Identificazione della fonte delle proteine secrete nel rene mediante iniezione di brefeldina A

Sommario

Identificare il tipo di cellula responsabile della secrezione di citochine è necessario per comprendere la patobiologia della malattia renale. Qui, descriviamo un metodo per colorare quantitativamente il tessuto renale alla ricerca di citochine prodotte da cellule epiteliali o interstiziali renali utilizzando la brefeldina A, un inibitore della secrezione, e marcatori specifici del tipo di cellula.

Abstract

La malattia renale cronica (CKD) è una delle prime dieci principali cause di morte negli Stati Uniti. Il danno renale acuto (AKI), sebbene spesso recuperabile, predispone i pazienti alla CKD più tardi nella vita. Le cellule epiteliali renali sono state identificate come nodi di segnalazione chiave sia nell'AKI che nella CKD, per cui le cellule possono determinare il decorso della malattia attraverso la secrezione di citochine e altre proteine. In particolare, nella CKD, diverse linee di evidenza hanno dimostrato che le cellule tubulari riparate in modo disadattivo guidano la progressione della malattia attraverso la secrezione del fattore di crescita trasformante-beta (TGF-β), del fattore di crescita del tessuto connettivo (CTGF) e di altre citochine profibrotiche. Tuttavia, l'identificazione della fonte e del numero relativo di proteine secrete da diversi tipi di cellule in vivo rimane impegnativa.

Questo articolo descrive una tecnica che utilizza la brefeldina A (BFA) per prevenire la secrezione di citochine, consentendo la colorazione delle citochine nel tessuto renale utilizzando tecniche standard di immunofluorescenza. Il BFA inibisce il trasporto del reticolo endoplasmatico (ER) all'apparato di Golgi, necessario per la secrezione di citochine e altre proteine. L'iniezione di BFA 6 ore prima del sacrificio porta ad un accumulo di TGF-β, PDGF e CTGF all'interno delle cellule del tubulo prossimale (PTC) in un modello murino di cisplatino di AKI e TGF-β in un modello murino di acido aristolochico (AA) di CKD. L'analisi ha rivelato che BFA + cisplatino o BFA + AA aumentavano significativamente il segnale TGF-β positivo rispetto a BFA + soluzione fisiologica, cisplatino o AA da soli. Questi dati suggeriscono che il BFA può essere utilizzato per identificare il tipo di cellula che produce citochine specifiche e quantificare le quantità relative e/o i diversi tipi di citochine prodotte.

Introduzione

Si stima che il >10% della popolazione mondiale abbia una qualche forma di malattia renale¹. Definita dalla sua rapida insorgenza, l'AKI è in gran parte curabile; tuttavia, un episodio di AKI può predisporre i pazienti a sviluppare la CKD più tardi nella vita ^2,3. A differenza dell'AKI, la CKD è caratterizzata da fibrosi progressiva e peggioramento della funzione renale, che porta a una malattia renale allo stadio terminale che richiede una terapia sostitutiva renale. La maggior parte delle lesioni ai reni prende di mira le cellule epiteliali specializzate, come i podociti o le cellule dei tubuli prossimali, che compongono il nefrone ^4,5. Dopo la lesione, le cellule epiteliali sopravvissute aiutano a coordinare la risposta di riparazione attraverso la secrezione di citochine e altre proteine. In questo modo, le cellule sopravvissute possono modulare la risposta immunitaria, dirigere il rimodellamento della matrice extracellulare e aiutare il recupero degli organi.

Le citochine sono piccole proteine secrete essenziali per modulare la maturazione, la crescita e la reattività degli organismi multicellulari ^6,7. Funzionano come messaggeri di segnale tra vari tipi di cellule, comprese le cellule immunitarie ed epiteliali⁸. Sebbene si pensi che le citochine siano secrete principalmente dalle cellule immunitarie, la ricerca di lunga data ha dimostrato che anche le cellule epiteliali e interstiziali renali secernono citochine come segnali per altre cellule renali residenti, come le cellule tubuliche, le cellule interstiziali e le cellule immunitarie ^9,10. I PTC, in particolare, svolgono un ruolo importante nella fase di inizio e recupero dopo AKI¹¹. Tuttavia, è noto che le PTC riparate in modo disadattivo secernono citochine profibrotiche come il fattore di crescita trasformante-β (TGF-β), il fattore di crescita derivato dalle piastrine-D (PDGF-D) e il fattore di crescita del tessuto connettivo (CTGF), contribuendo alla progressione della CKD¹². Pertanto, le cellule epiteliali renali utilizzano citochine secrete per modulare il danno renale.

Sebbene sia noto che le cellule epiteliali renali secernono citochine, la fonte esatta e il contributo relativo di ciascun tipo di cellula sono stati difficili da determinare a causa delle sfide tecniche dello studio delle proteine secrete¹³. La citometria a flusso, un approccio comune utilizzato per misurare le citochine, è difficile da eseguire sui reni danneggiati, specialmente in quelli altamente fibrotici. Con la Cre ricombinasi guidata da un promotore di citochine, i topi reporter di citochine sono spesso utilizzati per identificare il tipo di cellula che esprime una data citochina. Tuttavia, l'uso di topi reporter è limitato a causa della necessità di incrociare topi reporter in vari background knockout, della mancanza di reporter adatti e del fatto che è possibile analizzare una sola citochina alla volta. Pertanto, è necessario sviluppare una tecnica semplice, versatile ed economica per rilevare le cellule renali che rilasciano citochine.

Abbiamo ipotizzato che l'iniezione di BFA, un inibitore della secrezione che blocca il trasporto endoplasmatico del reticolo-Golgi in vivo, permetterebbe la colorazione delle proteine secrete nel tessuto renale (Figura 1A, B), come mostrato con saggi basati sulla citometria a flusso^14,15. Insieme ai produttori specifici del tipo di cellula, questa tecnica potrebbe essere utilizzata per identificare la fonte e il contributo relativo delle cellule produttrici di citochine nei reni danneggiati. A differenza dei campioni per citometria a flusso, i tessuti fissi possono essere conservati a lungo termine con la conservazione delle proteine e delle strutture cellulari, consentendo un'indagine più approfondita delle cellule secretorie. Per testare questa ipotesi, i reni di topo sono stati danneggiati con un modello di AKI (cisplatino) e un modello di CKD (nefropatia da acido aristolochico (AAN)), iniettati con BFA e colorati utilizzando tecniche standard di immunofluorescenza.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con il protocollo di utilizzo degli animali approvato dall'Institutional Animal Care and User Committee del Vanderbilt University Medical Center.

1. Animali

1. Utilizzare topi maschi BALB/c di 8-12 settimane (peso corporeo: circa 25 g) per la nefropatia indotta da cisplatino o acido aristolochico.
2. Assicurati che i topi siano sani e non abbiano segni evidenti di angoscia o ferite dovute al combattimento.
   NOTA: Le ferite, in particolare alla coda, potrebbero interferire con il protocollo qui descritto. I topi BALB/c sono stati scelti perché è più facile visualizzare la vena caudale per l'iniezione in questi topi. Il protocollo qui descritto funziona per altri ceppi di topi; Tuttavia, il dosaggio del cisplatino o dell'acido aristolochico può variare da ceppo a ceppo.

2. Iniezione di cisplatino

1. Sciogliere il cisplatino in soluzione fisiologica sterile fino a una concentrazione finale di 1 mg/mL.
   NOTA: Il cisplatino non si dissolve completamente a temperatura ambiente. Dovrebbe essere maneggiato in una cappa aspirante.
2. Riscaldare la soluzione di cisplatino in un bagno d'acqua a 37 °C e agitare ripetutamente fino a quando il cisplatino non si è completamente sciolto.
3. Pesare i topi e calcolare il volume di soluzione di cisplatino necessario per iniettare 20 mg/kg di peso corporeo (p.c.).
4. Disinfettare la pelle addominale utilizzando tamponi di iodio povidone (7,5%) e alcol (70%) alternati 3 volte ciascuno.
5. Utilizzando una siringa da insulina con un ago da 25 G, iniettare la soluzione di cisplatino per via intraperitoneale.
6. Procedere al paragrafo 4 il giorno 3 dopo l'iniezione.

3. Iniezione di acido aristolochico (AA)

1. Sciogliere l'acido aristolochico-I in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) a una concentrazione finale di 0,5 mg/mL.
   NOTA: AA deve essere maneggiato in una cappa aspirante. L'AA-I deve essere usato in quanto è la forma dominante che induce danno renale.
2. Riscaldare la soluzione di AA a bagnomaria a 37 °C e agitare ripetutamente fino a completa dissoluzione.
3. Pesare i topi e calcolare il volume della soluzione di AA per iniettare 5 mg/kg di peso corporeo.
4. Disinfettare la pelle addominale con tampone di iodio povidone (7,5%) e alcol (70%) 3 volte.
5. Utilizzando una siringa da insulina con un ago da 25 G, iniettare la soluzione di AA per via intraperitoneale.
6. Iniettare AA a giorni alterni per un totale di 3 iniezioni.
7. Procedere al paragrafo 4 il giorno 42 dopo l'ultima iniezione.

4. Preparazione della soluzione di BFA

1. Sciogliere il BFA in dimetilsolfossido alla concentrazione di 10 mg/mL per ottenere una soluzione madre.
2. Conservare la soluzione madre a -20 °C.
3. Diluire la soluzione madre di BFA con PBS sterile alla concentrazione di lavoro finale di 1,25 mg/mL
   NOTA: Preparare una soluzione di lavoro fresca ogni volta immediatamente prima dell'iniezione.

5. Iniezione della vena caudale di BFA

1. Prima dell'iniezione, mettere la gabbia per metà e per metà fuori da un termoforo per 10 minuti per assicurarsi che i topi siano caldi per evitare un calo della temperatura corporea, che può causare vasocostrizione dei vasi nella coda e interferire con l'iniezione.
   NOTA: Posizionare la gabbia sui cuscinetti riscaldanti in modo che metà della gabbia sia sul cuscinetto mentre l'altra metà no. In questo modo, quando i topi si sentono caldi, possono spostarsi dall'altra parte della gabbia e viceversa.
2. Trattieni i topi utilizzando dispositivi di ritenuta disponibili in commercio di dimensioni adeguate.
3. Disinfettare la coda con iodio povidone e tampone imbevuto di alcol tre volte come descritto sopra.
4. Tenere la coda orizzontalmente e visualizzare le vene laterali della coda (Figura 1C). Usa una fonte di luce sotto la coda per aiutare a visualizzare le vene.
5. Inserire un ago da 28 G, mantenendo l'ago e la siringa paralleli alla vena verso la direzione della testina.
6. Iniettare 200 μL della soluzione di BFA da 1,25 mg/mL (0,25 mg BFA). Attendere che la vena diventi chiara mentre il sangue viene sostituito con la soluzione iniettabile, indicando che l'iniezione ha avuto successo.
7. Rimuovere l'ago e premere delicatamente la coda fino a quando l'emorragia non si ferma.
8. Rimetti i topi nella gabbia e monitorali per ulteriori sanguinamenti o segni di angoscia.

6. Sacrificio e raccolta dei reni

1. Eutanasia dei topi con un sovradosaggio di isoflurano seguito da lussazione cervicale 6 ore dopo l'iniezione di BFA.
   NOTA: Il punto temporale di 6 ore è stato scelto sulla base della letteratura che dimostra che 6 ore di trattamento con BFA in altri organi consentono un accumulo sufficiente di citochine all'interno delle cellule per visualizzarle mediante colorazione immunofluorescente¹⁶.
2. Immediatamente dopo il sacrificio, esporre l'addome e il cuore del topo mediante un'incisione ventrale sulla linea mediana.
3. Raccogliere 100-500 μl di sangue per un test dell'azoto ureico (BUN) nel sangue mediante puntura cardiaca. Utilizzare aghi da 25 G con siringhe da insulina da 1 ml per raccogliere il sangue. Per prevenire la coagulazione, aggiungere 5 μL di soluzione di eparina (100 mg/15 mL di dH₂O) a ciascun campione.
   NOTA: Per il test dell'azotemia sono necessari almeno 20 μL di sangue; tuttavia, circa 500 μL possono essere raccolti mediante puntura cardiaca dopo l'eutanasia, il che potrebbe essere utile per altri test. Raccogli quanto più sangue possibile.
4. Conservare i campioni di sangue in ghiaccio fino a quando i reni non sono stati raccolti nella sezione 7 di seguito.
   1. Centrifugare i campioni di sangue a 1.300 × g per 10 minuti.
   2. Isolare delicatamente il plasma e conservarlo a -20 °C fino al momento di eseguire il test dell'azotemia nella sezione 17. In alternativa, conservare i campioni di plasma per i dosaggi della creatinina.

7. Perfusione e rimozione dei reni

1. Perfondere il topo con 10-20 mL di PBS attraverso il ventricolo sinistro utilizzando una siringa da 20 mL a una velocità di flusso di 2-4 mL/min fino a quando il perfusato diventa limpido.
2. Rimuovere i reni tenendo l'arteria renale e la vena con una pinza vicino alla papilla e tagliando i vasi sul lato lontano dal rene.
3. Rimuovere delicatamente la capsula renale staccandola a mano o con un paio di pinze sottili e sterili.
4. A seconda dell'anticorpo, procedere alla sezione 8 per la preparazione del tessuto fissato incluso in paraffina o alla sezione 10 per la preparazione del tessuto congelato fissato.
   NOTA: Il processamento dei tessuti dovrà essere ottimizzato per ciascun anticorpo da utilizzare per la colorazione.

8. Tessuto incluso in paraffina per colorazione TGF-β e PDGF-D

1. Taglia in due il rene posizionandolo su un vetrino pulito e tagliandolo orizzontalmente con una nuova lama di rasoio. Mettere una metà in 10 mL di paraformaldeide al 4% (PFA) in PBS per 24 ore su un rotatore end-over-end a una velocità di 10 rotazioni al minuto (rpm).
   NOTA: L'intero rene non è necessario per il sezionamento. Una metà del rene può essere conservata o utilizzata per altri test.
2. Sostituire il PFA con etanolo al 70%.
3. In questa fase, sottoporre la metà del rene per la lavorazione e l'inclusione in paraffina, quindi sezionare i tessuti renali inclusi in paraffina a 4-6 μm utilizzando un microtomo e montarli su vetrini caricati e prepuliti^17,18.
   NOTA: I reni sono stati processati e incorporati in paraffina dalla Vanderbilt University Medical Center Translational Pathology Shared Resource e conservati a temperatura ambiente.

9. Deparaffinazione e reidratazione

1. Posizionare i vetrini in un rack per la colorazione dei vetrini e immergerli in un pozzetto di colorazione contenente D-limonene per 5 minuti, assicurandosi che il tessuto sia completamente sommerso. Ripetere in un pozzetto contenente D-Limonene fresco.
2. Reidratare i tessuti immergendo i vetrini in diluizioni seriali di etanolo al 100% (2x), 95%, 90% e 70% per 5 minuti ciascuno.
3. Lavare i vetrini in corrente dH₂O per 5 min.
4. Eseguire il recupero dell'antigene incubando le sezioni in tampone citrato (pH 6,0) in una pentola a pressione a 121 °C e 15 psi per 45 minuti.
5. Lavare i vetrini in corrente dH₂O per 20 min.
6. Procedere alla sezione 12.

10. Preparazione del tessuto congelato per la colorazione CTGF

1. Dividere in due il rene lungo l'asse orizzontale utilizzando una lama di rasoio fresca.
   NOTA: L'intero rene non è necessario per il sezionamento. Una metà del rene può essere conservata o utilizzata per altri test.
2. Mettere la metà del rene in 10 mL di PFA allo 0,5% in una provetta da 15 mL su un rotatore per 2 ore a 4 °C a una velocità di 10 giri/min.
3. Decantare il PFA in un contenitore per un corretto smaltimento e aggiungere 10 ml di glicina 0,1 M in PBS per 1 ora a 4 °C a una velocità di 10 giri/min.
4. Decantare la glicina, aggiungere 10 mL di saccarosio al 15% disciolto in PBS e posizionare la provetta su un rotatore per una notte a 4 °C e 10 giri/min.
5. Decantare il saccarosio al 15% e sostituirlo con 10 mL di saccarosio al 30% disciolto in PBS per 1 ora a 4 °C e 10 giri/min.
6. Riempire lo stampo da incasso con il composto per la temperatura di taglio ottimale (OCT) e incorporare la metà del rene dal passaggio 10.5 con la superficie di taglio del rene rivolta verso il basso.
7. Posizionare con cura lo stampo contenente il mezzo rene e l'OCT in una pozza di azoto liquido per congelare.
   NOTA: Non lasciare che l'azoto liquido entri in contatto diretto con l'OCT in quanto ciò può causare la formazione di bolle. Quando si utilizza l'azoto liquido, è necessario indossare dispositivi di protezione individuale adeguati, come occhiali/visiera, guanti criogenici e camice da laboratorio. È meglio usare una pinza lunga, ~25 cm, per posizionare gli stampi nell'azoto liquido.
8. Una volta congelato, conservare lo stampo a -80 °C.

11. Sezionamento congelato

1. Assicurarsi che il criostato sia a -20 °C.
2. Conservare gli stampi contenenti i campioni in OCT nel criostato a -20 °C per 2 ore per equilibrare la temperatura.
3. Rimuovere lo stampo tenendo le linguette e premendo dal basso.
4. Mettere l'OCT fresco su un portacampioni e posizionare il blocco di campioni congelato sopra, con il lato del tessuto rivolto lontano dal portacampioni.
5. Posizionare il portacampioni e il campione sul ripiano di congelamento.
6. Posiziona un estrattore di calore ponderato sopra il blocco per appiattire la superficie. Tenere chiuso il coperchio del criostato quando non è in uso per evitare fluttuazioni di temperatura.
7. Una volta che l'OCT fresco tra il blocco del campione e il supporto del campione è congelato, verificare che la connessione sia sicura.
8. Fissare il portacampioni sulla testa del microtomo del criostato.
9. Iniziare il sezionamento fino a quando il tessuto non è visibile nel blocco del campione.
10. Sezionare il tessuto renale a 4-6 μm e prelevare le sezioni su un vetrino caricato a temperatura ambiente¹⁹.
11. Una volta prelevato il fazzoletto, conservare il vetrino a una temperatura compresa tra -20 °C e -80 °C fino al momento della colorazione. Non lasciarlo scongelare fino al momento di iniziare a colorare.
12. Prima di colorare, rimuovere i vetrini dal deposito e lasciarli riscaldare a temperatura ambiente. Non lasciare asciugare le ciocche.
13. Una volta a temperatura ambiente, lavare immediatamente le sezioni con PBS per 5 minuti due volte a temperatura ambiente per eliminare il composto OCT.
14. Procedere alla sezione 12.

12. Colorazione in immunofluorescenza

1. Delineare le sezioni di tessuto con un pennarello barriera idrofobico. Mantenere una distanza di almeno 5 mm dal tessuto al contorno della barriera idrofobica.
2. Aggiungere 50 μl di tampone bloccante contenente il 3% di siero d'asino e lo 0,1% di Triton in albumina sierica bovina all'1%/soluzione salina tamponata con Tris (TBS) sulla parte superiore della sezione e incubare per 1 ora a temperatura ambiente in una camera umidificata.
3. Diluire gli anticorpi primari con PBS alla concentrazione appropriata. Per la rilevazione delle citochine, utilizzare 50 μl di soluzioni di anticorpi primari diretti contro TGF-β1 (1:200), PDGF-D (1:400) e CTGF (1:200). Per marcare i miofibroblasti, utilizzare 50 μl di una soluzione dell'anticorpo primario diretto contro l'actina del muscolo liscio alfa (α-SMA) coniugata con Cy3 a 1:200.
4. Rimuovere la soluzione bloccante e aggiungere gli anticorpi primari alla sezione, assicurandosi che non fuoriesca dal contorno idrofobico circolare e incubare per una notte a 4 °C in una camera umidificata. Riapplicare la barriera idrofobica in caso di perdite.
5. Lavare 3 volte con PBS per 5 min.
6. Diluire gli anticorpi secondari appropriati a 1:200 con PBS.
7. Incubare i campioni con 50 μL di soluzioni di anticorpi secondari per 1 ora a temperatura ambiente in una camera umidificata.
8. Lavare con PBS per 5 min.
9. Lectina diluita di tetragonolobus di loto (LTL) coniugata con fluoresceina in PBS con Ca²⁺ e Mg²⁺ alla concentrazione di 10 μg/mL.
   NOTA: Ca²⁺ e Mg²⁺ sono necessari per il legame LTL.
10. Incubare i tessuti con 50 μL di soluzione LTL per 30 minuti a temperatura ambiente in una camera umidificata.
11. Lavare con PBS con Ca²⁺ e Mg²⁺ per 5 min.
12. Incubare con 50 μL di 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, 5 μg/mL in acqua) per colorare DNA/nuclei per 5 minuti a temperatura ambiente.
13. Montare i vetrini coprioggetti aggiungendo 20 μL di reagente di montaggio antisbiadimento sul tessuto e posizionando lentamente il vetrino coprioggetti. Attendere 24 ore affinché il reagente antidissolvenza si solidifichi prima di eseguire l'imaging.
    NOTA: Il legame della lectina può degradarsi nel tempo, con conseguente perdita di segnale. È meglio eseguire l'imaging dei campioni colorati con lectina subito dopo l'impostazione del reagente di montaggio. Se si osserva una perdita di segnale, è possibile aggiungere Ca²⁺ e Mg²⁺ al reagente di montaggio per preservare la colorazione.

13. Acquisizione dell'immagine

1. Accendere il microscopio invertito (vedere la Tabella dei materiali) con un tavolino XY automatizzato.
2. Seleziona l'obiettivo 20x.
3. Aprire il software di acquisizione immagini (vedi Tabella dei Materiali).
4. Fare clic su Live per aprire la finestra di visualizzazione live.
5. Trova la sezione di tessuto e assicurati che sia a fuoco.
6. Fare clic sul menu Acquisisci e selezionare Scansiona immagine grande.
7. Nella finestra Scansione immagine grande , impostare l'area da scansionare spostando il tavolino utilizzando il joystick verso la parte più a sinistra della sezione del tessuto e fare clic sulla freccia sinistra. Ripetere l'operazione per i segmenti di tessuto superiore, destro e inferiore.
8. Fare clic sul menu di acquisizione .
9. Assicurati che la casella di controllo per l'immagine grande sia selezionata.
   1. Se acquisisci immagini multicanale, fai clic sulla scheda Lambda .
   2. Fare clic su ciascun canale e impostare il tempo di esposizione su un livello in cui la colorazione è evidente senza saturazione di alcuna parte dell'immagine.
      NOTA: queste impostazioni devono essere coerenti all'interno di un gruppo sperimentale. La modifica delle impostazioni di acquisizione tra i campioni porterà a risultati imprecisi.
   3. Ripetere il passaggio 9.2 per ogni canale da raccogliere.
10. Fare clic su Scansione.

14. Analisi delle immagini

1. Aprire il software di acquisizione delle immagini.
2. Fare clic su File | Apri e seleziona l'immagine.
3. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla finestra dell'immagine e scegliere la regione di interesse poligonale (ROI).
4. Delinea il ROI con lo strumento a mano libera . Delineare le cellule tubulari LTL-positive o le cellule interstiziali α-SMA-positive.
5. Fare clic sulla scheda Misurazione | Soglia.
6. Impostare i limiti superiore e inferiore della soglia regolando i cursori su entrambi i lati dell'area del segnale positivo.
7. Fare clic sulla scheda ROI .
8. Fare clic sull'icona Esporta per salvare i valori. Utilizza il software per fogli di calcolo per calcolare la percentuale di area del segnale positivo/area ROI.

15. Alternativa: analisi delle immagini con software gratuito (ImageJ)

1. Aprire ImageJ.
2. Fare clic su File | Apri per visualizzare un'immagine.
3. Fare clic su Selezioni a mano libera.
4. Seleziona il ROI delineando con lo strumento a mano libera . Delineare le cellule tubulari LTL-positive o le cellule interstiziali α-SMA-positive.
5. Fare clic sul menu Modifica e selezionare Cancella esterno.
6. Fare clic su Analizza e selezionare Misura per determinare l'area di ROI.
7. Vai all'immagine | Colore | Canali divisi.
8. Regolare i limiti superiore e inferiore della soglia per rilevare l'area del segnale positivo.
9. Fare clic su Analizza e selezionare Misura.
10. Salvare i dati.
11. Apri i dati con il software per fogli di calcolo e calcola il rapporto tra area del segnale positivo e area ROI.

16. Opzionale: imaging con microscopio confocale a scansione laser

NOTA: Per ottenere immagini a risoluzione più elevata per la pubblicazione, la microscopia confocale a scansione fornisce immagini più chiare e uno sfondo ridotto nel tessuto renale.

1. Accendere il microscopio confocale a scansione laser (vedere la Tabella dei materiali).
2. Selezionare l'obiettivo 40x (vedere la tabella dei materiali).
3. Fare clic sulla scheda Individua e trovare i tessuti regolando la messa a fuoco.
4. Vai alla scheda Acquisizione , fai clic su Canali e scegli 1 AU nell'impostazione stenopeica.
5. Regolare l'intensità del guadagno laser in ciascun canale in modo che il segnale positivo sia visibile ma non saturo. Assicurarsi che le impostazioni all'interno di un set di campioni sperimentali rimangano costanti.
6. Fare clic su Snap e salvare l'immagine nel formato desiderato.

17. Livello di azotemia plasmatica

1. Prelevare i campioni da -20 °C e scongelarli con ghiaccio.
2. Diluire il plasma con dH₂O in rapporto 1:10.
3. Per ogni campione, impostare tre reazioni separate in duplicato in una piastra a 96 pozzetti.
   1. Per il campione più lo standard, aggiungere 5 μl di urea da 200 mg/dl e 20 μl di plasma diluito.
   2. Per il solo campione, aggiungere 5 μL di dH₂O e 20 μL di plasma diluito.
   3. Per il bianco del campione, aggiungere 5 μL di dH₂O e 20 μL di plasma diluito.
4. Miscelare 85 μl di reagente + 1 μl di ureasi per campione per preparare la soluzione di lavoro.
5. Aggiungere 80 μl della soluzione di lavoro ai pozzetti "campione più standard" e "campione solo".
6. Aggiungere 80 μl di reagente (senza ureasi) al pozzetto del "bianco del campione" del passaggio 17.3 sopra.
7. Picchiettare delicatamente la piastra per mescolarla e incubarla per 5 minuti a temperatura ambiente.
8. Lettura di OD₅₆₀ con un lettore di targhe.
9. Calcolare la concentrazione di urea Eq (1) e convertirla in BUN utilizzando Eq (2).
   Urea (mg/dL) = (Campione da solo-Campione bianco)/(Standard-Campione da solo) x (Standard/4) x (fattore di diluizione) (1)
   BUN (mg/dL) = Concentrazione di urea/2,14 (2)
   NOTA: Questo test misura il contenuto di urea (peso molecolare: 60) del siero; tuttavia, BUN fa riferimento solo al contenuto di azoto dell'urea (peso molecolare: 28). Pertanto, è necessaria una correzione di 2,14 (60/28) per convertire la concentrazione di urea in BUN.

Risultati

Per esaminare il ruolo delle cellule epiteliali tubulari nella produzione di citochine in seguito all'AKI indotta da cisplatino, il cisplatino è stato iniettato a una concentrazione di 20 mg/kg seguito da un'iniezione endovenosa di 0,25 mg di BFA il giorno 3 dopo l'iniezione di cisplatino. I reni sono stati prelevati 6 ore dopo. I reni inclusi in paraffina sono stati sezionati e colorati con TGF-β, PDGF-D e CTGF, citochine rappresentative responsabili della riparazione tissutale nell'AKI. Come mostrato nella

Discussione

È noto che i PTC renali regolano AKI e CKD attraverso la secrezione di TGF-β, TNF-α, CTGF, PDGF, fattore di crescita dell'endotelio vascolare e molte altre proteine 20,21,22,23. Allo stesso modo, i glomeruli, i tubuli distali e altre cellule epiteliali renali, così come le cellule interstiziali, secernono queste e/o altre proteine durante la lesione 24,25,26.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Siringhe da insulina da 1 ml	BD	329654
Siringa da 10 ml	BD	302995
tubo da 2 ml	marca Fisher	05-408-138
Siringa da 20 ml	BD	302830
aghi da 25 G BD		305125
aghi da 28 g BD		329424
piastra a 96 pozzetti	Corning	9017
Acido aristolochico-I	Sigma-Aldrich	A9461
&alfa;-SMA anticorpo coniugato con Cy3	Sigma-Aldrich	C6198	RRID:AB_476856
Lama per criostato	C.L. Sturkey. Inc	DT315R50
Albumina sierica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
Brefeldin A	Sigma-Aldrich	B6542
Cisplatino	Sigma-Aldrich	P4394
Acido citrico	Sigma-Aldrich	791725
Microscopio confocale	ZEISS	LSM710
Obiettivi per microscopia confocale	ZEISS	40x / 1.10 LD C-Apochromat ACQUA
Software confocale	ZEISS	ZEN
Barattolo Coplin	Fisher Scientific	19-4
Vetro di copertura	marca	12545F
Criostato	Leica	CM1850
CTGF anticorpo	Genetex	GTX124232	RRID:AB_11169640
Cy3-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	711-165-152	RRID: AB_2307443
Cy5-AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	705-175-147	RRID: AB_2340415
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Stampi di base monouso marca	Fisher	22-363-553
siero d'asino	Jackson immunoresearch	017-000-121
Ethanol	Decon Labs, Inc.	2701
Pinze	VETUS	ESD-13
Glycine	Fisher marca	12007-0050
Cuscinetti riscaldanti	Kent scientific	DCT-20
Eparina sale sodico	ACROS organics	41121-0010	100mg/15ml di dH2O
Camera umidificata	Invitrogen	44040410	Una scatola di plastica ricoperta di pellicola può essere utilizzata come camera umidificata alternativa.
Siringhe da insulina	BD	329461
Microscopio invertito	NIKON	Eclipse Ti-E2	immunofluorescenza
KIM-1 anticorpo	R & D	AF1817	RRID: AB_2116446
Lemozolo (isto-chiaro)	Diagnostica nazionale	HS-200
loto tetragonolobus lectina	Vettore	FL-13212
Vetrino per microscopio	Fisher scientific	12-550-343
Microtomo	Reichert	Jung 820 II
fotocamera CMOS monocromatica	NIKON	DS-Qi-2
Kit chirurgico per topi	Kent scientific	INSMOUSEKIT
NIS Elements	NIKON Obiettivi NIKON
		Plan Apo 20x/0.75	software di acquisizione immagini collegato a Eclipse Ti-E2 (microscopio invertito)
OCT composto	Scigen	4586
Pap pen	Vector	H-4000
PBS con calcio e magnesio	Corning	21-030-CV
PBS senza calcio e magnesio	Corning	21-031-CV
PDGF-D anticorpo	Thermo-Fisher scientific	40-2100
PFA	Microscopia elettronica Scienza	15710	RRID: AB_2533455
Lettore di piastre	Promega	GloMax® Scopri Microplate Reader	4% PFA è diluito dal 16% in PBS.
povidone-iodio (Betadine)	Avrio Health L.P.	NDC 67618-151-17
Pentola a pressione	Tristar 8	Qt. Power Cooker Plus
Reagente Antidissolvenza ProLong Gold	Invitrogen	P36930
Kit di analisi Quantichrom Urea (BUN) II	BioAssay Systems	DUR2-100
Lama di rasoio a filo singolo per dissezione renale (.009", 0,23 mm)	Strumenti IDL	521013
Scaldavetrini	Lab Scientific Inc.,	XH-2001
Software	NIKON	NIS elements
Saccarosio	RPI	S24060
TGF-b1 anitbody	Sigma-Aldrich	SAB4502954
Tris EDTA tampone	Corning	46-009-CM	RRID: AB_10747473
Citrato trisodico diidrato	Sigma-Aldrich	SLBR6660V
Citrato trisodico diidrato	Sigma-Aldrich
Triton	Sigma-Aldrich	9002-93-1
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
Vetrino per microscopio caricato in vetro bianco, dimensioni 25 x 75 mm, bordi rettificati, globo smerigliato blu	Scientific	1358D