Usare l'optogenetica per invertire la neuroplasticità e inibire la ricerca di cocaina nei ratti

Summary

I metodi qui descritti delineano una procedura utilizzata per invertire optogeneticamente la plasticità indotta dalla cocaina in un circuito comportamentale rilevante nei ratti. La stimolazione ottica sostenuta a bassa frequenza delle sinapsi talamo-amigdala induce depressione a lungo termine (LTD). La LTD indotta optogeneticamente in vivo in ratti con esperienza di cocaina ha determinato la successiva attenuazione della ricerca di droga motivata da spunti.

Abstract

Questo protocollo dimostra i passaggi necessari per utilizzare strumenti optogenetici per invertire la plasticità indotta dalla cocaina nei circuiti talamo-amigdala per ridurre i successivi comportamenti di ricerca della cocaina nel ratto. Nella nostra ricerca, abbiamo scoperto che quando i ratti si auto-somministrano cocaina per via endovenosa accoppiata con un segnale audiovisivo, le sinapsi si formano agli input dal nucleo genicolato mediale del talamo (MGN) sui principali neuroni dell'amigdala laterale (LA) diventano più forti man mano che viene appresa l'associazione cue-cocaina. Abbiamo ipotizzato che l'inversione della plasticità indotta dalla cocaina in queste sinapsi ridurrebbe il comportamento di ricerca della cocaina motivato dal segnale. Per realizzare questo tipo di neuromodulazione in vivo, abbiamo voluto indurre la depressione sinaptica a lungo termine (LTD), che diminuisce la forza delle sinapsi MGN-LA. A tal fine, abbiamo usato l'optogenetica, che consente la neuromodulazione dei circuiti cerebrali usando la luce. L'opsina eccitatoria oChiEF è stata espressa sui terminali presinaptici MGN nel LA infondendo un AAV contenente oChiEF nel MGN. Le fibre ottiche sono state quindi impiantate nel LA e la luce laser a 473 nm è stata pulsata ad una frequenza di 1 Hz per 15 minuti per indurre LTD e invertire la plasticità indotta dalla cocaina. Questa manipolazione produce una riduzione duratura della capacità dei segnali associati alla cocaina di indurre azioni di ricerca di droga.

Introduction

L'abuso di sostanze è un problema di salute pubblica molto serio negli Stati Uniti e in tutto il mondo. Nonostante decenni di intensa ricerca, ci sono pochissime opzioni terapeutiche efficaci ^1,2. Una grave battuta d'arresto per il trattamento è il fatto che l'uso cronico di droghe genera memorie associative a lungo termine tra i segnali ambientali e il farmaco stesso. La riesposizione a segnali correlati alla droga guida risposte fisiologiche e comportamentali che motivano il consumo continuato di droghe e la ricaduta³. Una nuova strategia terapeutica è quella di mettere in atto tratta....

Protocol

Gli esperimenti descritti in questo protocollo erano coerenti con le linee guida stabilite dalla National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals e sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università di Pittsburgh. Tutte le procedure sono state eseguite utilizzando ratti Sprague-Dawley adulti e ingenui che pesavano 275-325 g all'arrivo.

1. Costruzione di impianti in fibra ottica e cavi patch

1. Preparare impianti di fibre ottiche seguendo protocolli precedentemente pubblicati⁹. Gli esperimenti descritti in questo protocol....

Results

Una sequenza temporale che delinea l'ordine degli esperimenti è mostrata nella Figura 1. Durante gli esperimenti comportamentali, il numero di infusioni di cocaina e il numero di risposte effettuate sulla leva attiva servono come misura dell'intensità del comportamento di ricerca della cocaina. Durante i primi giorni di auto-somministrazione di cocaina, il numero di risposte attive dovrebbe aumentare gradualmente durante ogni giorno di acquisizione, prima di stabilizzarsi durante la seconda .......

Discussion

Come descritto sopra, ci sono diversi passaggi critici che sono importanti per ottenere i risultati sperimentali corretti. Il protocollo sarà probabilmente efficace solo negli animali che acquisiscono correttamente l'autosomministrazione di cocaina e, ad oggi, è stato testato solo utilizzando i parametri sopra descritti. È possibile che la dose di cocaina, il programma di rinforzo e i parametri di cue possano essere modificati con probabilmente scarso effetto sui risultati comportamentali, con l'eccezione che un programm.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,9% soluzione salina	Fisher Scientific	NC0291799
A.M.P.I. Stimolus Isolator	Iso-Flex
AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato	Duke Viral Vector Core (via Roger Tsien)	#268	Vedi Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014
AAV5.hSyn.tdTomato (Control)	Duke Viral Vector Core Control		Vedi Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014
Lacrime artificiali (unguento oftalmico)	Covetrus	70349
ATP Sale di magnesio	Fisher Scientific	A9187
Betadine	Butler Schein	38250
Cloruro di calcio	Fisher Scientific	C1016
Cloruro di cesio	Fisher Scientific	289329
Cesio idrossido	Fisher Scientific	516988
Cesio metansolfonato	Fisher Scientific	C1426
Cocaina HCl	NIDA Drug Supply Center	9041-001
Criostato	Leica	CM1950
D-glucosio	Sigma-Aldrich	G8270
DMSO	Fisher Scientific	BP231-1
Regolatore di temperatura a doppio canale	Warner Instruments	TC-344C
EGTA	Fisher Scientific	E3889
Etanolo	University of Pittsburgh Chimica Magazzino	200C5000
Tappi antipolvere per ghiere	Thor Labs	CAPL	Tappi antipolvere in plastica bianca per ghiere da 1,25 mm
Manicotti di accoppiamento	ghiere Lenti doriche	F210-3011	Sleeve_BR_1.25, bronzo, 1.25 mm ID
Puntali	Prodotti in fibra	di precisione MM-FER2007C-2300	Ø 1,25 mm Ghiera in ceramica LC/PC multimodale, Ø 230 μ m dimensione del foro
Fibra Ottica	Thor Labs	FP200URT	200 μ m core fibra multimodale (0,5 NA)
Giunto rotante in fibra ottica	Prizmatix	(ordinato da Amazon)	Diametro 18 mm, connettore FC-FC per fibra
Strumento di spelatura delle fibre	Thor Labs	T12S21
Fluoroshield con DAPI	Sigma-Aldrich	F6057
Gentamicina	Henry Schein	6913
GTP Sale di sodio	Fisher Scientific	G8877
Siringa Hamilton	Hamilton	80085	10 μ Volume L, 26 gauge, 2 pollici, stile a punta 3
Pistola termica	Allied Electronics	972-6966	250 V, 750-800 ° F
fibra	epossidica di precisione termopolimerizzabile	PFP-353ND-8OZ
Eparina	Henry Schein	55737
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Acido cloridrico	Fisher Scientific	219405490
Isoflurano	Henry Schein	29405
Ketamina HCl	Henry Schein	55853	La ketamina è una sostanza controllata e deve essere maneggiata secondo le linee guida istituzionali
s	Henry Schein	9846
Laser, driver e accoppiatore laser-fibra	OEM Laser	Systems BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0	100 mW, 473 nm, laser a stato solido pompato a diodi (un'opzione)
L-glutatione	Fisher Scientific	G4251
Lidocaina	Butler Schein	14583
Sensore di luce	Thor Labs	PM100D	Console compatta per contatore di energia con display digitale
Adesivo istantaneo Loctite	Grainger	5E207
Solfato di magnesio	Sigma-Aldrich	203726
Microelettrodo Amplificatore/Acquisizione dati	Dispositivi molecolari	MULTICLAMP700B / Digidata 1440A
Pompa per microiniettore	Harvard Apparatus	70-4501	Siringa doppia
Micromanipolatore	Sutter Instruments	MPC-200/ROE-200
Microscopio	Olympus	BX51WI	Microscopio verticale per elettrofisiologia
Microscopio	Olympus	BX61VS	Microscopio a scansione di vetrini epifluorescente
N-metil-D-glucamina	Sigma-Aldrich	M2004
Orthojet cemento dentale, liquido	Lang Dental	1504BLK	nero
Orthojet cemento dentale, polvere	Lang Dental	1530BLK	Polvere contemporanea, nero
Paraformaldeide	Sigma-Aldrich	P6148
Cavi patch	Thor Labs	FP200ERT	Multimodale, FT030 Tubo
Picrotossina	Fisher Scientific	AC131210010
Disco di lucidatura	Thor Labs	D50FC
Tampone per lucidatura	Thor Labs	NRS913	9" x 13"
Carta per lucidatura	Thor Labs	LFG5P	5 μ m grana
Carta per lucidatura	Thor Labs	LFG3P	3 μ m grana
Carta per lucidatura	Thor Labs	LFG1P	1 μ m grana
Carta per lucidatura	Thor Labs	LFG03P	0.3 μ m grana
Cloruro di potassio	Sigma-Aldrich	P9333
Idrossido di potassio	Fisher Scientific	P5958
Metanosolfonato di potassio	Fisher Scientific	83000
QX-314-Cl	Alomone Labs	Q-150
Rimadyl (Carprofen)	Henry Schein	24751
Autosomministrazione Chambers/Software	Med Associates	MED-NP5L-D1
Bicarbonato di sodio	Sigma-Aldrich	S5761
Cloruro di sodio	Sigma-Aldrich	S7653
Idrossido di sodio	Sigma-Aldrich	1064980500
L-ascorbato di sodio	Sigma-Aldrich	A7631
Pentobarbital di sodio	Henry Schein	24352
Fosfato di sodio	Sigma-Aldrich	S9638
Fosfocreatina di sodio	Fisher Scientific	P7936
Piruvato di sodio	Sigma-Aldrich	P2256
Viti a macchina in acciaio inossidabile	WW Grainger	6GB25	M2-0.40mm Vite a macchina , padella, Phillips, acciaio inossidabile A2, liscio, lunghezza 3 mm
Adattatore stereotassico per ghiere	Thor Labs	XCL
Stereotaxic Frame	Stoelting	51603
Saccarosio	Sigma-Aldrich	S8501
Filetto di sutura	Fine Science Tools	18020-50	Filo di seta; Dimensioni: 5/0, Diametro: 0,12 mm
TEA-Chloride	Fisher Scientific	T2265
Thiourea	Sigma-Aldrich	T8656
Vetbond Adesivo tissutale	Covetrus	001505
Vibratome	Leica	VT1200S
Xylazine	Butler Schein	33198