vedenti, 830.000 (2,6%) persone erano cieche a causa di DR1. La percentuale di perdita della vista attribuita al diabete si è classificata settima nel 2015 all'1,06% (0,15-2,38) a livello globale2,3.

La retinopatia diabetica è diagnosticata da anomalie vascolari nei tessuti oculari posteriori. Clinicamente, è diviso in due fasi: DR non proliferativo (NPDR) e DR proliferativo (PDR), basato sulla vascolarizzazione nella retina. L'iperglicemia è considerata il potente regolatore della DR in quanto coinvolge diversi percorsi coinvolti nella neurodegenerazione4,5, nell'infiammazione6,7 e nella microvascolarizzazione8 nella retina. Molteplici complicanze metaboliche indotte a causa dell'iperglicemia includono l'accumulo di prodotti finali avanzati di glicazione (AGE), la via poliolica, la via esosamina e la via proteina chinasi-C. Queste vie sono responsabili della proliferazione cellulare (cellule endoteliali), della migrazione (periciti) e dell'apoptosi (cellule retiniche neurali, periciti e cellule endoteliali) basate su diversi stadi della retinopatia diabetica. Queste alterazioni metaboliche possono portare a cambiamenti fisiologici come il distacco della retina, la perdita di cellule retiniche, la rottura della barriera emato-retinica (BRB), gli aneurismi e l'angiogenesi9.

Il diabete di tipo 1 indotto da streptozotocina (STZ) è una pratica ben consolidata e ben accettata nei ratti per valutare la patogenesi del diabete e le sue complicanze. Gli effetti diabetogeni della STZ sono dovuti alla distruzione selettiva delle cellule β delle isole pancreatiche10. Di conseguenza, gli animali subiranno carenza di insulina, iperglicemia, polidipsia e poliuria, che sono tutti caratteristici del diabete mellito di tipo 1 umano11. Per l'induzione del diabete grave, STZ viene somministrato a 40-65 mg / kg di peso corporeo per via endovenosa o intraperitoneale durante l'età adulta. Dopo circa 72 ore, questi animali presentano livelli di glucosio nel sangue superiori a 250 mg/dL10,12.

Per comprendere le alterazioni fisiologiche della retina dovute alla neurodegenerazione, all'infiammazione e all'angiogenesi, diverse tecniche dovrebbero essere ottimizzate in modelli animali sperimentali. I cambiamenti strutturali e funzionali nelle cellule retiniche e nei vasi retinici possono essere studiati con varie tecniche come l'istologia, il saggio di degradazione BRB e l'angiografia a fluorescenza.

L'istologia comporta lo studio dell'anatomia di cellule, tessuti e organi a livello microscopico. Stabilisce una correlazione tra la struttura e la funzione delle cellule/tessuti. Vengono eseguiti diversi passaggi per visualizzare e identificare le alterazioni microscopiche nella struttura dei tessuti, confrontando così le controparti sane e malate13. Quindi, è essenziale standardizzare meticolosamente ogni fase dell'istologia. Vari passaggi coinvolti nell'istologia retinica sono la fissazione del campione, il taglio del campione, la disidratazione, la pulizia, l'impregnazione con paraffina, l'incorporamento di paraffina, il sezionamento e la colorazione (colorazione di ematossilina ed eosina)13,14.

In una retina sana, il trasporto di molecole attraverso la retina è controllato da BRB, composto da cellule endoteliali e periciti sul lato interno e cellule epiteliali pigmentate retiniche sul lato esterno. Tuttavia, le cellule endoteliali BRB interne e i periciti iniziano a degenerare durante la condizione di malattia e anche la BRB è compromessa15. A causa di questa rottura del BRB, molte molecole a basso peso molecolare fuoriescono nel tessuto vitreo e retinico16. Con il progredire della malattia, molte altre molecole proteiche (a basso e alto peso molecolare) fuoriescono anche nel tessuto vitreo e retinico a causa di disturbi dell'omeostasi17. Porta a varie altre complicazioni e, infine, edema maculare e cecità. Quindi, quantificare i livelli di proteine nel vitreo e confrontare le misure degli stati sani e diabetici ha compromesso il BRB.

L'angiografia a fluorescenza è una tecnica utilizzata per studiare la circolazione sanguigna della retina e della coroide utilizzando colorante fluorescente. Viene utilizzato per visualizzare la vascolarizzazione della retina e della coroide iniettando colorante alla fluoresceina per via endovenosa o iniezione cardiaca18. Una volta iniettato, il colorante raggiunge prima le arterie retiniche, seguite dalle vene retiniche. Questa circolazione del colorante viene solitamente completata entro 5-10 minuti dall'iniezione del colorante19. È una tecnica importante per diagnosticare varie malattie oculari del segmento posteriore, tra cui la retinopatia diabetica e la neovascolarizzazione coroidale20. Aiuta a rilevare i cambiamenti vascolari maggiori e minori in condizioni normali e malate.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo segue tutte le linee guida per la cura degli animali fornite dal Comitato etico istituzionale degli animali, BITS-Pilani, campus di Hyderabad.

1. Istologia retinica

  1. Enucleazione e fissazione dell'occhio
    1. Eutanasia di un ratto maschio Wistar diabetico di 2-3 mesi insieme al controllo di pari età (da 14 a 15 settimane) utilizzando un'alta dose di pentobarbital (150 mg / kg) iniettato attraverso la via intraperitoneale. Nessun battito cardiaco rilevabile conferma la morte entro 2-5 minuti.
    2. Enucleare l'occhio facendo incisioni usando una lama di bisturi sulle regioni nasali e temporali dell'occhio. Quindi tagliare lungo i bordi usando pinze e micro forbici per rimuovere l'occhio dalla cavità orbitale.
      NOTA: Prima di sacrificare i ratti, tenere pronte le soluzioni fissative.
      ATTENZIONE: La formaldeide irrita la pelle, gli occhi, il naso e le vie respiratorie. Può anche causare il cancro in quanto è un potente sensibilizzante della pelle. Indossare guanti e maneggiarli sotto il cofano21.
    3. Lavare accuratamente l'occhio con 10 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) in una capsula di Petri per rimuovere il sangue. Rimuovere il grasso in eccesso che circonda l'occhio per una facile penetrazione della soluzione fissativa.
    4. Posizionare immediatamente l'occhio in 5 ml di soluzione fissativa con l'aiuto di una pinza e assicurarsi che non sia attaccato alle pareti delle fiale di vetro. Mescolare delicatamente per alcuni secondi e sostituire il tappo con un'etichettatura adeguata. Incubare l'occhio in soluzione fissativa per 24-48 ore in condizioni di buio a temperatura ambiente.
  2. Taglio del tessuto
    1. Dopo la fissazione, rimuovere l'occhio dalla soluzione fissativa, lavare con 10 ml di PBS e metterlo in una capsula di Petri contenente 10 ml di PBS refrigerato a 4 °C.
    2. Usando micro pinze, tieni l'occhio con il nervo ottico e fai un nick a pars plana con l'aiuto di micro forbici. Tagliare l'intero margine della cornea per separare la coppa anteriore di un occhio. Usando la pinza, scegli delicatamente la lente, scartala e taglia il nervo ottico.
    3. Usando micro forbici curve, crea una sezione longitudinale della oculare posteriore, passando attraverso il disco ottico dividendolo in due metà. Posizionarlo nella base della cassetta e chiudere correttamente il coperchio senza alcun disturbo al tessuto. Etichettare le cassette con il nome e la data del campione di tessuto.
  3. Disidratazione, pulizia e impregnazione di paraffina del tessuto
    1. Disidratare il tessuto tagliato mediante trasferimento graduale in 80 ml di etanolo al 50%, 70%, 90% e 100%. Durante il trasferimento delle cassette da una concentrazione all'altra, assicurarsi di tamponarle su carta velina pulita per ridurre al minimo la contaminazione.
      NOTA: Lasciare riposare il tessuto in ogni trasferimento per 30 minuti (due volte). Il tempo totale impiegato per questo passaggio è di circa 4 ore.
    2. Dopo la disidratazione, trasferire le cassette in 80 ml di xilene per 30 minuti (due volte) per sostituire l'etanolo con xilene.
      NOTA: Dopo l'incubazione con xilene, il tessuto diventa traslucido.
      ATTENZIONE: Lo xilene è un composto aromatico con un anello benzenico. Irrita l'occhio e le mucose e può anche causare depressioni.
    3. Infine, impregnare il tessuto con paraffina preriscaldata a 60 °C per sostituire lo xilene nel tessuto. Tamponare le cassette più volte su carta velina per ridurre al minimo il contenuto di xilene e inserire 200 mL di paraffina (liquido a 60 °C) per 2 ore (1 ora x 2).
      ATTENZIONE: Evitare di inalare paraffina fusa, in quanto produce minuscole goccioline lipidiche che possono causare disagio respiratorio.
  4. Incorporamento di paraffina
    1. Accendere la macchina incorporatrice di paraffina almeno 1 ora prima dell'uso per fondere la paraffina e per le stazioni per raggiungere le temperature desiderate. Riempire uno stampo in acciaio con cera di paraffina fusa posizionandolo su una superficie calda, quindi rimuovere una cassetta alla volta dal contenitore di paraffina.
    2. Spostare lo stampo in acciaio da una superficie calda a una fredda (4 °C). A questo punto, la cera nello stampo inizierà a solidificarsi. Prima che si solidifichi completamente, posizionare il tessuto in cera con l'aiuto di una pinza e orientare il tessuto in modo che la porzione del disco ottico della coppa posteriore sia rivolta verso la base dello stampo.
      NOTA: Assicurarsi che il tessuto non si muova e mantenere l'orientamento desiderato. In caso contrario, rimettere lo stampo sul piano di lavoro caldo fino a quando l'intera paraffina non si liquefa, quindi ricominciare con il passaggio 1.4.2.
    3. Quando la cera nello stampo inizia a solidificarsi, posizionare immediatamente la base della cassetta sopra lo stampo. Riempire con cura lo stampo con paraffina sopra il bordo superiore della cassetta e trasferirlo lentamente su una superficie fredda (vicino a -20 °C) per una rapida solidificazione. Fino a quando non si solidifica, ripetere il processo con altre cassette dal passaggio 1.4.2.
    4. Una volta solidificati tutti gli stampi, separare lo stampo in acciaio dalla cassetta. Se è difficile, attendi un po 'più a lungo e riprova (non rimuoverlo con forza). La separazione diventa più facile con la completa solidificazione. Ora la cassetta diventa la base del blocco di paraffina da tenere durante il sezionamento per microtomo.
      NOTA: questo blocco può essere conservato a temperatura ambiente per un ulteriore utilizzo. A questo punto, il processo può essere interrotto e continuato in seguito (se necessario).
  5. Taglio
    1. Installare una lama microtomatica monouso nel supporto della lama. Rimuovere la cera di paraffina in eccesso intorno alle cassette in modo che sia la parte superiore che quella inferiore dei blocchi rimangano parallele al coltello. Montare il blocco sul supporto della cassetta.
    2. Sblocca il volantino per farlo avanzare fino a quando la superficie del blocco è a contatto con il bordo del coltello. Tagliare la cera di paraffina in eccesso sul blocco fino a quando il tessuto non viene visualizzato sulla superficie del blocco. Impostare lo spessore della sezione a 5 μm e tagliare un nastro da cinque a sei sezioni.
    3. Utilizzando una pinza, trasferire delicatamente il nastro sulla superficie del bagno d'acqua preriscaldato (circa 50 °C) per aprire il nastro. Raccogli sezioni su una diapositiva di vetro rivestita con l'albumina di Mayer tenendo la diapositiva sotto la sezione. Sollevare delicatamente le sezioni e lasciare asciugare orizzontalmente le diapositive durante la notte a 37 °C.
      NOTA: le diapositive possono essere conservate a temperatura ambiente in scatole asciutte per diversi mesi. In questa fase, il processo può essere interrotto e continuato in un secondo momento.
  6. Macchiatura
    1. Riscaldare i vetrini da colorare in un forno ad aria calda a 60 °C per 1 ora prima dell'uso per la fusione della paraffina e seguire i passaggi indicati nella tabella 1.
      ATTENZIONE: Le macchie di ematossilina ed eosina sono tossiche se inalate o ingerite. Sono stati segnalati come cancerogeni.
ReagenteTempo in piediRipetizione (numero di volte)
Xilene5 minuti2
100% Etanolo5 minuti2
90% Etanolo5 minuti2
70% Etanolo5 minuti2
50% Etanolo5 minuti2
Acqua5 minuti2
Ematossilina4 minuti1
Lavaggio ad acqua
1% Di alcol acido in etanolo al 70%30 anni1
Lavaggio ad acqua
L'acqua di Scott1 min1
Lavaggio ad acqua
50% Etanolo1 min1
95% Etanolo1 min1
0,25% Eosina5 s1
Lavaggio ad acqua
Acqua2 minuti1
95% Etanolo1 min1
100% Etanolo1 min1
Xilene5 minuti2
Mountant e coverslip

Tabella 1. Procedura di colorazione di ematossilina ed eosina

2. Analisi della rottura della barriera emato-encefalica

  1. Raccolta di sangue e vitreo
    1. Anestetizzare un ratto maschio Wistar diabetico di 2-3 mesi insieme al controllo di pari età (da 14 a 15 settimane) usando ketamina (80 mg / kg) e xilazina (8 mg / kg). Confermare lo stato anestetico mediante riflesso di prelievo del pedale (pizzicamento della punta). Raccogliere immediatamente 1 mL di sangue mediante puntura cardiaca in un tubo rivestito di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) per separare il plasma dal sangue intero.
    2. Eutanasia del ratto utilizzando una dose elevata di pentobarbital (150 mg/kg), iniettata per via intraperitoneale. Nessun battito cardiaco rilevabile conferma la morte entro 2-5 minuti. Enucleare l'occhio e metterlo immediatamente sul ghiaccio secco.
    3. Posizionare l'occhio in una capsula di Petri pulita sopra il ghiaccio secco (consigliato) e iniziare a sezionare l'occhio come indicato al punto 1.2.2.
    4. Rimuovere la lente, estrarre con attenzione il vitreo dalla tazza posteriore usando una micro pinza e posizionarlo in un tubo di omogeneizzazione contenente da tre a quattro perle di vetro (2-4 mm).
      NOTA: Si consiglia la dissezione su ghiaccio secco in quanto la rimozione della lente e del vitreo è più facile in condizioni di congelamento.
  2. Preparazione dei campioni
    1. Omogeneizzare l'umore vitreo in un omogeneizzatore di perline a velocità media per 10 s.
    2. Trasferire il sangue (1 mL) e i campioni vitrei (10-20 μL) nelle provette microcentrifuga e centrifugare entrambi i campioni a 5200 x g per 10 min a 4 °C.
      NOTA: In caso di omogeneizzazione riuscita, il vitreo ha una consistenza uniforme dopo la centrifugazione. Tuttavia, in caso di consistenza non uniforme del vitreo, ripetere dal punto 2.2.1 con un aumento del tempo di omogeneizzazione.
    3. Raccogliere il surnatante da entrambi i campioni e diluire l'umore vitreo e i campioni di plasma in rapporto 1:10 e 1:20, rispettivamente, con PBS.
  3. Quantificazione delle proteine e rapporto proteine vitreo-plasmatiche
    1. Per quantificare la concentrazione proteica nei campioni di umore vitreo e plasma, aggiungere 5 μL di campioni diluiti a 250 μL di reagente bradford, mescolare bene e leggere l'assorbanza a 590 nm entro 40 minuti.
      NOTA: se il valore di assorbimento dei campioni è superiore a 1,0, diluire ulteriormente i campioni e ripetere la procedura dal punto 2.2.3.
    2. Normalizzare il livello di proteine vitree a livello di proteine plasmatiche dallo stesso ratto e misurare la differenza di piega tra ratti sani e diabetici.

3. Angiografia a fluorescenza

  1. FITC-dextran70000 iniezione di colorante
    1. Anestetizzare un ratto maschio Wistar diabetico di 2-3 mesi insieme al controllo abbinato all'età (da 14 a 15 settimane) usando il 3% di isoflurano e confermare il riflesso di astinenza del pedale (pizzicamento della punta). Immergere la coda in un becher contenente acqua tiepida (37-40 °C). Pulire la coda con etanolo al 70% prima di iniettare il colorante. Individuare la vena laterale della coda e contrassegnare la posizione di iniezione nella parte inferiore della coda.
      NOTA: se l'inserimento dell'ago fallisce, provare a inserire in un'altra posizione sopra la posizione corrente (punta alla base della coda). Tuttavia, si consiglia di iniettare una volta poiché la puntura ripetuta può portare allo sviluppo di stress nel ratto, che potrebbe causare vasocostrizione.
    2. Iniettare 1 mL di 50 mg/mL di soluzione colorante FITC-dextran70000 attraverso la vena della coda e lasciare circolare il colorante per 5 minuti. Eutanasia del ratto con una dose elevata di pentobarbital (150 mg/kg), iniettato per via intraperitoneale. Nessun battito cardiaco rilevabile conferma la morte entro 2-5 minuti. Enucleare l'occhio come indicato al punto 1.1.1.
      NOTA: Se necessario, l'occhio può essere fissato in soluzione di formaldeide al 4%, per non più di 30 minuti.
  2. Preparazione a montaggio piatto
    1. Per la preparazione di supporti piatti, tenere pronti gli strumenti di dissezione insieme alle diapositive e alle coperture. Posizionare l'occhio in una capsula di Petri riempita con PBS refrigerato e iniziare a sezionare l'occhio come indicato al punto 1.2.2.
    2. Ora posiziona la punta di un procipite appuntito tra la sclera e la retina. Spostalo delicatamente lungo tutto il bordo della tazza, assicurandoti che la retina non sia attaccata alla sclera in nessun punto. Se c'è qualche ostruzione, tagliare lentamente quella porzione lungo il bordo usando micro forbici curve.
    3. Una volta confermato che la retina non è attaccata alla sclera da nessun lato, tagliare vicino al disco ottico, facendo un piccolo foro in modo tale che la retina si stacchi completamente dalla sclera. Spingere lentamente la retina nella soluzione PBS e posizionarla su un vetrino piatto pulito con l'aiuto di una spatola o di una pinza.
    4. Usando micro forbici o lame di bisturi, fai piccoli tagli nel tessuto retinico, dividendolo in quattro quadranti. Assicurarsi che i tagli siano ad almeno 2 mm di distanza dal foro lasciato dal disco ottico al centro, come mostrato nella Figura 1.
    5. Rimuovere il PBS in eccesso dai lati del tessuto utilizzando punte da 0,2 ml senza disturbare il supporto piatto.
    6. Posizionare una goccia di mezzo di montaggio anti-sbiadimento (da 50 μL a 100 μL) su un supporto piatto, coprire con un coperchio e visualizzare immediatamente al microscopio confocale.
      NOTA: Mantenere la luce minima durante l'intera procedura.
  3. Visualizzazione del montaggio piatto
    1. Visualizza il supporto piatto sotto l'obiettivo 10x di un microscopio confocale. Eseguire la scansione dei riquadri per acquisire l'intero supporto piatto come una singola immagine. Il numero di piastrelle dipende dalle dimensioni del supporto piatto retinico. Inoltre, eseguire Z-stacking per visualizzare le vene e le arterie in diversi focolai (la dimensione preferita per Z-stack è 5 μm, a seconda di quale, il numero di passi Z-stack varia).
    2. Utilizzare il rilevatore PMT e HyD con guadagno percentuale rispettivamente come 700-900 e 100-150. Scegli l'intervallo di emissione tra 510-530 nm per il colorante FITC-destrano.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istologia retinica
Nella retina diabetica, le cellule retiniche subiscono una degenerazione. Inoltre, lo spessore degli strati retinici aumenta a causa dell'edema22. Le immagini ottenute dopo la colorazione di ematossilina ed eosina possono essere utilizzate per il conteggio delle cellule e la misurazione dello spessore di diversi strati, come mostrato nella Figura 2 utilizzando ImageJ.

Analisi di degradazione de...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istologia
L'istologia retinica viene eseguita per visualizzare i cambiamenti morfologici delle cellule e degli strati retinici. Vari passaggi, tra cui la scelta della soluzione fissativa, la durata della fissazione, la disidratazione e l'impregnazione di paraffina, devono essere ottimizzati. La dimensione del tessuto non deve superare i 3 mm, poiché la penetrazione fissativa diventa lenta. La paraformaldeide al 4% comunemente usata porta al distacco della retina anche nell'occhio sano a causa dell'osm...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori vorrebbero riconoscere l'Indian Council of Medical Research (ICMR; ITR-2020-2882) per il sostegno finanziario al Dr. Nirmal J. Vorremmo anche ringraziare la university grant of Commission per aver fornito una junior research fellowship a Manisha Malani e central analytical laboratory facility, BITS-Pilani, hyderabad campus per aver fornito strutture infrastrutturali.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Istologia
Reagenti
IsofluranoAbbottAgente per anestesia
Ketamina cloridratoTroikaa PharmaceuticalsAgente per anestesia
XilazinaImmunologici indiani Agenteper anestesia
Pentobarbital sodicoZora PharmaAgente per eutanasia
Soluzione fissativa (1 % di formaldeide, 1,25 % di glutaraldeideHiMedia, AvraMB059, ASG2529Preparato internamente
EtanoloHaymanF204325Disidratazione
XileneHiMediaMB-180Eliminazione di etanolo o paraffina
Cera di paraffinaHiMediaGRM10702utilizzato per l'inclusione di tessuti
GlycerolHiMediaTC503Per preparare vetrini rivestiti di albumina. Il glicerolo e l'albumina d'uovo vengono miscelati in rapporto 1:1 per rivestire i vetrini
Acido cloridricoSisco Research laboratories Pvt. Ltd.65955Per la preparazione di alcol acido all'1 %
Acido aceticoHiMediaAS119Per la preparazione di eosina
Scotts acquaLeica3802900Reagente azzurrante
Soluzione di Papanicolaou 1b Soluzione di ematossilinaSigma1.09254.0500Colorazione dei nuclei
EosinaHiMediaGRM115Colorazione del citoplasma, è stata preparata una soluzione allo 0,25 % supporto
interno DPXSigma6522Visualizzazione e protezione delle sezioni retiniche
Equipments
GlasswareBorosil
Pinza cornealeStephens InstrumentsS5-1200Dissezione
Colibri forcipeStephens InstrumentsS5-1135Dissezione
Micro forbice curvaStephens InstrumentsS7-1311Dissezione
Forbice VannasStephens InstrumentsS7-1387Dissezione
Forbice per irideStephens InstrumentsS7-1015Cassette di dissezione
HiMediaPW1292Per trattenere i tessuti durante l'elaborazione istologica
Bagno d'acquaGT SonicGT Sonic-D9Mantenimento della temperatura
Stazione di inclusione in paraffinaMyrEC 350Preparazione di blocchi di paraffina
MicrotomoZhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd.YD-335ALame di sezionamento
LeicaLeica 818Vetrini di sezionamento
HiMediaBG005Trattenuta di sezioni di paraffina e tessuto
Vetrini coprioggettiHiMediaBG014CPer coprire il tessuto dopo l'aggiunta di mezzi di montaggio
Blood Retinal Barrier breakdown
Reagents
IsofluranoAbbottB506Anestesia
Ghiaccio seccoNon applicabileNon applicabile
Reagente BradfordDissezione SigmaB6916Quantificazione proteica
Equipments
Pinza cornealeStephens InstrumentsS5-1200Dissezione
Colibri forbiceStephens InstrumentsS5-1135Dissezione
Micro forbice curvaStephens InstrumentsS7-1311Dissezione
Forbice VannasStephens InstrumentsS7-1387Dissezione
Forbice irideStephens InstrumentsS7-1015
Dissezione vetreriaBorosilNon applicabile
Provette rivestite in EDTAJ.KDiagnostics Non applicabileSeparare il plasma dal sangue intero
Provette per omogeneizzazioneMP BiomedicalsSKU: 115076200-CFOmogeneizzazione del vitreo
Capsule di omogeneizzazioneMP BiomedicalsSKU: 115063002-CFOmogeneizzazione del
vetroso Perle di vetroMP BiomedicalsSKU: 116914801Omogeneizzazione del vitreo
OmogeneizzatoreBertin InstrumentsP000673-MLYS0-AOmogeneizzazione di piastre vitree
96 pozzetti - Greniertrasparente GN655101Quantificazione di proteine
Lettore di piastreDispositivi molecolariSpectrMax M4Misura dell'assorbanza
CentrifugaREMICPR240 PlusAngiografia
a fluorescenza
Reagenti
IsofluranoAbbottB506Anestesia
FITC-destrano 70 kD (FITC, Destrano, Dibutilin dilaurato, DMSOFITC, Destrano e Dibutilin dilaurato da Sigma; DMSO da HiMediaFITC-F3651, Dextran-31390, Dibutillina dilaurato -29123, DMSO-TC185Preparato internamente
FluoroshiedSigmaF6182Anti-fading montaggio medium
Equipments
Corneal forcipeStephens InstrumentsS5-1200Dissezione
Colibri forcepStephens InstrumentsS5-1135Dissezione
Micro forbice curvaStephens InstrumentsS7-1311Dissezione
Forbice VannasStephens InstrumentsS7-1387Dissezione
Forbice irideStephens InstrumentsS7-1015Dissezione
vetreriaBorosilNon applicabile
VetriniHiMediaBG005Preparazione flatmount
Vetrini coprioggettiHiMediaBG014CPer coprire i tessuti dopo l'aggiunta del mezzo di montaggio
Microscopio confocaleLeicaDMi8Visualizzazione di flatmount
limitata a

References

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