La retinopatia diabetica è una delle principali cause di cecità. L'istologia, il test di rottura della barriera emato-retinica e l'angiografia a fluorescenza sono tecniche preziose per comprendere la fisiopatologia della retina, che potrebbe migliorare ulteriormente l'efficiente screening farmacologico contro la retinopatia diabetica.
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Articolo metodologico
Valutazione fisiopatologica retinica in un modello di ratto
In questo articolo
Sommario
Abstract
Una malattia dell'occhio del segmento posteriore come la retinopatia diabetica altera la fisiologia della retina. La retinopatia diabetica è caratterizzata da un distacco di retina, dalla rottura della barriera emato-retinica (BRB) e dall'angiogenesi retinica. Un modello di ratto in vivo è un prezioso strumento sperimentale per esaminare i cambiamenti nella struttura e nella funzione della retina. Proponiamo tre diverse tecniche sperimentali nel modello di ratto per identificare i cambiamenti morfologici delle cellule retiniche, della vascolarizzazione retinica e della BRB compromessa. L'istologia retinica viene utilizzata per studiare la morfologia di varie cellule retiniche. Inoltre, la misurazione quantitativa viene eseguita mediante conteggio delle cellule retiniche e misurazione dello spessore di diversi strati retinici. Un test di degradazione BRB viene utilizzato per determinare la perdita di proteine extraoculari dal plasma al tessuto vitreo a causa della rottura di BRB. L'angiografia a fluorescenza viene utilizzata per studiare l'angiogenesi e la perdita dei vasi sanguigni visualizzando la vascolarizzazione retinica utilizzando il colorante FITC-destrano.
Introduzione
La retinopatia diabetica (DR) è una delle complicanze secondarie più complesse del diabete mellito. È anche la principale causa di cecità prevenibile nella popolazione in età lavorativa in tutto il mondo. In una recente meta-analisi di 32,4 milioni di persone non vedenti, 830.000 (2,6%) persone erano cieche a causa di DR1. La percentuale di perdita della vista attribuita al diabete si è classificata settima nel 2015 all'1,06% (0,15-2,38) a livello globale2,3.
La retinopatia diabetica è diagnosticata da anomalie vascolari nei tessuti oculari posteriori. Clinic....
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Protocollo
Questo protocollo segue tutte le linee guida per la cura degli animali fornite dal Comitato etico istituzionale degli animali, BITS-Pilani, campus di Hyderabad.
1. Istologia retinica
- Enucleazione e fissazione dell'occhio
- Eutanasia di un ratto maschio Wistar diabetico di 2-3 mesi insieme al controllo di pari età (da 14 a 15 settimane) utilizzando un'alta dose di pentobarbital (150 mg / kg) iniettato attraverso la via intraperitoneale. Nessun battito cardiaco rilevabile conferma la morte entro 2-5 minuti.
- Enucleare l'occhio facendo incisioni usando una lama di bisturi sulle regioni nasali e tempor....
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Risultati
Istologia retinica
Nella retina diabetica, le cellule retiniche subiscono una degenerazione. Inoltre, lo spessore degli strati retinici aumenta a causa dell'edema22. Le immagini ottenute dopo la colorazione di ematossilina ed eosina possono essere utilizzate per il conteggio delle cellule e la misurazione dello spessore di diversi strati, come mostrato nella Figura 2 utilizzando ImageJ.
Analisi di degradazione de.......
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Discussione
Istologia
L'istologia retinica viene eseguita per visualizzare i cambiamenti morfologici delle cellule e degli strati retinici. Vari passaggi, tra cui la scelta della soluzione fissativa, la durata della fissazione, la disidratazione e l'impregnazione di paraffina, devono essere ottimizzati. La dimensione del tessuto non deve superare i 3 mm, poiché la penetrazione fissativa diventa lenta. La paraformaldeide al 4% comunemente usata porta al distacco della retina anche nell'occhio sano a causa dell'osm.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Gli autori vorrebbero riconoscere l'Indian Council of Medical Research (ICMR; ITR-2020-2882) per il sostegno finanziario al Dr. Nirmal J. Vorremmo anche ringraziare la university grant of Commission per aver fornito una junior research fellowship a Manisha Malani e central analytical laboratory facility, BITS-Pilani, hyderabad campus per aver fornito strutture infrastrutturali.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Istologia | |||
| Reagenti | |||
| Isoflurano | Abbott | Agente per anestesia | |
| Ketamina cloridrato | Troikaa Pharmaceuticals | Agente per anestesia | |
| Xilazina | Immunologici indiani Agente | per anestesia | |
| Pentobarbital sodico | Zora Pharma | Agente per eutanasia | |
| Soluzione fissativa (1 % di formaldeide, 1,25 % di glutaraldeide | HiMedia, Avra | MB059, ASG2529 | Preparato internamente |
| Etanolo | Hayman | F204325 | Disidratazione |
| Xilene | HiMedia | MB-180 | Eliminazione di etanolo o paraffina |
| Cera di paraffina | HiMedia | GRM10702 | utilizzato per l'inclusione di tessuti |
| Glycerol | HiMedia | TC503 | Per preparare vetrini rivestiti di albumina. Il glicerolo e l'albumina d'uovo vengono miscelati in rapporto 1:1 per rivestire i vetrini |
| Acido cloridrico | Sisco Research laboratories Pvt. Ltd. | 65955 | Per la preparazione di alcol acido all'1 % |
| Acido acetico | HiMedia | AS119 | Per la preparazione di eosina |
| Scotts acqua | Leica | 3802900 | Reagente azzurrante |
| Soluzione di Papanicolaou 1b Soluzione di ematossilina | Sigma | 1.09254.0500 | Colorazione dei nuclei |
| Eosina | HiMedia | GRM115 | Colorazione del citoplasma, è stata preparata una soluzione allo 0,25 % supporto |
| interno DPX | Sigma | 6522 | Visualizzazione e protezione delle sezioni retiniche |
| Equipments | |||
| Glassware | Borosil | ||
| Pinza corneale | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissezione |
| Colibri forcipe | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissezione |
| Micro forbice curva | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissezione |
| Forbice Vannas | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissezione |
| Forbice per iride | Stephens Instruments | S7-1015 | Cassette di dissezione |
| HiMedia | PW1292 | Per trattenere i tessuti durante l'elaborazione istologica | |
| Bagno d'acqua | GT Sonic | GT Sonic-D9 | Mantenimento della temperatura |
| Stazione di inclusione in paraffina | Myr | EC 350 | Preparazione di blocchi di paraffina |
| Microtomo | Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd. | YD-335A | Lame di sezionamento |
| Leica | Leica 818 | Vetrini di sezionamento | |
| HiMedia | BG005 | Trattenuta di sezioni di paraffina e tessuto | |
| Vetrini coprioggetti | HiMedia | BG014C | Per coprire il tessuto dopo l'aggiunta di mezzi di montaggio |
| Blood Retinal Barrier breakdown | |||
| Reagents | |||
| Isoflurano | Abbott | B506 | Anestesia |
| Ghiaccio secco | Non applicabile | Non applicabile | |
| Reagente Bradford | Dissezione Sigma | B6916 | Quantificazione proteica |
| Equipments | |||
| Pinza corneale | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissezione |
| Colibri forbice | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissezione |
| Micro forbice curva | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissezione |
| Forbice Vannas | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissezione |
| Forbice iride | Stephens Instruments | S7-1015 | |
| Dissezione vetreria | Borosil | Non applicabile | |
| Provette rivestite in EDTA | J.K | Diagnostics Non applicabile | Separare il plasma dal sangue intero |
| Provette per omogeneizzazione | MP Biomedicals | SKU: 115076200-CF | Omogeneizzazione del vitreo |
| Capsule di omogeneizzazione | MP Biomedicals | SKU: 115063002-CF | Omogeneizzazione del |
| vetroso Perle di vetro | MP Biomedicals | SKU: 116914801 | Omogeneizzazione del vitreo |
| Omogeneizzatore | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | Omogeneizzazione di piastre vitree |
| 96 pozzetti - Grenier | trasparente GN655101 | Quantificazione di proteine | |
| Lettore di piastre | Dispositivi molecolari | SpectrMax M4 | Misura dell'assorbanza |
| Centrifuga | REMI | CPR240 Plus | Angiografia |
| a fluorescenza | |||
| Reagenti | |||
| Isoflurano | Abbott | B506 | Anestesia |
| FITC-destrano 70 kD (FITC, Destrano, Dibutilin dilaurato, DMSO | FITC, Destrano e Dibutilin dilaurato da Sigma; DMSO da HiMedia | FITC-F3651, Dextran-31390, Dibutillina dilaurato -29123, DMSO-TC185 | Preparato internamente |
| Fluoroshied | Sigma | F6182 | Anti-fading montaggio medium |
| Equipments | |||
| Corneal forcipe | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissezione |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissezione |
| Micro forbice curva | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissezione |
| Forbice Vannas | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissezione |
| Forbice iride | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissezione |
| vetreria | Borosil | Non applicabile | |
| Vetrini | HiMedia | BG005 | Preparazione flatmount |
| Vetrini coprioggetti | HiMedia | BG014C | Per coprire i tessuti dopo l'aggiunta del mezzo di montaggio |
| Microscopio confocale | Leica | DMi8 | Visualizzazione di flatmount |
Riferimenti
- Jonas, J. B., Sabanayagam, C. Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy. Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).
- Pandova, M. G. Visual Impairment and Blindness. , IntechOpen. (2019).
- Mokdad, A. H., et al.
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Ristampe e permessi
