Articolo metodologico

Esplorazione del metiloma dell'arginina mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare

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DOI:

10.3791/63245

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16 dicembre 2021

 ,  ,  , 
1Gottfried Schatz Research Center for Cell Signaling, Metabolism and Aging, Molecular Biology and Biochemistry, Medical University of Graz, 2Ministry of Education, School of Basic Medical Sciences, Key Laboratory of Gastrointestinal Cancer (Fujian Medical University)

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Il presente protocollo descrive la preparazione e la misurazione quantitativa di arginina libera e proteina-legata e metil-arginine mediante spettroscopia 1H-NMR.

Abstract

L'arginina legata alle proteine è comunemente metilata in molte proteine e regola la loro funzione alterando le proprietà fisico-chimiche, la loro interazione con altre molecole, comprese altre proteine o acidi nucleici. Questo lavoro presenta un protocollo facilmente implementabile per quantificare l'arginina e i suoi derivati, tra cui la dimetilarginina asimmetrica e simmetrica (ADMA e SDMA, rispettivamente) e la monometilarginina (MMA). Dopo l'isolamento proteico da fluidi corporei biologici, tessuti o lisati cellulari, viene descritto un metodo semplice per l'omogeneizzazione, la precipitazione delle proteine e l'idrolisi proteica. Poiché gli idrolizzati contengono molti altri componenti, come altri amminoacidi, lipidi e acidi nucleici, è essenziale una fase di purificazione mediante estrazione in fase solida (SPE). SPE può essere eseguita manualmente utilizzando centrifughe o un robot di pipettaggio. La sensibilità per ADMA utilizzando il protocollo corrente è di circa 100 nmol/L. Il limite superiore di rilevazione per l'arginina è di 3 mmol / L a causa della saturazione SPE. In sintesi, questo protocollo descrive un metodo robusto, che spazia dalla preparazione del campione biologico al rilevamento basato su NMR, fornendo preziosi suggerimenti e insidie per un lavoro di successo nello studio del metiloma dell'arginina.

Introduzione

Negli ultimi due decenni, la metilazione dei residui di arginina è stata riconosciuta come una modificazione post-traduzionale essenziale delle proteine. Colpisce processi biologici fondamentali come la regolazione della trascrizione, la trasduzione del segnale e molti altri1. Le principali proteine coinvolte nella regolazione della metilazione dell'arginina sono le proteine arginina metiltransferasi (PRMT)2. I principali derivati dell'arginina sono la ω-(N G,N G)-dimetilarginina asimmetrica (ADMA), la dimetilarginina ω-(N G,N'G)-simmetrica (SDMA) e la ω-N G-monometilarginina (MMA)2.

I PRMT usano S-adenosil-l-metionina per trasferire i gruppi metilici al gruppo guanidino terminale (con due gruppi amminici equivalenti) dell'arginina1 legata alle proteine. Si possono distinguere due enzimi principali: sia gli enzimi di tipo I che quelli di tipo II catalizzano la prima fase di metilazione per formare MMA (che quindi perde la sua simmetria). Seguendo questa fase, gli enzimi di tipo I (ad esempio, PRMT1, 2, 3, 4, 6, 8) usano MMA come substrato per formare ADMA, mentre gli enzimi di tipo II (principalmente PRMT5 e PRMT9) producono SDMA. PRMT1 è stata la prima proteina arginina metiltransferasi ad essere isolata da cellule di mammifero3. Tuttavia, i PRMT sono stati evolutivamente conservati4 in altri animali come vertebrati non mammiferi, cordati invertebrati, echinodermi, artropodi e nematodi cnidari5, piante6 e protozoi, compresi funghi come il lievito7. In molti casi, il knockout di uno dei PRMT porta alla perdita di vitalità, rivelando il ruolo essenziale delle specie di arginina metilata coinvolte in processi cellulari fondamentali come la trascrizione, la traduzione, la trasduzione del segnale, l'apoptosi e la separazione di fase liquido-liquido (cioè la formazione di organelli senza membrana, ad esempio nucleoli), che coinvolge regolarmente domini ricchi di arginina 8,9,10 . A sua volta, questo influenza la fisiologia e gli stati patologici, tra cui il cancro 11,12,13, il mieloma multiplo 14, le malattie cardiovascolari15, la patogenesi virale, l'atrofia muscolare spinale 16, il diabete mellito 17 e l'invecchiamento1. Si ritiene che l'aumento dei livelli di ADMA nel sangue, ad esempio, derivato dal polmone18 a causa della disgregazione proteica, sia collegato alla disfunzione endoteliale, alla malattia polmonare cronica19 e ad altre sindromi di malattie cardiovascolari20. È stato riscontrato che la sovraespressione dei PRMT accelera la tumorigenesi ed è associata a prognosi infausta21,22. Inoltre, l'ablazione di PRMT6 e PRMT7 innesca un fenotipo di senescenza cellulare23. Una significativa diminuzione di ADMA e PRMT1 è stata riscontrata durante l'invecchiamento dei fibroblasti WI-3824.

La sfida è capire come agisce la metilazione nei processi (pato)fisiologici identificando e quantificando la metilazione dell'arginina proteica. La maggior parte degli approcci attuali utilizza anticorpi per rilevare arginine metilate. Tuttavia, questi anticorpi sono ancora specifici del contesto e potrebbero non riuscire a riconoscere diversi motivi di proteine metilate dell'arginina25,26. Nel protocollo descritto, tutti i derivati dell'arginina menzionati sopra possono essere quantificati in modo affidabile mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR), cioè da soli, in combinazione o, come nella maggior parte dei casi, all'interno di matrici biologiche complesse come cellule eucariotiche (ad esempio, da lievito, topo o origine umana) e tessuti27, così come siero28. Per le proteine e quelle matrici complesse, l'idrolisi proteica29 è un prerequisito per generare aminoacidi liberi (modificati), come arginina, MMA, SDMA e ADMA. L'estrazione in fase solida (SPE)30 consente l'arricchimento dei composti di interesse. Infine, la spettroscopia 1H-NMR permette la rilevazione parallela dell'arginina e di tutti i principali derivati metilici dell'arginina. La spettroscopia NMR ha il vantaggio di essere veramente quantitativa, altamente riproducibile e una tecnica robusta31,32. Le misurazioni NMR finali possono essere eseguite in seguito, quando sono stati raccolti e preparati molti campioni. Infine, questo protocollo si concentra principalmente sulla preparazione del campione in quanto ciò non richiede un proprio spettrometro NMR. Può essere eseguito nella maggior parte dei laboratori biochimici. Tuttavia, alcuni suggerimenti su quali misure di spettroscopia NMR dovrebbero essere fatte sono forniti in questo lavoro.

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Protocollo

Gli idrolizzati proteici di lievito sono stati utilizzati come campioni per i risultati rappresentativi di questo lavoro. L'intero protocollo è riassunto nella Figura 1.

1. Preparazione dei materiali e dei reagenti

  1. Metanolo/acqua: preparare una miscela di due parti di metanolo al 99% (MeOH) e una parte di H 2 O, designata come MeOH/H2 O. Conservare MeOH puro e MeOH/H2Oa -20 °C per ridurre al minimo l'evaporazione dell'alcol e aumentare la stabilità del campione.
  2. Acido cloridrico (HCl): diluire 9 mol/L da HCl concentrato (12,0 mol/L o 37%) e 0,1 mol/L di HCl. La soluzione più concentrata (9 mol/L) viene utilizzata per l'idrolisi proteica, mentre quella concentrata più bassa (0,1 mol/L) viene utilizzata per l'estrazione in fase solida.
    ATTENZIONE: Lavorare all'interno della cappa aspirante.
  3. Preparare una soluzione sostitutiva per SPE contenente il 10% di una soluzione di ammoniaca satura (stock: 30% p/p di ammoniaca), il 50% di metanolo e il 40% di acqua (v/v).
  4. Tampone NMR: sciogliere 5,56 g di idrogeno fosfato disodico (Na 2 HPO 4, 0,08 mol/L), 0,4 g di sale sodico di acido propionico 3-(trimetilsilil)-2,2,3,3-d4 (TSP, 5 mmol/L), 0,04 % (p/v) di azoturo di sodio (NaN3) in 500 mL di biossido di deuterio (D2O)e regolare a pH7,4 (utilizzando HCl o NaOH, rispettivamente) (vedi Tabella dei materiali). Controllare la purezza di ogni nuovo lotto tampone mediante spettroscopia NMR.
    NOTA: La quantità di eventuali contaminanti (ad esempio, etanolo) deve essere la più bassa possibile.
  5. Riempire i tubi di polpa con sfere di ossido di zirconio (tubi da 2 ml e perline da 1,4 mm sono adatti per la maggior parte delle applicazioni, ma sono disponibili diverse varianti) (vedi Tabella dei materiali). Riempi circa 10-20 perline a mano o acquista tubi preriempiti, che sono anche disponibili.
  6. Tenere a portata di mano le pipette e le rispettive punte nell'intervallo 10-1.000 μL.
    NOTA: L'acqua altamente pura, designatacome H 2 O, definita da un'elevata resistenza di ≥18,2 MΩ·cm-1, è stata utilizzata durante tutto il lavoro. Corrisponde all'acqua doppia distillata.

2. Raccolta e conservazione dei campioni

  1. Congelare i campioni liquidi (siero/plasma, coltura cellulare surnatante, ecc.) con azoto liquido e conservarli a -80 °C fino all'uso.
  2. Preparare i materiali solidi come indicato di seguito.
    1. Raccogliere le cellule da colture cellulari (3-5 milioni di cellule) sia raccogliendo cellule aderenti, dopo lavaggio con soluzione salina tamponata fosfato a freddo, raschiatura e centrifugazione, sia centrifugazione diretta di cellule cresciute in sospensione.
    2. Rimuovere i surnatanti cellulari (che potrebbero essere raccolti per ulteriori analisi, mediante misurazione diretta consecutiva, vedi punto 6, o dopo precipitazione di proteine solubili, vedi punto 3.1), quindi congelare i pellet con azoto liquido e conservarli a -80 °C. Per ulteriori elaborazioni, vedere il passaggio 3.2.
    3. Conservare e raccogliere i tessuti secondo lo scopo dello studio. Per tessuti molto omogenei, come il fegato o il muscolo, analizzarne qualsiasi parte. Ad esempio, nel caso di un cervello di topo, determinare la metilazione globale dell'arginina dell'intero cervello o sezioni cerebrali.
      NOTA: Il peso ideale dei tessuti da trattare è 30-60 mg. Si consiglia di congelare e polverizzare l'intero cervello e utilizzare aliquote di esso. In alternativa, possono essere utilizzate parti specifiche del cervello (ad esempio, frontale, cervelletto, regioni occipitali o un emisfero, del peso di ~ 250 mg).

3. Preparazione preliminare del campione

NOTA: Eseguire il lavoro sul ghiaccio, mantenendo MeOH freddo. I campioni devono inoltre essere conservati su ghiaccio per evitare la degradazione delle proteine.

  1. Per i campioni liquidi, aggiungere 400 μL di metanolo ghiacciato a 200 μL del campione. Continuare con il passaggio 3.3.
    NOTA: se è disponibile meno campione, regolare i volumi di conseguenza; La sensibilità NMR è solitamente abbastanza elevata per quantità di campione più piccole, ma deve essere testata individualmente.
  2. Nel caso di materiali solidi, preparare provette da 1,5 ml sufficienti per i lisati (utilizzare per la centrifugazione dopo l'omogeneizzazione).
    1. Con attenzione, ma accuratamente, risospendere i pellet cellulari in 600 μL di MeOH/H2O e trasferire l'intera fase liquida nei tubi di spappolatura.
    2. Metti i tessuti in provette di polpa (puoi pesarli direttamente nei tubi) e aggiungi 600 μL di MeOH / H2O (per 30-60 mg; regola se il peso differisce sostanzialmente).
    3. Inserire i tubi nell'omogeneizzatore tissutale (vedere Tabella dei materiali) e omogeneizzare una volta per 20 s con forti agitazioni (per pellet cellulari, tessuti molli) o due volte per 20 s ciascuno (o più a lungo se necessario) con un intervallo di 5 minuti in mezzo (per tessuti rigidi).
    4. Dopo l'omogeneizzazione, rimettere immediatamente i campioni sul ghiaccio e trasferire l'intero lisato in nuove provette da 1,5 ml.
  3. Conservare i campioni per almeno 30 minuti (fino a diversi giorni) a -20 °C prima di un'ulteriore lavorazione.
  4. Centrifugare a 10.000 x g per 30 minuti a 4 °C. Nel frattempo, preparare provette da 1,5 ml sufficienti per raccogliere i surnatanti
    NOTA: Questo surnatante (designato "(1)" nella Figura 1) potrebbe essere scartato, essere liofilizzato ed elaborato direttamente per NMR (fase 6) o analizzato in altro modo.
  5. In questo protocollo, il precipitato di MeOH (= pellet ottenuto dopo la fase 3.1 o 3.2.2, rispettivamente) viene utilizzato per ulteriori analisi contenenti, tra l'altro, componenti quali acidi nucleici e lipidi, proteine arginina-metilate. Continuare con l'idrolisi proteica o conservare i pellet a -20 °C per alcuni giorni.

4. Idrolisi proteica

  1. Aggiungere 500 μL di 9 mol/L di HCl a ciascun campione. Quindi, troncare i tappi di ciascun tubo con le forbici e inserirli nei tubi di coltura di vetro (Figura 2A). Con attenzione, ma strettamente, chiudere i tappi rossi (controllando così la sigillatura).
    NOTA: Prima dell'uso, controllare sempre ogni guarnizione (pellicola di PTFE grigia all'interno dei tappi a vite rossi) per un corretto serraggio e pulirli regolarmente con acqua.
  2. Al termine, posizionare i tubi in un becher parzialmente riempito di sabbia (per un migliore trasferimento di calore) e idrolizzare i campioni per circa 16 ore a 110 °C in una camera di essiccazione.
  3. Dopo l'idrolisi, raffreddare i campioni (~1 h).
  4. Successivamente, liofilizzare durante la notte utilizzando una centrifuga ad alto vuoto (inferiore a 100 Pa).
  5. Sciogliere i pellet - se completamente asciutti (in caso contrario, continuare la liofilizzazione) - in 1 mL di 0,1 mol/L HCl e aggiungere 50 μL di cloroformio (CHCl3) a ciascun tubo; Sciogliere accuratamente il pellet con una pipetta da 1.000 μL, mescolando così i liquidi, quindi trasferire l'intero volume in un nuovo tubo.
    ATTENZIONE: Lavorare sempre con piccole quantità per ridurre al minimo l'evaporazione estesa
  6. Quindi, centrifugare a 8.000 x g per 10 minuti a temperatura ambiente.
  7. Raccogliere con cura la fase superiore del liquido bifasico contenente la frazione solubile in acqua (Figura 2B, la frazione con la densità inferiore) con una pipetta e riempirla in nuovi tubi. Utilizzare tubi da 1,5 mL per SPE manuale (punto 5.2) o flaconcini di vetro per SPE robotizzati (punto 5.3 e figura 2D). Evitare di versare su CHCl3 e il suo contenuto (Figura 2C).

5. Estrazione in fase solida (SPE)

  1. Prima del primo utilizzo, pulire le cartucce SPE due volte con 1 mL della soluzione sostitutiva (fase 1.3) seguita da centrifugazione a 800 x g per 1 minuto a temperatura ambiente (posto in provette da 15 ml). Possono essere utilizzati 10-20 volte ciascuno.
  2. SPE manuale
    1. Precondizionare le cartucce (vedere la tabella dei materiali) in ogni ciclo con 1 mL di metanolo puro e 2 x 1 mL di PBS, seguita ogni volta da centrifugazione a 800 x g per 1 minuto a temperatura ambiente (posta in tubi da 15 ml).
    2. Successivamente, caricare i campioni (dal punto 4.7) sulle cartucce SPE e centrifugarli a 600 x g per 2 minuti a temperatura ambiente.
    3. Quindi, applicare un ciclo di lavaggio come indicato di seguito.
      1. Aggiungere tre volte 1 mL di H2O (ciascuno seguito da centrifugazione per 1 minuto a 800 x g a temperatura ambiente).
      2. Aggiungere cinque volte 1 mL di 0,1 mol/L HCl (ciascuno seguito da centrifugazione per 1 minuto a 800 x g a temperatura ambiente).
      3. Aggiungere due volte 1 mL di MeOH (ciascuno seguito da centrifugazione per 1 minuto a 800 x g a temperatura ambiente).
    4. Quindi, eluire l'arginina e i suoi derivati con 3 x 1 mL di soluzione sostitutiva (seguita da centrifugazione 1 minuto a 800 x g a temperatura ambiente) in un singolo tubo da 15 ml.
      NOTA: La soluzione sostitutiva funge da eluente per l'arginina e derivati e viene utilizzata anche per la pulizia delle cartucce (tutte le sostanze vengono lavate prima dell'eluizione o al valore pH basico della soluzione sostitutiva). Tuttavia, per evitare la contaminazione nel tempo, il riutilizzo dovrebbe essere limitato (vedere il passaggio 5.1).
  3. SPE robotica
    NOTA: Qui, un robot per pipettaggio (la parte principale costituita da un ago per pipettaggio, una stazione di lavaggio per l'ago, una fornitura di reagenti e posizioni per campioni ed eluati, vedi Tabella dei materiali) viene fornito con un portacartucce per le colonne SPE. Per altri strumenti, assicurati di essere completamente equipaggiato con tutte le cose elencate.
    1. Riempire il surnatante (dal punto 4.7) direttamente in flaconcini di vetro con sigillante in PTFE (Figura 2D), preparare un numero sufficiente di reagenti (100 mL di ciascuno, cioè soluzione sostitutiva, 99% di MeOH, PBS, H 2 Oe 0,1 di mol/L HCl), tubi da 5 mL per l'eluizione e soluzione di lavaggio per l'ago del robot (di solito H2O).
    2. Utilizzare un'applicazione o un metodo nel software del robot basato esattamente sui passaggi descritti per SPE manuale (passo 5.2).
      NOTA: I dettagli possono variare molto tra i fornitori di strumenti, quindi fare riferimento al manuale del software del rispettivo robot per la programmazione. Un robot di pipettaggio di solito funziona applicando la pressione dell'aria sulle cartucce invece della centrifugazione, che è la differenza principale. Se il protocollo viene stabilito ed eseguito per la prima volta, includere controlli (ad esempio, L-arginina di concentrazione nota) per verificare un flusso di lavoro ottimale.

6. Preparazione finale per la RMN

  1. Campioni di liofilizzazione durante la notte per completare la secchezza per eliminare l'ammoniaca e H2O.
  2. Sciogliere ciascun campione in 500 μL di tampone NMR (fase 1.4) e trasferirlo in provette NMR. È importante sottolineare che il volume deve essere lo stesso in tutte le provette e i campioni devono essere omogenei (privi di residui e lipidi, che tendono ad aggregarsi).
    NOTA: I dettagli della spettroscopia NMR vanno oltre questa revisione del metodo e sono descritti più dettagliatamente altrove27. Qui, vengono spiegati solo i requisiti e i passaggi principali. La quantificazione dell'arginina e dei suoi metaboliti viene eseguita su uno spettrometro NMR a 600 MHz (vedi Tabella dei materiali). In linea di principio, è possibile utilizzare qualsiasi altra intensità di campo dello spettrometro NMR/NMR, a condizione che i segnali NMR dell'arginina e delle arginine metilate possano essere rilevati con sufficiente sensibilità e senza sovrapposizione di segnali. È possibile utilizzare qualsiasi testa di sonda con gradienti dell'asse z in grado di registrare 1spettro H, a condizione che le sequenze di impulsi siano impostate di conseguenza.
  3. Registrare uno spettro 1D utilizzando la sequenza di impulsi CPMG (Carr-Purcell-Meiboom-Gill)33,34 (cpmgpr1d, 512 scansioni, dimensione di fid 73728, larghezza spettrale 11904,76 Hz su un NMR a 600 MHz, ritardo di riciclo 4 s) con soppressione del segnale dell'acqua utilizzando la presaturazione.
  4. In questi esperimenti, rimuovere gli accoppiamenti scalari 1H mediante disaccoppiamento virtuale, riducendo la sovrapposizione del segnale. Registrare ulteriori per domande specifiche e/o campioni o matrici complesse, ad esempio 1H-13 C-eteronucleare singolo spettro di coerenza quantistica (HSQC) H-1327.
    NOTA: Per matrici più complesse in cui i segnali NMR1 H di arginine metilate potrebbero essere parzialmente sovrapposti a segnali NMR 1H di altri metaboliti (ad esempio, lisina), sono necessari spettri omo-nucleari J-risolti (JRES)35 H.
  5. Eseguire la quantificazione assoluta integrando le rispettive intensità di picco degli standard di una concentrazione nota, ad esempio 100 μmol / arginina.
    NOTA: Di routine, ADMA, SDMA e MMA (vedere la tabella dei materiali) sono riportati come rapporto relativo all'arginina. Ciò ha un vantaggio significativo che non è necessario eseguire alcuna normalizzazione separata (ad esempio, numero di cellule, massa tissutale, concentrazioni proteiche). In tal caso, l'arginina funge da standard interno e la quantificazione relativa è sufficiente per ottenere informazioni biologicamente rilevanti.
  6. Per differenziare SDMA e MMA, liofilizzare nuovamente i campioni per eliminare D2O (se sono stati risospesi in tampone NMR in precedenza), che viene poi sostituito da dimetilsolfossido deuterato (d 6-DMSO), consentendo la risoluzione delle risonanze metiliche27. Pertanto, aspirare i campioni dalle provette NMR con pipette Pasteur, liofilizzarli e scioglierli in 500 μL di d6-DMSO.

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Risultati

Di routine, proiezioni 1H 1D di spettri NMR 2D J-risolti (JRES), virtualmente disaccoppiati vengono utilizzate per assegnazioni e quantificazioni di picco nel nostro laboratorio36. La figura 3 mostra spettri JRES rappresentativi di idrolizzati proteici di lievito purificati utilizzando l'attuale protocollo SPE. Sebbene a concentrazioni molto diverse, entrambe le sostanze possono essere separate e quantificate in una matrice cellulare. Sulla base del numero ...

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Discussione

Nella sezione seguente, l'attenzione principale si trova sul metodo stesso; le implicazioni biologiche della metilazione dell'arginina sono descritte nella sezione Introduzione.

In primo luogo, i tessuti di diversa rigidità potrebbero richiedere un aggiustamento della lisi del campione: le cellule provenienti da colture cellulari (inclusi batteri, lieviti, ecc.) e tessuti come cervello, fegato giovane, muscolatura liscia, ecc., Possono essere rapidamente omogeneizzati. Per i tessuti ad alta ri...

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Dichiarazioni

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Ringraziamenti

Il lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni dell'Austrian Science Fund (FWF) P28854, I3792, doc.funds BioMolStruct DOC 130, DK-MCD W1226 BioTechMed-Graz (progetto faro DYNIMO), sovvenzioni dell'Agenzia austriaca per la promozione della ricerca (FFG) 864690 e 870454, dal Centro di ricerca sul metabolismo integrativo di Graz; Programma infrastrutturale austriaco 2016/2017, il governo della Stiria (Zukunftsfonds) e il Fondo di avvio per talenti di alto livello dell'Università di medicina del Fujian (XRCZX2021020). Ringraziamo il Centro di Ricerca Medica per l'accesso alle strutture di coltura cellulare. F.Z. è stato formato nell'ambito del programma di dottorato in medicina molecolare, Università di medicina di Graz. Q.Z. è stato addestrato nell'ambito del programma di dottorato in Malattie metaboliche e cardiovascolari, Università di Medicina di Graz.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provette da 15 mLGreiner Bio One188271
acido 3-(trimetilsilil) propionico-2,2,3,3-d4 sale sodico (TSP)Alfa AesarA1448
provette da 5 mL, fondo tondoGreiner Bio One115101
soluzione di ammoniaca 32%RothA990.1
Bruker 600 MHz spettrometro NMR, dotato di una testa di sonda TXI
Centrifuga refrigerata, ad es. 5430 REppendorf5428000010
Cloroformio ≥ 99% annuoRoth3313.1
CryocoolThermo ScientificSCC1fluido termovettore per sistema SpeedVac
Ossido di deuterio (D2O)Cambridge Isotope LaboratoriesDLM-10-PK
Dimetil solfossido-d6 (d6-DMSO)Cambridge Isotope LaboratoriesDLM-6-1000
Legante a camera di essiccazione9090-0018
Provette per coltura DIRAN, 13 x 100 mm, GL 14, 9 mLVWR International212-0375
Edwards Pompa per olio a vuoto profondo RV5Thermo Scientific16234611parte del sistema SpeedVac Provette Eppendorf
da 1,5 mLGreiner Bio One616201
Robot di pipettaggio Gilson GX-241 AspecGilson Inc.
L-argininaAppliChemA3675
Metanolo ≥ 99%Roth8388.4
Milli-Q acqua aparatusMilliporeZIQ7000T0
Oasis MCX 1cc/30 mg, 1 mL cartucce Waters186000252https://www.waters.com/waters/en_US/Waters-Oasis-Sample-Extraction-SPE-Products/
Phosphate Buffered Saline (PBS)LonzaLONBE17-512F
Precellys 24 omogeneizzatore tissutaleBertin StrumentiP000669-PR240-Ahttps://www.bertin-instruments.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys24-tissue-homogenizer/
Tubi Precellys (tubi per spappolamento)VWR International432-0351
Perle di ossido di zirconio Precellyse da 1,4 mm VWRInternational432-0356
Reacti-Therm/ReactiVap Moduli di riscaldamento, agitazione ed evaporazioneThermo ScientificTS-18820https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/TS-18820
Rotore per provette da 1,5 mL, FA-45-30-11Eppendorf5427753001
Savant Savant Sappone di raffreddamento refrigeratoThermo Scientific15996161parte del sistema SpeedVac Savant
SpeedVac concentratore sottovuoto SPD210Thermo Scientific15906181parte del sistema SpeedVac; equipaggiato con rotore per provette da 1,5 ml
Tappi a vite per fiale di vetro con guarnizione in PTFE, DN9Dr. R. Forche CromatografiaCT11B3011
SeasandRoth8441.3
Fiale di vetro a filettatura corta 1,5 mL, ND9Dr. R. Forche CromatografiaVT1100309
Azide di sodio (NaN3)RothK305.1
Idrossido di sodio (NaOH)VWRBDH7363-4
Sodio fosfato bibasico (Na2HPO4)VWR80731-078
TopSpin 4.0 (Software)Bruker-https://www.bruker.com
ω-NG-dimetilarginina asimmetrica (ADMA)Santa Cruz Biotechnologysc-208093
ω-NG-monometilarginina (MMA)Santa Cruz Biotechnologysc-200739A
ω-NG-NG'-dimetilarginina simmetrica (SDMA)Santa Cruz Biotechnologysc-202235A
26150008

Riferimenti

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