Il presente protocollo descrive la preparazione e la misurazione quantitativa di arginina libera e proteina-legata e metil-arginine mediante spettroscopia 1H-NMR.
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Articolo metodologico
Esplorazione del metiloma dell'arginina mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'arginina legata alle proteine è comunemente metilata in molte proteine e regola la loro funzione alterando le proprietà fisico-chimiche, la loro interazione con altre molecole, comprese altre proteine o acidi nucleici. Questo lavoro presenta un protocollo facilmente implementabile per quantificare l'arginina e i suoi derivati, tra cui la dimetilarginina asimmetrica e simmetrica (ADMA e SDMA, rispettivamente) e la monometilarginina (MMA). Dopo l'isolamento proteico da fluidi corporei biologici, tessuti o lisati cellulari, viene descritto un metodo semplice per l'omogeneizzazione, la precipitazione delle proteine e l'idrolisi proteica. Poiché gli idrolizzati contengono molti altri componenti, come altri amminoacidi, lipidi e acidi nucleici, è essenziale una fase di purificazione mediante estrazione in fase solida (SPE). SPE può essere eseguita manualmente utilizzando centrifughe o un robot di pipettaggio. La sensibilità per ADMA utilizzando il protocollo corrente è di circa 100 nmol/L. Il limite superiore di rilevazione per l'arginina è di 3 mmol / L a causa della saturazione SPE. In sintesi, questo protocollo descrive un metodo robusto, che spazia dalla preparazione del campione biologico al rilevamento basato su NMR, fornendo preziosi suggerimenti e insidie per un lavoro di successo nello studio del metiloma dell'arginina.
Introduzione
Negli ultimi due decenni, la metilazione dei residui di arginina è stata riconosciuta come una modificazione post-traduzionale essenziale delle proteine. Colpisce processi biologici fondamentali come la regolazione della trascrizione, la trasduzione del segnale e molti altri1. Le principali proteine coinvolte nella regolazione della metilazione dell'arginina sono le proteine arginina metiltransferasi (PRMT)2. I principali derivati dell'arginina sono la ω-(N G,N G)-dimetilarginina asimmetrica (ADMA), la dimetilarginina ω-(N G,N'G)-simmetrica (SDMA) e la ω-N G-monometilarginina (....
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Protocollo
Gli idrolizzati proteici di lievito sono stati utilizzati come campioni per i risultati rappresentativi di questo lavoro. L'intero protocollo è riassunto nella Figura 1.
1. Preparazione dei materiali e dei reagenti
- Metanolo/acqua: preparare una miscela di due parti di metanolo al 99% (MeOH) e una parte di H 2 O, designata come MeOH/H2 O. Conservare MeOH puro e MeOH/H2Oa -20 °C per ridurre al minimo l'evaporazione dell'alcol e aumentare la stabilità del campione.
- Acido cloridrico (HCl): diluire 9 mol/L da HCl concentrato (12,0 mol/L o 37%) e 0....
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Risultati
Di routine, proiezioni 1H 1D di spettri NMR 2D J-risolti (JRES), virtualmente disaccoppiati vengono utilizzate per assegnazioni e quantificazioni di picco nel nostro laboratorio36. La figura 3 mostra spettri JRES rappresentativi di idrolizzati proteici di lievito purificati utilizzando l'attuale protocollo SPE. Sebbene a concentrazioni molto diverse, entrambe le sostanze possono essere separate e quantificate in una matrice cellulare. Sulla base del numero .......
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Discussione
Nella sezione seguente, l'attenzione principale si trova sul metodo stesso; le implicazioni biologiche della metilazione dell'arginina sono descritte nella sezione Introduzione.
In primo luogo, i tessuti di diversa rigidità potrebbero richiedere un aggiustamento della lisi del campione: le cellule provenienti da colture cellulari (inclusi batteri, lieviti, ecc.) e tessuti come cervello, fegato giovane, muscolatura liscia, ecc., Possono essere rapidamente omogeneizzati. Per i tessuti ad alta ri.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Il lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni dell'Austrian Science Fund (FWF) P28854, I3792, doc.funds BioMolStruct DOC 130, DK-MCD W1226 BioTechMed-Graz (progetto faro DYNIMO), sovvenzioni dell'Agenzia austriaca per la promozione della ricerca (FFG) 864690 e 870454, dal Centro di ricerca sul metabolismo integrativo di Graz; Programma infrastrutturale austriaco 2016/2017, il governo della Stiria (Zukunftsfonds) e il Fondo di avvio per talenti di alto livello dell'Università di medicina del Fujian (XRCZX2021020). Ringraziamo il Centro di Ricerca Medica per l'accesso alle strutture di coltura cellulare. F.Z. è stato formato nell'ambito del programma di dottorato in med....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette da 15 mL | Greiner Bio One | 188271 | |
| acido 3-(trimetilsilil) propionico-2,2,3,3-d4 sale sodico (TSP) | Alfa Aesar | A1448 | |
| provette da 5 mL, fondo tondo | Greiner Bio One | 115101 | |
| soluzione di ammoniaca 32% | Roth | A990.1 | |
| Bruker 600 MHz spettrometro NMR, dotato di una testa di sonda TXI | |||
| Centrifuga refrigerata, ad es. 5430 R | Eppendorf | 5428000010 | |
| Cloroformio ≥ 99% annuo | Roth | 3313.1 | |
| Cryocool | Thermo Scientific | SCC1 | fluido termovettore per sistema SpeedVac |
| Ossido di deuterio (D2O) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-10-PK | |
| Dimetil solfossido-d6 (d6-DMSO) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-6-1000 | |
| Legante a camera di essiccazione | 9090-0018 | ||
| Provette per coltura DIRAN, 13 x 100 mm, GL 14, 9 mL | VWR International | 212-0375 | |
| Edwards Pompa per olio a vuoto profondo RV5 | Thermo Scientific | 16234611 | parte del sistema SpeedVac Provette Eppendorf |
| da 1,5 mL | Greiner Bio One | 616201 | |
| Robot di pipettaggio Gilson GX-241 Aspec | Gilson Inc. | ||
| L-arginina | AppliChem | A3675 | |
| Metanolo ≥ 99% | Roth | 8388.4 | |
| Milli-Q acqua aparatus | Millipore | ZIQ7000T0 | |
| Oasis MCX 1cc/30 mg, 1 mL cartucce Waters | 186000252 | https://www.waters.com/waters/en_US/Waters-Oasis-Sample-Extraction-SPE-Products/ | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | LONBE17-512F | |
| Precellys 24 omogeneizzatore tissutale | Bertin Strumenti | P000669-PR240-A | https://www.bertin-instruments.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys24-tissue-homogenizer/ |
| Tubi Precellys (tubi per spappolamento) | VWR International | 432-0351 | |
| Perle di ossido di zirconio Precellyse da 1,4 mm VWR | International | 432-0356 | |
| Reacti-Therm/ReactiVap Moduli di riscaldamento, agitazione ed evaporazione | Thermo Scientific | TS-18820 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/TS-18820 |
| Rotore per provette da 1,5 mL, FA-45-30-11 | Eppendorf | 5427753001 | |
| Savant Savant Sappone di raffreddamento refrigerato | Thermo Scientific | 15996161 | parte del sistema SpeedVac Savant |
| SpeedVac concentratore sottovuoto SPD210 | Thermo Scientific | 15906181 | parte del sistema SpeedVac; equipaggiato con rotore per provette da 1,5 ml |
| Tappi a vite per fiale di vetro con guarnizione in PTFE, DN9 | Dr. R. Forche Cromatografia | CT11B3011 | |
| Seasand | Roth | 8441.3 | |
| Fiale di vetro a filettatura corta 1,5 mL, ND9 | Dr. R. Forche Cromatografia | VT1100309 | |
| Azide di sodio (NaN3) | Roth | K305.1 | |
| Idrossido di sodio (NaOH) | VWR | BDH7363-4 | |
| Sodio fosfato bibasico (Na2HPO4) | VWR | 80731-078 | |
| TopSpin 4.0 (Software) | Bruker-https://www.bruker.com | ||
| ω-NG-dimetilarginina asimmetrica (ADMA) | Santa Cruz Biotechnology | sc-208093 | |
| ω-NG-monometilarginina (MMA) | Santa Cruz Biotechnology | sc-200739A | |
| ω-NG-NG'-dimetilarginina simmetrica (SDMA) | Santa Cruz Biotechnology | sc-202235A |
Riferimenti
- Guccione, E., Richard, S. The regulation, functions and clinical relevance of arginine methylation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 642-657 (2019).
- Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and w....
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Ristampe e permessi
