Articolo metodologico

Drosophila melanogaster Protocollo di iniezione della larva

DOI:

10.3791/63144

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19 ottobre 2021

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1Infection and Innate Immunity Laboratory, Department of Biological Sciences, Institute for Biomedical Sciences, The George Washington University

In questo articolo

Sommario

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Le mosche adulte Drosophila melanogaster sono state ampiamente utilizzate come organismi modello per studiare i meccanismi molecolari alla base delle risposte immunitarie innate antimicrobiche dell'ospite e delle strategie di infezione microbica. Per promuovere lo stadio larvale di D. melanogaster come sistema modello aggiuntivo o alternativo, viene descritta una tecnica di iniezione larvale.

Abstract

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L'uso di modelli non convenzionali per studiare l'immunità innata e la virulenza dei patogeni fornisce una valida alternativa ai modelli di mammiferi, che possono essere costosi e sollevare questioni etiche. I modelli non convenzionali sono notoriamente economici, facili da maneggiare e cultura e non occupano molto spazio. Sono geneticamente suscettibili e possiedono sequenze genomiche complete e il loro uso non presenta considerazioni etiche. Il moscerino della frutta Drosophila melanogaster, ad esempio, ha fornito grandi intuizioni su una varietà di comportamento, sviluppo, metabolismo e ricerca sull'immunità. Più specificamente, le mosche e le larve adulte di D. melanogaster possiedono diverse reazioni di difesa innate che sono condivise con gli animali vertebrati. I meccanismi che regolano le risposte immunitarie sono stati per lo più rivelati attraverso studi genetici e molecolari nel modello D. melanogaster . Qui viene fornita una nuova tecnica di iniezione larvale, che promuoverà ulteriormente le indagini sui processi immunitari innati nelle larve di D. melanogaster ed esplorerà la patogenesi di una vasta gamma di infezioni microbiche.

Introduzione

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Drosophila melanogaster è stata immensamente utilizzata nella ricerca biologica e biomedica per diversi decenni, poiché la sofisticata gamma di strumenti genetici e molecolari si è costantemente evoluta per l'analisi di una vasta gamma di studi1,2,3,4. Gli aspetti evolutivamente conservati dello sviluppo, dell'omeostasi e dell'immunità innata in D. melanogaster lo hanno reso un prezioso organismo modello per lo studio di varie malattie umane e degli insetti5,6. In p....

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Protocollo

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1. Allevamento di mosche

NOTA: Il ciclo di vita di D. melanogaster è diviso in quattro fasi: embrione, larva, pupa e adulto. Il tempo di generazione con condizioni di allevamento ottimali in laboratorio (~ 25 ° C, 60% di umidità e cibo sufficiente) è di circa 10 giorni dall'uovo fecondato all'adulto echiuso. Le femmine depongono circa 100 embrioni al giorno e l'embriogenesi dura circa 24 ore su 22. Le larve subiscono tre fasi di sviluppo (instars; L1-L3) in ~4 giorni (L1 e L2: 24 h, e L3: 48 h). Le prime larve instar iniziano a nutrirsi immediatamente sulla superficie del mezzo. Le larve di se....

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Risultati

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Se eseguite correttamente, le iniezioni di larve di D. melanogaster mostrano un effetto specifico del batterio. I dati di sopravvivenza sono stati raccolti in diversi punti temporali a seguito di infezioni da P. asymbiotica (ceppo ATCC43943), E. coli (ceppo K12) e PBS (Figura 4). Mentre le larve di D. melanogaster sono sensibili a P. asymbiotica, che compromette rapidamente la sopravvivenza, le larve iniettate con controlli E. coli o PBS .......

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Discussione

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Drosophila melanogaster è tra i modelli più preziosi e manipolati sperimentalmente utilizzati per le indagini sull'immunità innata e sulla patogenesi di varie infezioni microbiche. Ciò è dovuto al suo ciclo di vita semplice e veloce, alla semplice manutenzione in laboratorio, alla genetica evolutiva ben consolidata e alla diversa cassetta degli attrezzi genetica. I precedenti metodi di iniezioni di larve di D. melanogaster, come l'utilizzo di un dispositivo microfluidico ibrido o di un micromanipolatore.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Ringraziamenti

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Ringraziamo i membri del Dipartimento di Scienze Biologiche della George Washington University (GWU) per la lettura critica del manoscritto. GT è stato supportato attraverso una borsa di studio estiva Harlan da GWU. Tutte le figure grafiche sono state realizzate utilizzando BioRender.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Fly Food B (Bloomington Recipe)LabExpress7001-NVFood B, in fiale strette, 100 fiale/vassoio
100 x 15, Mono Piastre di Petri Completamente impilabiliVWR25384-342Diametro 100 x 15 mm
60 x 15, Mono Piastre di Petri Completamente impilabiliVWR25384-092Diametro 60 x 15 mm
Capillari in vetroVWR53440-186
Carta da filtro qualitativa di grado 1 di grado standard, cerchioVWR28450-150Diametro 150 mm
Coltura di laboratorio Classe II Tipo A2 Armadio di sicurezza per la biosicurezzaESCOLA2-4A2-E
LB AgarFisher ScientificBP1425-500LB agar mugnaio in polvere 500 g
LB BrodoFisher ScientificBP1426-500LB brodo mugnaio in polvere 500 g
OliomineraleAlfa Aesar, Thermo Fisher Scientific31911-A1
NanoDrop 2000/2000c SpettrofotometroThermo Fisher ScientificND-2000C
Nanoject III Iniettore programmabile di nanolitriDrummond3-000-207
Fiale strette di Drosophila, polistireneGenesee Scientific32-109
aghi, ipodermicoVWR89219-31622 G, Estrattore
micropipette di nuova generazioneWorld Precision InstrumentsSU-P1000
PBSVWR97062-732Compresse PBS tampone di grado biotecnologico 200tab
PrismGraphPadVersione 8
Siringhe - plastica, monousoVWR76124-65220 mL
Trypan BlueSigma-AldrichT8154
per da 25 mm

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takehana, A., et al. Overexpression of a pattern-recognition receptor, peptidoglycan-recognition protein-LE, activates imd/relish-mediated antibacterial defense and the prophenoloxidase cascade in Drosophila larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of Ame....

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Tag

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