Sulla base del meccanismo di assemblaggio del complesso proteico INAD, in questo protocollo è stata sviluppata una strategia di purificazione dell'affinità modificata più concorrenza per purificare il canale Endogeno Drosophila TRP.
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Articolo metodologico
Purificazione dei canali potenziali del recettore transitorio della drosophila endogena
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La fototrasduzione della drosophila è una delle vie di segnalazione accoppiate alla proteina G più veloci conosciute. Per garantire la specificità e l'efficienza di questa cascata, il canale cationico permeabile al calcio (Ca2+), il potenziale recettore transitorio (TRP), si lega strettamente alla proteina dello scaffold, all'inattivazione-no-after-potential D (INAD) e forma un grande complesso proteico di segnalazione con proteina chinasi C (ePKC) specifica per l'occhio e fosfolipasi Cβ / Nessun potenziale recettore A (PLCβ / NORPA). Tuttavia, le proprietà biochimiche del canale TRP Drosophila rimangono poco chiare. Sulla base del meccanismo di assemblaggio del complesso proteico INAD, è stata sviluppata una strategia di purificazione dell'affinità modificata più concorrenza per purificare il canale TRP endogeno. In primo luogo, il frammento NORPA 863-1095 purificato con istidina (His) è stato legato a Ni-beads e utilizzato come esca per abbattere il complesso proteico INAD endogeno dagli omogeneizzati della testa di Drosophila. Quindi, un eccessivo frammento di glutatione S-transferasi (GST) purificato con tag TRP 1261-1275 è stato aggiunto alle ni-perline per competere con il canale TRP. Infine, il canale TRP nel surnatante è stato separato dall'eccessivo peptide TRP 1261-1275 mediante cromatografia ad esclusione dimensionale. Questo metodo consente di studiare il meccanismo di gating del canale Drosophila TRP sia da angolazioni biochimiche che strutturali. Le proprietà elettrofisiologiche dei canali TRP di Drosophila purificati possono anche essere misurate in futuro.
Introduzione
La fototrasduzione è un processo in cui i fotoni assorbiti vengono convertiti in codici elettrici dei neuroni. Trasmette esclusivamente opsine e la successiva cascata di segnalazione accoppiata alla proteina G sia nei vertebrati che negli invertebrati. In Drosophila, utilizzando i suoi cinque domini PDZ, l'inattivazione della proteina scaffold-no-after-potential D (INAD) organizza un complesso di segnalazione supramolecolare, che consiste in un canale del potenziale recettore transitorio (TRP), potenziale del recettore Cβ / No della fosfolipasi A (PLCβ / NORPA) e chinasi C (ePKC) specifica dell'occhio. La formazione di questo complesso....
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Protocollo
1. Purificazione di TRP con tag GST e frammenti NORPA con tag His
- Purificare il frammento TRP 1261-1275 con tag GST
- Trasformare il plasmide 10 pGEX 4T-1 TRP 1261-1275 in celle Escherichia coli (E. coli) BL21 (DE3) utilizzando il metodo di trasformazione dello shock termico CaCl2 21. Inoculare una singola colonia in 10 mL di terreno di Luria Bertani (LB) e crescere durante la notte a 37 °C. Quindi, amplificare i 10 mL di coltura di semina in 1 L di terreno LB a 37 °C.
- Dopo che la densità ottica (OD600) delle cellule raggiunge 0,5, raffreddare le....
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Risultati
In questo articolo, viene dimostrato un metodo di purificazione delle proteine per purificare il canale Endogeno Drosophila TRP (Figura 1).
In primo luogo, l'espressione e la purificazione delle proteine ricombinanti vengono applicate per ottenere l'esca e le proteine concorrenti. Quindi, un frammento TRP 1261-1275 con tag GST viene espresso in cellule E. coli BL21 (DE3) in mezzo LB e purificato utilizzando perline di glutatione e una colonna di .......
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Discussione
INAD, che contiene cinque domini PDZ, è l'organizzatore principale del macchinario di fototrasduzione Drosophila. Studi precedenti hanno dimostrato che INAD PDZ3 si lega al canale TRP C-terminale coda con squisita specificità (KD = 0,3 μM)18. Il tandem INAD PDZ45 interagisce con il frammento NORPA 863-1095 con un'affinità di legame estremamente elevata (KD = 30 nM). Questi risultati forniscono una solida base biochimica per progettare la purificazione dell'affinità p.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (n. 31870746), Shenzhen Basic Research Grants (JCYJ20200109140414636) e Natural Science Foundation of Guangdong Province, Cina (n. 2021A1515010796) a W. L. Ringraziamo LetPub (www.letpub.com) per la sua assistenza linguistica durante la preparazione di questo manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| ceppi batterici | |||
| BL21(DE3) Cellule competenti | Novagen | 69450 | Sovraespressione proteica |
| Modelli di esperimento | |||
| D.melanogaster: W1118 ceppo | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC:3605 | Drosophila preparazione della testa |
| Material | |||
| 20/30/40 setacci in acciaio inossidabile a maglia | Jiufeng azienda di reti metalliche GB | /T6003.1 | Drosophila preparazione della testa |
| 30% acrilammide-N,N′-Metilenbisacrilammide (29:1) | Lablead | A3291 | SDS-PAGE preparazione del gel |
| Persolfato di ammonio | Invitrogen | HC2005 | Preparazione del gel SDS-PAGE |
| Cocktail Inibitore della proteasi | Roche | 05892953001 | Inibitore della proteasi |
| Coomassie blu brillante R-250 | Sangon Biotech | A100472-0025 | Colorazione del gel SDS-PAGE |
| DL-Ditiotreitolo (DTT) | Sangon Biotech | A620058-0100 | Preparazione |
| del tampone della colonna ad esclusione dimensionaleSale disodico dell'acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) | Sangon Biotech | A500838-0500 | Preparazione del tampone della colonna ad esclusione dimensionale |
| Glycine | Sangon Biotech | A610235-0005 | Preparazione del tampone SDS-PAGE |
| Glutatione Sepharose 4 perle Fast Flow | Cytiva | 17513202 | Cromatografia di affinità |
| Imidazole | Sangon Biotech | A500529-0001 | Tampone di eluizione preparato per Ni-colonna |
| Isopropil-beta-D-tiogalattopiranoside (IPTG) | Sangon Biotech | A600168-0025 | Induzione della sovraespressione proteica |
| LB Brodo in polvere | Sangon Biotech | A507002-0250 | E.coli. coltura cellulare |
| L-Glutatione ridotto (GSH) | Sigma-aldrich | G4251-100G | Preparazione del tampone di eluizione per perle di glutatione |
| Perle di Ni-Sepharose excel | Cytiva | 17371202 | Cromatografia di affinità |
| N-Dodecil beta-D-maltoside (DDM) | Sangon Biotech | A610424-001 | Detergente per la purificazione delle proteine |
| N,N,N',N'-Tetrametiletilendiammina (TEMED) | Sigma-aldrich | T9281-100ML | Preparazione gel SDS-PAGE |
| PBS | Sangon Biotech | E607008-0500 | Tampone di omogeneizzazione per cellule E.coli. |
| PMSF | Lablead | P0754-25G | Inibitore della proteasi |
| Marcatore proteico prestainato | Thermo Scientific | 26619/26616 | Scala proteica prestained |
| Colonna di esclusione dimensionale (grado di preparazione) | Cytiva | 28989336 | Colonna HiLoad 26/60 Superdex 200 PG |
| Colonna di esclusione dimensionale (grado analitico) | Cytiva | 29091596 | Superose 6 Increase 10/300 GL |
| colonna Cloruro di sodio | Sangon Biotech | A501218-0001 | Preparazione del tampone per la purificazione delle proteine |
| Dodecil solfato di sodio (SDS) | Sangon Biotech | A500228-0001 | SDS-PAGE preparazione del gel/tampone |
| Tris base | Sigma-aldrich | T1503-10KG | Preparazione del tampone per la purificazione delle proteine |
| Spin per ultrafiltrazione colonna | Millipore | UFC901096/801096 | Concentrazione di proteine |
| Attrezzatura | |||
| Bilancia analitica | DENVER | APX-60 | Metage di Drosophila head |
| Centrifuga refrigerata da tavolo ad alta velocità per provette da centrifugazione coniche da 15 ml e 50 ml | Eppendorf | 5810R | Concentrazione di proteine |
| Centrifuga refrigerata ad alta velocità da tavolo Provette per centrifugazione da 1,5 ml | Eppendorf | 5417R | Centrifugazione del lisato di testa Drosophila dopo l'omogeneizzazione |
| Colonna di flusso per gravità vuota (diametro interno = 1,0 cm) | Bio-Rad | 738-0015 | Purificazione delle proteine TRP |
| Colonna di flusso per gravità vuota (diametro interno = 2,5 cm) | Bio-Rad | 738-0017 | Purificazione di esche e proteine concorrenti da E.coli. |
| Gel Sistema | di documentazione Bio-Rad | Universal Hood II Gel Doc XR System | SDS-PAGE imaging |
| Centrifuga refrigerata ad alta velocità | Coltro Beckman | Avanti J-26 XP | Centrifugazione di cellule E.coli./lisato cellulare |
| Omogeneizzatore ad alta pressione | UNION-BIOTECH | UH-05 | Omogeneizzazione delle cellule E.coli. |
| Serbatoio di azoto liquido | Taylor-Wharton | CX-100 | Drosophila preparazione della testa Sistema di |
| purificazione delle proteine Cytiva | AKTA Purificatore | di | proteine |
| Frigorifero (-80° C) | Thermo | 900GP | em>Drosophila preparazione della testa |
| Spettrofotometro | MAPADA | UV-1200 | OD600 Misurazione di cellule E.coli. |
| Spettrofotometro | Thermo Scientific | NanoDrop 2000c | Determinazione della concentrazione proteica |
| Ultracentrifuga | Coltro | Beckman Optima XPN-100 Ultracentrifuga | Ultracentrifugazione |
Riferimenti
- Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
- Huang, J., et al. Activation of TRP channels by proto....
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Ristampe e permessi
