Per ottenere un insetto ascianico, la sua superficie dell'uovo viene sterilizzata e la larva tratteggiata viene successivamente allevata usando foglie astronche. Questo metodo fornisce un modo efficiente per la preparazione degli insetti axenici senza somministrare antibiotici o sviluppare una dieta artificiale, che può essere applicata anche ad altri insetti mangiatori di foglie.
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Articolo metodologico
Preparazione e allevamento di insetti axenici con piantine coltivate su tessuto per studi di interazione microbiota ospite-intestino dello scarabeo fogliare
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le viscere degli insetti sono colonizzate da diversi batteri che possono avere un impatto profondo sui tratti fisiologici dell'ospite. L'introduzione di un particolare ceppo batterico in un insetto astronico è un metodo potente per verificare la funzione microbica intestinale e chiarire i meccanismi alla base delle interazioni tra microbi intestinali e ospiti. La somministrazione di antibiotici o la sterilizzazione delle superfici delle uova sono due metodi comunemente usati per rimuovere i batteri intestinali dagli insetti. Tuttavia, oltre ai potenziali effetti avversi degli antibiotici sugli insetti, studi precedenti hanno indicato che l'alimentazione di antibiotici non poteva eliminare i batteri intestinali. Pertanto, le diete artificiali prive di germi sono generalmente impiegate per mantenere gli insetti ascinici, che è un processo noioso e laborioso che non può assomigliare completamente ai componenti nutrizionali nel cibo naturale. Qui è descritto un protocollo efficiente e semplice per preparare e mantenere le larve axeniche di uno scarabeo fogliare (Plagiodera versicolora). In particolare, le superfici delle uova di coleottero sono state sterilizzate, in seguito alle quali sono state utilizzate foglie di pioppo prive di germi per allevare larve astronche. Lo stato astronico degli insetti è stato ulteriormente confermato attraverso saggi dipendenti dalla cultura e indipendenti dalla coltura. Collettivamente, combinando la disinfezione delle uova e la coltivazione priva di germi, è stato sviluppato un metodo efficiente e conveniente per ottenere L. versicolora axenico, fornendo uno strumento facilmente trasferibile per altri insetti mangiatori di foglie.
Introduzione
Simile ai mammiferi, il tratto digestivo degli insetti è una cavità per la digestione e l'assorbimento del cibo. La maggior parte degli insetti ospita diversi batteri commensali che prosperano nelle loro viscere e vivono di nutrizione fornita dagli ospiti1. La comunità commensale intestinale ha un profondo impatto su molteplici processi fisiologici negli insetti, tra cui digestione e disintossicazione degli alimenti 2,3,4, nutrizione e sviluppo 5,6,7, difesa contro agenti patogeni e....
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Protocollo
1. Allevamento di insetti
- Mantenere la popolazione di P. versicolora in una camera di crescita a 27 °C e 70 ± 5% di umidità relativa con un fotoperiodo di 16 ore di luce/8 ore di buio. Mettili in scatole di plastica perforate con carta assorbente bagnata piastrellata e dai loro da mangiare rami di pioppo freschi. Spruzzare acqua pulita sulla carta assorbente per mantenere l'umidità e cambiare i rami ogni due giorni.
- Isolare gli adulti per l'ovodeposizione dopo la pupa. Dai loro da mangiare foglie tenere per ottenere più uova.
- Raccogli le uova appena deposte (entro 24 ore). Posizionare le uova su carta assorbente ....
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Risultati
Le fasi di vita di P. versicolora sono mostrate nella Figura 1. Il maschio adulto è più piccolo della femmina adulta (Figura 1A). Nel campo, lo scarafaggio raggruppa le sue uova su una foglia; qui, quattro uova sono state staccate da una foglia (Figura 1B). I segmenti e le piantine di stelo di pioppo utilizzati per l'allevamento di insetti axenici sono mostrati nella Figura 2. L'intestino di un.......
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Discussione
La preparazione di larve prive di germi e l'ottenimento di larve gnotobiotiche reintroducendo specifici ceppi batterici sono metodi potenti per chiarire i meccanismi alla base delle interazioni ospite-microbo. Le larve appena nate ottengono il microbiota intestinale in due modi principali: trasmissione verticale dalla madre alla prole o acquisizione orizzontale dai fratelli e dall'ambiente34. Il primo può essere soddisfatto dal trasferimento dei genitori alla prole attraverso la contaminazione del.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato dalla National Natural Science Foundation of China (31971663) e dal Young Elite Scientists Sponsorship Program di CAST (2020QNRC001).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,22 µ m filtri per siringhe | Millipore | SLGP033RB | |
| 1 mg/mL di | a. Preparare 0,1 M di soluzione di NaOH (sciogliere 0,8 g di NaOH in 200 mL di acqua distillata). b. Aggiungere 0,2 g di NAA in un becher da 250 mL, aggiungere un po' di soluzione di NaOH 0,1 M fino a quando il NAA non si è sciolto e regolare il volume finale a 200 mL con acqua distillata. c. Filtrare la soluzione per rimuovere i batteri con una soluzione 0,22 µ m e una siringa sterile da 50 mL, confezionare la soluzione in provette da centrifuga da 1,5 mL e rifornire a -20 °C. | ||
| Provette per microcentrifuga da 1,5 mL | Sangon Biotech F600620 | ||
| 10 PBS soluzione | |||
| 2 M KOH | Sciogliere 22,44 g di KOH (peso molecolare: 56,1) in 200 mL di acqua distillata e sterilizzare in autoclave per 20 minuti a 121 °C. | ||
| Becher da 250 mL e 2.000 mL | Shubo | sb16455 | |
| Siringhe sterili da 50 mL Jinta | JT0125789 | ||
| Cilindro graduato da 500 mL | Shubo | sb1601 | |
| 50x TAE soluzione | a. Sciogliere 242 g di Tris e 18,612 g di EDTA in 700 mL di acqua distillata. b. Regolare il pH a 7,8 con circa 57,1 mL di acido acetico. c. Regolare il volume finale a 1.000 mL. d. La soluzione madre è stata diluita in 1x tampone TAE quando è stata utilizzata. | ||
| 75% etanolo | Xingheda trade | ||
| α-naftalene acido acetico (NAA) | Solarbio Life Sciences | 86-87-3 | |
| Carta | 22,3 cm x 15,3 cm x 9 cm | ||
| Acido acetico | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Agar | Coolaber | 9002-18-0 | |
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Autoclave | Panasonic | MLS-3781L-PC | |
| Omogeneizzatore a perline | Jing Xin | XM-GTL64 | |
| Kit di estrazione del DNA | MP Biomedicals | 116560200 | |
| EDTA | Saiguo Biotech | 1340 | |
| Carta da filtro | Jiaojie | 70 mm | |
| di diametro Unità di elettroforesi | su gelBio-rad | 164-5052 | |
| Gel Signal Green colorante per acidi nucleici | TsingKe | TSJ003 | |
| pioppo prive di germi | Pioppo Shan Xin dell'Università di Ludong nella provincia di Shandong Golden | ||
| Star Super PCR Master Mix (1,1 volte) | TsingKe | TSE101 | |
| Camera di crescita | Ruihua | HP400GS-C | |
| LB agar medium | a. Sciogliere 5 g di triptone, 5 g di NaCl, 2,5 g di estratto di lievito in 300 mL di acqua distillata. b. Regolare il volume finale a 500 mL, trasferire la soluzione in un pallone conico da 1.000 mL e aggiungere 7,5 g di agar. c. Autoclavare il terreno per 20 minuti a 121 °C. | ||
| Mini centrifuga | DRAGONLAB | D1008 | |
| MS terreno basico | Coolaber | PM1121-50L | M0245 |
| MS terreno solido per coltura | a. Sciogliere 4,43 g di polvere di terreno basico MS e 30 g di saccarosio in 800 mL di acqua distillata. b. Regolare il pH a circa 5,8 con 2 M KOH con un pHmetro. c. Regolare il volume finale a 1.000 mL, Separare in due parti, trasferire in due matracci conici da 1.000 mL e aggiungere 2,6 g di agar per 500 mL. d. Autoclave per 20 min a 121 °C. | ||
| Spettrofotometro NanoDrop 1000 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Pennello | 1 cm di larghezza, utilizzato per raccogliere le uova | ||
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PCR Termociclatori | Eppendorf | 6331000076 | |
| piastre di Petri | Supin | 90 mm di diametro | |
| METTLER TOLEDO | FE20 | ||
| Pipette 0,2-2 & micro; L | Gilson | ECS000699 | |
| Pipette 100-1.000 & micro; L | Eppendorf | 3120000267 | |
| Pipette 20-200 &; L | Eppendorf | 3120000259 | |
| Pipette 2-20 & micro; L | Eppendorf | 3120000232 | |
| Contenitore per colture di tessuti vegetali | Chembase | ZP21 | 240 mL |
| Scatola | 2,35 L | ||
| Idrossido di potassio (KOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Primer per amplificare il gene batterico 16S rRNA | Sangon Biotech | 27-F: 5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3', 1492R: 5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3' | |
| Cloruro di sodio (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Idrossido di sodio (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Sfere | da 0,25 mm | utilizzate per macinare i tessuti | |
| Stereomicroscopio | OLYMPUS | SZ61 | |
| Saccarosio | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Trans2K plus II DNA marcatore | Transgene Biotech | BM121-01 | |
| Tris base | Biosharp Life Sciences | 1115 | |
| Triptone | Thermo Fisher Scientific | LP0037 | |
| Transilluminatore UV | Monad Biotech | QuickGel 6100 | |
| Vortexer | Scilogex | MX-S | |
| di salice | Sha Lake Park, Wuhan, Cina | ||
| Scarabeo | Huazhong Agricultural University, Wuhan, Cina | ||
| Estratto di lievito | Thermo Fisher Scientific | LP0021 |
Riferimenti
- Moran, N. A., Ochman, H., Hammer, T. J. Evolutionary and ecological consequences of gut microbial communities. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 50 (1), 451-475 (2019).
- Warnecke, F., et al. M....
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Ristampe e permessi
