Analisi citometrica a flusso di parametri mitocondriali multipli in cellule staminali pluripotenti indotte umane e loro derivati neurali e gliali

Summary

Questo studio riporta un nuovo approccio per misurare più parametri funzionali mitocondriali basati sulla citometria a flusso e sulla doppia colorazione con due reporter fluorescenti o anticorpi per rilevare cambiamenti nel volume mitocondriale, potenziale di membrana mitocondriale, livello di specie reattive dell'ossigeno, composizione della catena respiratoria mitocondriale e DNA mitocondriale.

Abstract

I mitocondri sono importanti nella fisiopatologia di molte malattie neurodegenerative. I cambiamenti nel volume mitocondriale, il potenziale di membrana mitocondriale (MMP), la produzione mitocondriale di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e il numero di copie del DNA mitocondriale (mtDNA) sono spesso caratteristiche di questi processi. Questo rapporto descrive un nuovo approccio basato sulla citometria a flusso per misurare più parametri mitocondriali in diversi tipi di cellule, tra cui cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) e cellule neurali e gliali derivate da iPSC. Questa strategia basata sul flusso utilizza cellule vive per misurare il volume mitocondriale, i livelli di MMP e ROS, nonché cellule fisse per stimare componenti della catena respiratoria mitocondriale (MRC) e proteine associate al mtDNA come il fattore di trascrizione mitocondriale A (TFAM).

Co-colorando con reporter fluorescenti, tra cui MitoTracker Green (MTG), tetrametilrodamina estere etilico (TMRE) e MitoSox Red, i cambiamenti nel volume mitocondriale, MMP e ROS mitocondriale possono essere quantificati e correlati al contenuto mitocondriale. La doppia colorazione con anticorpi contro le subunità del complesso MRC e la translocasi della membrana mitocondriale esterna 20 (TOMM20) consente la valutazione dell'espressione della subunità MRC. Poiché la quantità di TFAM è proporzionale al numero di copie del mtDNA, la misurazione del TFAM per TOMM20 fornisce una misurazione indiretta del mtDNA per volume mitocondriale. L'intero protocollo può essere eseguito entro 2-3 ore. È importante sottolineare che questi protocolli consentono la misurazione dei parametri mitocondriali, sia a livello totale che a livello specifico per volume mitocondriale, utilizzando la citometria a flusso.

Introduction

I mitocondri sono organelli essenziali presenti in quasi tutte le cellule eucariotiche. I mitocondri sono responsabili dell'approvvigionamento energetico producendo adenosina trifosfato (ATP) attraverso la fosforilazione ossidativa e agiscono come intermediari metabolici per la biosintesi e il metabolismo. I mitocondri sono profondamente coinvolti in molti altri importanti processi cellulari, come la generazione di ROS, la morte cellulare e la regolazione intracellulare di Ca²⁺. La disfunzione mitocondriale è stata associata a varie malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Parkinson (PD), il morbo di Alzheimer (AD), la malattia di Huntington (HD), l'....

Protocol

NOTA: Vedere la tabella dei materiali e la tabella supplementare S1 per le ricette di tutti i supporti e le soluzioni utilizzate in questo protocollo.

1. Differenziazione delle iPSC umane in NCS, neuroni dopaminergici (DA) e astrociti

1. Preparare piastre rivestite di matrice.
   1. Scongelare un flaconcino di 5 mL di matrice sul ghiaccio durante la notte. Diluire 1 mL di matrice con 99 mL di freddo Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 (Advanced DMEM/F12) (concentrazione finale 1%). Preparare 1 mL di aliquote e conservarle a -20 °C.
   2. Scongelare la soluzione....

Results

Una descrizione schematica del metodo di differenziazione e delle strategie citometriche a flusso è mostrata nella Figura 3. Le iPSC umane sono differenziate in rosette neurali e quindi sollevate in coltura di sospensione per la differenziazione in sfere neurali. Le sfere neurali sono ulteriormente differenziate e maturate in neuroni DA. Le sfere neurali sono dissociate in singole cellule per generare astrociti gliali, riplaccate in monostrati come NSC e quindi differenziate in astrociti. Qu.......

Discussion

Qui sono protocolli per generare neuroni e astrociti derivati da iPSC e valutare molteplici aspetti della funzione mitocondriale utilizzando la citometria a flusso. Questi protocolli consentono un'efficiente conversione delle iPSC umane sia in neuroni che in astrociti gliali e la caratterizzazione dettagliata della funzione mitocondriale, principalmente nelle cellule viventi. I protocolli forniscono anche una strategia basata sulla citometria a flusso di co-colorazione per l'acquisizione e l'analisi di più funzioni mitoc.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-Oct4	Abcam	ab19857, RRID:AB_445175	Anticorpo primario; utilizzare come 1:100, 10 μ L in 1000 μ L. soluzione colorante; usa Alexa Fluor ® 488 capra anti-coniglio IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalogo # A-11008) come anticorpo secondario.
anti-SSEA4	Abcam	ab16287, RRID:AB_778073	Anticorpo primario; utilizzare come 1:100, 10 μ L in 1000 μ L. soluzione colorante; usa Alexa Fluor ® 594 IgG anti-topo di capra (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) come anticorpo secondario.
anti-Sox2	Abcam	ab97959, RRID:AB_2341193	Anticorpo primario; utilizzare come 1:100, 10 μ L in 1000 μ L. soluzione colorante; usa Alexa Fluor ® 488 capra anti-coniglio IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalogo # A-11008) come anticorpo secondario.
anti-Pax6	Abcam	ab5790, RRID:AB_305110	Anticorpo primario; utilizzare come 1:100, 10 μ L in 1000 μ L. soluzione colorante; usa Alexa Fluor ® 488 capra anti-coniglio IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalogo # A-11008) come anticorpo secondario.
anti-Nestin	Santa Cruz Biotechnology	sc-23927, RRID:AB_627994	Anticorpo primario; utilizzare come 1:50, 20 μ L in 1000 μ L. soluzione colorante; usa Alexa Fluor ® 594 IgG anti-topo di capra (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) come anticorpo secondario.
anti-GFAP	Abcam	ab4674, RRID:AB_304558	Anticorpo primario; utilizzare come 1:100, 10 μ L in 1000 μ L. soluzione colorante;   usa Alexa Fluor ® 594 IgG anti-pollo di capra (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalogo # A-11042) come anticorpo secondario.
anti-S100β   coniugato con Alexa Fluor 488	Abcam	ab196442, RRID:AB_2722596	Anticorpo primario; utilizzare come 1:400, 2,5 μ L in 1000 μ L. soluzione colorante;
anti-TH	Abcam	ab75875, RRID:AB_1310786	Anticorpo primario; utilizzare come 1:100, 10 μ L in 1000 μ L. soluzione colorante; usa Alexa Fluor ® 488 capra anti-coniglio IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalogo # A-11008) come anticorpo secondario.
anti-Tuj 1	Abcam	ab78078, RRID:AB_2256751	Anticorpo primario; utilizzare come 1:1000, 1 μ L in 1000 μ L. soluzione colorante; usa Alexa Fluor ® 594 IgG anti-topo di capra (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) come anticorpo secondario.
anti-sinaptofisina	Abcam	ab32127, RRID:AB_2286949	Anticorpo primario; utilizzare come 1:100, 10 μ L in 1000 μ L. soluzione colorante; usa Alexa Fluor ® 488 capra anti-coniglio IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalogo # A-11008) come anticorpo secondario.
anti-PSD-95	Abcam	ab2723, RRID:AB_303248	Anticorpo primario; utilizzare come 1:100, 10 μ L in 1000 μ L. soluzione colorante;   usa Alexa Fluor ® 594 IgG anti-pollo di capra (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalogo # A-11042) come anticorpo secondario.
anti-TFAM coniugato con Alexa Fluor 488	Abcam	ab198308	Anticorpo primario; utilizzare come 1:400, 2,5 μ L in 1000 μ L. soluzione colorante; utilizzare IgG2b monoclonali di topo  Alexa Fluor® 488 come controllo isotipico.
anti-TOMM20 coniugato con Alexa Fluor 488	Santa Cruz Biotechnology	Cat# sc-17764 RRID:AB_628381	Anticorpo primario; utilizzare come 1:400, 2.5 μ L in 1000 μ L. soluzione colorante; utilizzare IgG2a monoclonali di topo  Alexa Fluor® 488 come controllo isotipico.
anti-NDUFB10	Abcam	ab196019	Anticorpo primario; utilizzare come 1:1000, 1 μ L in 1000 μ L. soluzione colorante; usa Alexa Fluor ® 488 capra anti-coniglio IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalogo # A-11008) come anticorpo secondario; utilizzare le IgG monoclonali di coniglio come controllo isotipico.
anti-SDHA	Abcam	ab137040	Anticorpo primario; utilizzare come 1:1000, 1 μ L in 1000 μ L. soluzione colorante;   usa Alexa Fluor ® 488 capra anti-coniglio IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalogo # A-11008) come anticorpo secondario; utilizzare le IgG monoclonali di coniglio come controllo isotipico.
anti-COX IV	Abcam	ab14744, RRID:AB_301443	Anticorpo primario; utilizzare come 1:1000, 1 μ L in 1000 μ L. soluzione colorante; Utilizzo  Alexa Fluor ® 488 IgG anti-topo di capra (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalogo # A-11001) come anticorpo secondario; utilizzare le IgG monoclonali di topo come controllo isotipico.
Activina A	PeproTech	120-14E	Ingrediente del mezzo di differenziazione degli astrociti
ABM Basal Medium	Lonza	CC-3187	Terreno basale per coltura di astrociti
AGM SingleQuots Supplement Pack	Lonza	CC-4123	Integratore per coltura di astrociti
Antibiotico-Antimicotico	Thermo Fisher Scientific	15240062	Ingrediente CDM
Advanced DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12634010	Terreno basale per diluire Geltrex
Siero Bovino Albumina	Europa Bioproducts	EQBAH62-1000	Agente bloccante per prevenire il legame non specifico degli anticorpi nei saggi di immunocolorazione e l'ingrediente CDM
BDNF	PeproTech	450-02	DA neuroni medio ingrediente
B-27 Integratore	Thermo Fisher Scientific	17504044	Ingrediente del mezzo di differenziazione degli astrociti
BD Accuri C6 Plus Citometro a flusso	BD Biosciences, USA
Concentrato lipidico chimicamente definito	Thermo Fisher Scientific	11905031	Ingrediente CDM
Collagenasi IV	Thermo Fisher Scientific	17104019	Reagente per la dissociazione delicata delle iPSC umane
Fotocamera per microscopio CCD Leica DFC3000 G	Leica Microsystems, Germania
Piastre di coltura non trattate Corning	Sigma-Aldrich	CLS430589	Coltura in sospensione
DPBS	Thermo Fisher Scientific	14190250	Utilizzato per una varietà di lavaggio per colture cellulari
DMEM/F-12, integratore GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	10565018	Differenziazione degli astrociti basale
EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575020	Reagente per la dissociazione delicata di iPSC umane
Essential 8 Basal Medium	Thermo Fisher Scientific	A1516901	Terreno basale per colture di iPSC
Essential 8 Supplement (50X)	Thermo Fisher Scientific	A1517101	Integratore per colture di iPSC
EGF Proteina umana ricombinante	Thermo Fisher Scientific	PHG0314	Integratore per colture di NSC
FGF-base (AA 10– 155) Proteina umana ricombinante	Thermo Fisher Scientific	PHG0024	Integratore per colture NSC
Siero fetale bovino	Sigma-Aldrich	12103C	Ingrediente medio
FGF-basic	PeproTech	100-18B	Ingrediente medio per la differenziazione degli astrociti
FCCP	Abcam	ab120081	Elimina il potenziale di membrana mitocondriale e la
colorazione TMRESistema di aspirazione di fluidi Controllo BVC	Vacuubrand, Germania
Formaldeide (PFA) 16%	Thermo Fisher Scientific	28908	Fissazione cellulare
Geltrex	Thermo Fisher Scientific	A1413302	Utilizzato per l'attacco e il mantenimento di iPSC umane
Integratore GlutaMAX Thermo	Fisher Scientific	35050061	Integratore per colture NSC
GDNF	Peprotech	450-10	Neuroni DA ingrediente medio
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898	Utilizzato per bloccare
il tampone Ham's F-12 Nutrient Mix	Thermo Fisher Scientific 31765027 Terreno		basale per CDM
Heregulin beta-1 umano	Sigma-Aldrich	SRP3055	Ingrediente medio per la differenziazione degli astrociti
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H1399	Colorare i nuclei per l'immagine confocale
Heracell 150i CO2 Incubatori	Fisher Scientific, USA
IMDM	Thermo Fisher Scientific	21980032	Terreno basale per CDM
Insulina	Roche	1376497	Ingrediente CDM
InSolution AMPK Inhibitor	Sigma-Aldrich	171261	Ingrediente del mezzo di induzione neurale
Fattore di crescita insulino-simile-I, umano	Sigma-Aldrich	I3769	Ingrediente del mezzo di differenziazione degli astrociti
KnockOut DMEM/F-12 medium	Thermo Fisher Scientific	12660012	Terreno basale per coltura NSC:
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020	Promuove l'adesione e la crescita delle cellule neurali in vitro
Leica TCS SP8, STED, microscopio confocale	Leica Microsystems, Germania
Monotioglicerina	Sigma-Aldrich	M6145	CDM ingrediente
MitoTracker Green FM	Thermo Fisher Scientific	M7514	Utilizzato per l'indicatore di volume mitocondriale
MitoSox Red	Thermo Fisher Scientific	M36008	Utilizzato per l'indicatore ROS mitocondriale
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	A7250	Neural Ingrediente medio di induzione
N-2 Integratore	Thermo Fisher Scientific	17502048	Ingrediente medio di differenziazione degli astrociti
Siero di capra normale	Thermo Fisher Scientific	PCN5000	Utilizzato per bloccare
il tampone Agitatori orbitali - SSM1	Stuart Equipment, UK
Soluzione di poli-L-ornitina	Sigma-Aldrich	P4957	Promuove l'adesione e la crescita delle cellule neurali in vitro
Bromidrato di poli-D-lisina	Sigma-Aldrich	P7405	Promuove l'adesione e la crescita delle cellule neurali in vitro
Purmorphamine	STEMCELL Technologies	72204	Promuove la differenziazione dei neuroni DA
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36930	Montaggio del vetrino coprioggetti per l'immagine
confocalePBS 1x	Thermo Fisher Scientific	18912014	Utilizzato per una varietà di
lavaggio Ricombinante Umano/Topo FGF-8b Protein	R& D Systems	423-F8-025/CF	Promuove la differenziazione dei neuroni DA
SB 431542	Tocris Bioscience	TB1614-GMP	Induzione neurale Ingrediente medio
StemPro Neural Supplement	Thermo Fisher Scientific	A10508-01	Integratore per colture di NSC
TrypLE Express Enzyme	Thermo Fisher Scientific	12604013	Reagente di dissociazione cellulare
Transferrina	Roche	652202	CDM ingrediente
TRITON X-100	VWR International	9002-93-1	Utilizzato per la permeabilizzazione delle cellule nei saggi di immunocolorazione
TMRE	Abcam	ab113852	Utilizzato per la colorazione del potenziale della membrana mitocondriale
Bagno d'acqua Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instruments	Grant Instruments, USA