Viene presentato un protocollo dettagliato per la preparazione della diamide batteriostatica masarimicina, una sonda a piccola molecola che inibisce la crescita di Bacillus subtilis e Streptococcus pneumoniae mirando alla degradazione della parete cellulare. La sua applicazione come sonda chimica è dimostrata in saggi di sinergia/antagonismo e studi morfologici con B. subtilis e S. pneumoniae.
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Articolo metodologico
Sintesi di Masarimycin, un inibitore di piccole molecole della crescita batterica Gram-positiva
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il peptidoglicano (PG) nella parete cellulare dei batteri è una struttura macromolecolare unica che conferisce forma e protezione dall'ambiente circostante. Fondamentale per comprendere la crescita e la divisione cellulare è la conoscenza di come la degradazione del PG influenza la biosintesi e l'assemblaggio della parete cellulare. Recentemente, è stata riportata l'etichettatura metabolica di PG attraverso l'introduzione di zuccheri o amminoacidi modificati. Mentre l'interrogazione chimica dei passaggi biosintetici con inibitori di piccole molecole è possibile, gli strumenti di biologia chimica per studiare la degradazione del PG da parte delle autolisine sono sottosviluppati. Le autolisine batteriche sono un'ampia classe di enzimi coinvolti nella degradazione strettamente coordinata del PG. Qui, viene presentato un protocollo dettagliato per la preparazione di una sonda a piccola molecola, masarimycin, che è un inibitore della N-acetilglucosaminidasi LytG nel Bacillus subtilis e del metabolismo della parete cellulare nello Streptococcus pneumoniae. Viene fornita la preparazione dell'inibitore tramite sintesi organica classica e assistita da microonde. Viene presentata la sua applicabilità come strumento per studiare la fisiologia Gram-positiva nei saggi biologici.
Introduzione
Il peptidoglicano (PG) è un polimero a maglie che delinea la forma e la struttura cellulare nei batteri Gram-positivi e Gram-negativi 1,2. Questo eteropolimero è una matrice di amminozuccheri reticolati da peptidi corti 3,4,5,6 con una spina dorsale composta da residui alternati di N-acetilglucosamina (GlcNAc) e acido N-acetilmuramico (MurNAc) legati a β-(1,4) (Figura 1)1. Attaccato alla porzione di lattilo C-3 di MurNAc è il pept....
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Protocollo
1. Metodi generali
NOTA: Tutti i composti sono stati acquistati da fornitori standard e utilizzati senza ulteriore purificazione.
- Eseguire la cromatografia a strato sottile (TLC) su una piastra di alluminio prefigurata con gel di silice XG F254. Rileva le macchie sotto una lampada UV, immergendoti nella macchia di p-anisaldeide o esponendo al vapore I2 .
- Registra tutti gli spettri di risonanza magnetica nucleare (NMR) su uno spettrometro a 400 MHz.
NOTA: 1H-NMR e 13spettri C-NMR sono stati riferiti ai picchi di solvente residuo. Le costanti di accoppiamento so....
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Risultati
Masarimycin è un inibitore batteriostatico a piccola molecola di B. subtilis e S. pneumoniae e ha dimostrato di inibire il GlcNAcase LytG eso-agente in B. subtilis35,37 e di colpire la parete cellulare in S. pneumoniae37. La masarimicina può essere preparata in modo efficiente sia dalla sintesi organica classica che da quella assistita da microonde con rese nell'intervallo 55%-70%. La sintesi assistita d.......
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Discussione
Masarimycin è un singolo inibitore batteriostatico micromolare della crescita di B. subtilis35 e S. pneumoniae37 . In B. subtilis, masarimycin ha dimostrato di inibire il GlcNAcase LytG35, mentre il bersaglio molecolare preciso nella parete cellulare di S. pneumoniae non è stato identificato37. La sintesi di masarimicina utilizzando la classica sintesi organica o la procedura a microonde fornisce l'i.......
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Dichiarazioni
Reid, C. W. ha proprietà intellettuale che coinvolge applicazioni specifiche di masarimycin.
Ringraziamenti
La ricerca è stata sostenuta dalla National Science Foundation con il numero di sovvenzioni 2009522. L'analisi NMR della masarimicina è stata supportata dal premio del programma di strumentazione di ricerca della National Science Foundation con il numero di sovvenzione 1919644. Eventuali opinioni, risultati e conclusioni o raccomandazioni espresse in questo materiale sono quelle degli autori e non riflettono necessariamente le opinioni della National Science Foundation.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acido 2-iodobenzoico | SIGMA-ALDRICH | I7675-25G | polvere corrosiva, irritante, da giallo chiaro ad arancio-marrone |
| 2-propanolo | SIGMA-ALDRICH | 109827-4L | liquido infiammabile, irritante, incolore |
| Acetonitrile | SIGMA-ALDRICH | 34851-4L | liquido infiammabile, irritante, incolore |
| Piastre di silice con supporto in alluminio | Sorbtech | 4434126 | gel di silice XG F254 su piastre con supporto in alluminio |
| cloroformio-d | SIGMA-ALDRICH | 151823-50G | solvente per spettrometro |
| di massa compatto | NMR Advion-Interchim | Advion CMS | dotato di sorgente APCI e sonda per l'analisi dei solidi atmosferici |
| Corning Costar 96 piastre a fondo piatto sterili | Chemical | 07-200-90 | per saggi di sinergia/antagonismo |
| vetrini coprioggetto | fisher chemical | 12-547 | per microscopia |
| Cicloesanocarbossaldeide | CHEM-IMPEX INT'L INC. | 24451 | infiammabile, irritante, da incolore a rosa |
| Cicloesil isocianuro | SIGMA-ALDRICH | 133302-5G | liquido irritante, incolore, odore estremamente sgradevole |
| Cicloesilammina | SIGMA-ALDRICH | 240648-100ML | liquido corrosivo, infiammabile, irritante, incolore a meno che non sia contaminato |
| Acetato di etile | SIGMA-ALDRICH | 537446-4L | infiammabile, irritante, incolore |
| cartuccia di silice flash liquida (12g) | Advion-Interchim | PF-50SIHP-F0012 | confezione di colonne di silice flash (12g) per la purificazione della formaldeide di masarimicina |
| SIGMA-ALDRICH | F8775-25ML | agente di fissaggio per microscopia | |
| HEPES | SIGMA-ALDRICH | H8651-25G | tampone per microscopia soluzione di fissaggio |
| Esano, miscela di isomeri | SIGMA-ALDRICH | 178918-4L | dannoso per l'ambiente, infiammabile, irritante, pericoloso per la salute, liquido incolore |
| Spettrometro di massa compatto ad alte prestazioni | Sonda | l'analisi | dei solidi atmosferici (ASAP), a bassa risoluzione |
| High Vac | eppendorf | Vacufuge più | vuoto aiutato dalla forza centrifuga e dalla temperatura |
| Acido cloridrico | SIGMA-ALDRICH | 258148-2.5L | corrosivo, irritante, incolore acido |
| cloridrico | SIGMA-ALDRICH | 320331-2.5L | acido |
| immersione olio | fisher chimico | 12-365-19 | per microscopia |
| Iodio, cristalli risublimati | Alfa Aesar | 41955 | dannoso per l'ambiente, irritante, pericoloso per la salute, cristalli grigio scuro/viola |
| Mestre Mnova | MestreLab Research | software per l'elaborazione degli spettri NMR | |
| Metanolo | SIGMA-ALDRICH | 439193-4L | infiammabile, tossico, pericoloso per la salute, liquido incolore |
| blu di metilene | SIGMA-ALDRICH | M9140-25G | colorante per microscopia per la colorazione delle pareti cellulari |
| piastre di agar meuller-hinton + 5% di sangue di pecora | fisher chimico | B21176X | terreno di crescita per Streptococcus pneumoniae |
| brodo meuller-hinton | fisher chemical | DF0757-17-6 | terreni di crescita per vetrini per microscopio Streptococcus pneumoniae |
| fisher | chemical | 22-310397 | per microscopia |
| Labstation di sintesi a microonde | Dispositivo MILESTONE | START SYNTH | che richiede la ventilazione di una cappa aspirante, dotato di tubi NMR a carosello |
| di sintesi SIGMA-ALDRICH | Z562769-5EA | tubi NMR da 5 mm 600 MHz | |
| Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) | Bruker | Ascend 400 | grande magnete superconduttore (400MHz) |
| optocina | Fisher chimico | AAB21627MC | etilidrocupreina cloridrato |
| piastre di Petrie | Celltreat | 229695 | per la preparazione di piastre di agar per la crescita batterica |
| Primo Star Microscopio a campo chiaro/contrasto di fase con fotocamera ERc5s | Zeiss | per studi morfologici | |
| puriFlash | interchim | XS520plus | sistema di purificazione per cromatografia flash |
| resazurin | SIGMA-ALDRICH | R7017-1G | per saggi di sinergia/antagonismo |
| Evaporatore rotante | Heidolph | Hei-VAP Value Evaporatore a solvente "The Collegiate" | |
| Bicarbonato di sodio | SIGMA-ALDRICH | S6014-500G | irritante, bianco polvere |
| Cloruro di sodio | fisher chimico | S271-1 | cristallino, incolore |
| Cloruro di sodio | SIGMA-ALDRICH | S5886-500G | per la crescita di B.subtilis e la preparazione di terreni LB |
| Solfato di sodio | SIGMA-ALDRICH | 7985592-500G | anidro, granulare, bianco |
| triptone | fisher chimico | BP1421-500 | per la crescita di B.subtilis e preparazione di LB media |
| Whitney DG250 Workstation | Microbiology International | DG250 | workstation anaerobica workstation. Miscela di gas anaerobici utilizzata: 5% di idrogeno, 10% di anidride carbonica, equilibrio azoto |
| estratto di lievito | Fisher Chemical | BP1422-500 | per la crescita di B.subtilis e la preparazione di LB media |
| Zen Lite (blu) software | Zeiss per l'acquisizione | di micrografie |
Riferimenti
- Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiology Review. 32 (2), 149-167 (2008).
- Munita, J. M., Bayer, A. S., Arias, C. A. Evolving resistance among Gram-positive pathogens. Clinical Infectious Diseases. 61, suppl-2 48....
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Ristampe e permessi
