Articolo metodologico

Purificazione dei canali potenziali del recettore transitorio della drosophila endogena

DOI:

10.3791/63260

⸱

28 dicembre 2021

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1Shenzhen Key Laboratory for Neuronal Structural Biology, Biomedical Research Institute, Shenzhen Peking University-The Hong Kong University of Science and Technology Medical Center

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sulla base del meccanismo di assemblaggio del complesso proteico INAD, in questo protocollo è stata sviluppata una strategia di purificazione dell'affinità modificata più concorrenza per purificare il canale Endogeno Drosophila TRP.

Abstract

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La fototrasduzione della drosophila è una delle vie di segnalazione accoppiate alla proteina G più veloci conosciute. Per garantire la specificità e l'efficienza di questa cascata, il canale cationico permeabile al calcio (Ca2+), il potenziale recettore transitorio (TRP), si lega strettamente alla proteina dello scaffold, all'inattivazione-no-after-potential D (INAD) e forma un grande complesso proteico di segnalazione con proteina chinasi C (ePKC) specifica per l'occhio e fosfolipasi Cβ / Nessun potenziale recettore A (PLCβ / NORPA). Tuttavia, le proprietà biochimiche del canale TRP Drosophila rimangono poco chiare. Sulla base del meccanismo di assemblaggio del complesso proteico INAD, è stata sviluppata una strategia di purificazione dell'affinità modificata più concorrenza per purificare il canale TRP endogeno. In primo luogo, il frammento NORPA 863-1095 purificato con istidina (His) è stato legato a Ni-beads e utilizzato come esca per abbattere il complesso proteico INAD endogeno dagli omogeneizzati della testa di Drosophila. Quindi, un eccessivo frammento di glutatione S-transferasi (GST) purificato con tag TRP 1261-1275 è stato aggiunto alle ni-perline per competere con il canale TRP. Infine, il canale TRP nel surnatante è stato separato dall'eccessivo peptide TRP 1261-1275 mediante cromatografia ad esclusione dimensionale. Questo metodo consente di studiare il meccanismo di gating del canale Drosophila TRP sia da angolazioni biochimiche che strutturali. Le proprietà elettrofisiologiche dei canali TRP di Drosophila purificati possono anche essere misurate in futuro.

Introduzione

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La fototrasduzione è un processo in cui i fotoni assorbiti vengono convertiti in codici elettrici dei neuroni. Trasmette esclusivamente opsine e la successiva cascata di segnalazione accoppiata alla proteina G sia nei vertebrati che negli invertebrati. In Drosophila, utilizzando i suoi cinque domini PDZ, l'inattivazione della proteina scaffold-no-after-potential D (INAD) organizza un complesso di segnalazione supramolecolare, che consiste in un canale del potenziale recettore transitorio (TRP), potenziale del recettore Cβ / No della fosfolipasi A (PLCβ / NORPA) e chinasi C (ePKC) specifica dell'occhio. La formazione di questo complesso di segnalazione supramolecolare garantisce la corretta localizzazione subcellulare, l'alta efficienza e la specificità del macchinario di fototrasduzione Drosophila. In questo complesso, i canali TRP sensibili alla luce agiscono come effettori a valle del NORPA e mediano l'afflusso di calcio e la depolarizzazione dei fotorecettori. Studi precedenti hanno dimostrato che l'apertura del canale TRP di Drosophila è mediata da protoni, interruzione dell'ambiente lipidico locale o forza meccanica 2,3,4. Il canale Drosophila TRP interagisce anche con calmodulina5 ed è modulato dal calcio con feedback sia positivo che negativo 6,7,8.

Finora, gli studi di elettrofisiologia sul meccanismo di gating dei canali Drosophila TRP e TRP-like (TRPL) erano basati su patch di membrana asportate, registrazioni di cellule intere da fotorecettori Drosophila wild-type dissociati e canali etero-espressi in cellule S2, SF9 o HEK 2,9,10,11,12,13, ma non su canali purificati. Anche le informazioni strutturali del canale TRP Drosophila a lunghezza intera rimangono poco chiare. Al fine di studiare le proprietà elettrofisiologiche della proteina purificata in un ambiente di membrana ricostituito e di ottenere informazioni strutturali del canale TRP Drosophila a lunghezza intera, ottenere canali TRP purificati a lunghezza intera è il primo passo necessario, simile alle metodologie utilizzate negli studi sui canali TRP dei mammiferi 14,15,16,17.

Recentemente, sulla base del meccanismo di assemblaggio del complesso proteico INAD 18,19,20, è stata sviluppata per la prima volta una strategia di purificazione dell'affinità più competizione per purificare il canale TRP dagli omogeneizzati della testa di Drosophila da perline di streptavidina 5. Considerando la bassa capacità e il costo costoso delle perle di streptavidina, qui viene introdotto un protocollo di purificazione migliorato che utilizza la proteina esca his-tagged e le corrispondenti perle Ni a basso costo con capacità molto più elevata. Il metodo proposto aiuterà a studiare il meccanismo di gating del canale TRP da angoli strutturali e a misurare le proprietà elettrofisiologiche del canale TRP con proteine purificate.

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Protocollo

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1. Purificazione di TRP con tag GST e frammenti NORPA con tag His

  1. Purificare il frammento TRP 1261-1275 con tag GST
    1. Trasformare il plasmide 10 pGEX 4T-1 TRP 1261-1275 in celle Escherichia coli (E. coli) BL21 (DE3) utilizzando il metodo di trasformazione dello shock termico CaCl2 21. Inoculare una singola colonia in 10 mL di terreno di Luria Bertani (LB) e crescere durante la notte a 37 °C. Quindi, amplificare i 10 mL di coltura di semina in 1 L di terreno LB a 37 °C.
    2. Dopo che la densità ottica (OD600) delle cellule raggiunge 0,5, raffreddare le cellule a 16 °C e aggiungere 0,1 mM isopropil β-D-1-tiogalatopoliranoside (IPTG; concentrazione finale) per indurre la sovraespressione della proteina bersaglio e incubare a 16 °C per 18 ore.
    3. Dopo sovraespressione, pellet 1 L di cellule coltivate mediante centrifugazione a 3.993 × g per 20 minuti e risospeso in 40 mL di tampone salino tamponato con fosfato (PBS).
    4. Caricare le celle risospese in un omogeneizzatore ad alta pressione pre-raffreddato a 4 °C. Aumentare lentamente la pressione dell'omogeneizzatore a 800 bar. Aprire il rubinetto di ingresso e lasciare che le celle risospese passino circolarmente attraverso una valvola con fessure molto strette.
      NOTA: Le celle sono omogeneizzate dalle elevate forze di taglio causate da una grande caduta di pressione e cavitazione.
    5. Caricare 5 mL di perline di glutatione su una colonna di flusso gravitazionale e lavare le perline con 50 mL di tampone PBS per un totale di tre volte.
    6. Centrifugare il lisato cellulare dall'omogeneizzatore ad alta pressione a 48.384 x g. Aggiungere il surnatante del lisato cellulare centrifugato (40 mL) alle perle di glutatione equilibrate nella colonna di flusso gravitazionale e incubare per 30 minuti a 4 °C. Sospendere le perle di glutatione ogni 10 minuti.
    7. Dopo 30 minuti di incubazione, aprire il rubinetto di uscita della colonna per separare le perline e la frazione di flusso. Scartare la frazione di flusso. Risciacquare due volte le restanti perle di glutatione con 50 ml di tampone PBS.
    8. Aggiungere 15 mL di tampone di eluizione alle perle di glutatione e incubare per 30 minuti. Sospendere le perline ogni 10 minuti.
    9. Dopo 30 minuti di incubazione, eluire il frammento TRP 1261-1275 con tag GST in un tubo conico da 50 mL e caricare in una colonna di esclusione dimensionale (grado di preparazione), che viene bilanciata utilizzando un buffer Tris da 50 mM (pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT).
    10. Mantenere la portata di eluizione della colonna di esclusione delle dimensioni a 3 ml/min. Raccogliere le proteine eluite alla velocità di 5 ml/tubo.
    11. Identificare il picco della proteina bersaglio nella colonna di esclusione dimensionale analizzando i segnali di assorbimento UV a 280 nm e verificare mediante analisi del gel SDS-PAGE (parametri di elettroforesi: 150 V per il gel impilante; 200 V per il gel risolutivo). Macchiare il gel con Coomassie blu R250.
    12. Concentrare il frammento TRP 1261-1275 purificato con tag GST dalla colonna di esclusione delle dimensioni a 1 mL utilizzando una colonna di spin di ultrafiltrazione da 15 mL centrifugata a 3.000 x g a 4 °C in una centrifuga refrigerata da scrivania.
    13. Determinare la concentrazione di proteine concentrate utilizzando la legge di Beer-Lambert. Misurare l'assorbimento UV del frammento TRP 1261-1275 con tag GST a 280 nm utilizzando uno spettrofotometro.
    14. Ottenere il coefficiente di estinzione a 280 nm importando le sequenze proteiche nel programma Protparam (https://web.expasy.org/protparam/). Tipicamente, 1 L di coltura di TRP 1261-1275 con tag GST produce 1 mL di 600 μM di proteine (6 x 10-7 mol). Vedere la Tabella 1 per i materiali necessari.
  2. Purificazione del frammento NORPA 863-1095 con tag His
    1. Trasformare il plasmide 20 pETM.3C NORPA 863-1095 in celle E. coli BL21 (DE3) utilizzando il metodo di trasformazione da shock termico CaCl2 21. Inoculare una singola colonia in 10 ml di LB medium e crescere durante la notte a 37 °C. Quindi, amplificare la coltura di semina da 10 ml in 1 L di terreno LB a 37 °C.
    2. Dopo che l'OD600 delle cellule raggiunge 0,5, raffreddare le cellule a 16 °C e aggiungere 0,1 mM IPTG (concentrazione finale) per indurre la sovraespressione della proteina bersaglio e incubare a 16 °C per 18 h.
    3. Dopo sovraespressione, pellet 1 L di cellule coltivate mediante centrifugazione a 3.993 x g per 20 minuti e risospeso in 40 mL di tampone legante. Successivamente, lisare le celle risospese in un omogeneizzatore ad alta pressione a 4 °C come descritto al punto 1.1.4.
    4. Caricare 5 mL di Ni-beads in una colonna di flusso gravitazionale e lavare tre volte con 50 mL di tampone di legame.
    5. Centrifugare il lisato cellulare dall'omogeneizzatore ad alta pressione a 48.384 x g. Aggiungere il surnatante del lisato cellulare centrifugato alle perle di Ni bilanciate nella colonna di flusso gravitazionale e incubare per 30 minuti a 4 °C. Sospendere le Ni-beads ogni 10 minuti.
    6. Dopo 30 minuti di incubazione, aprire il rubinetto di uscita della colonna per separare le perline e la frazione di flusso. Scartare la frazione passante e lavare due volte le restanti perline ni con 50 ml di tampone di lavaggio.
    7. Aggiungere 15 mL di tampone di eluizione alle ni-perline e incubare per 30 minuti. Sospendere le Ni-beads ogni 10 minuti.
    8. Dopo 30 minuti di incubazione, raccogliere il frammento NORPA 863-1095 eluito his-tagged in un tubo conico da 50 mL e caricarlo in una colonna di esclusione dimensionale (grado di preparazione), che viene bilanciata utilizzando 50 mM Tris (pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT).
    9. Mantenere la portata di eluizione della colonna di esclusione delle dimensioni a 3 ml/min. Raccogliere la proteina eluita alla velocità di 5 ml/tubo.
    10. Identificare il picco della proteina bersaglio nella colonna di esclusione dimensionale analizzando i segnali di assorbimento UV a 280 nm e verificare mediante analisi del gel SDS-PAGE (parametri di elettroforesi: 150 V per il gel impilante; 200 V per il gel risolutivo). Macchiare il gel usando Coomassie blu R250.
    11. Concentrare il frammento NORPA 863-1095 purificato con tag His dalla colonna di esclusione delle dimensioni a 1 mL utilizzando una colonna di centrifuga di ultrafiltrazione da 15 mL centrifugata a 3.000 x g a 4 °C in una centrifuga refrigerata da banco.
    12. Determinare la concentrazione di proteine concentrate utilizzando la legge di Beer-Lambert. Misurare l'assorbimento UV del frammento NORPA 863-1095 con tag His a 280 nm utilizzando uno spettrofotometro.
    13. Ottenere il coefficiente di estinzione a 280 nm importando le sequenze proteiche nel programma Protparam (https://web.expasy.org/protparam/). Tipicamente, la coltura da 1 L del frammento NORPA 863-1095 con tag His produce 1 mL di 600 μM di proteine (6 x 10-7 mol). Vedere la Tabella 2 per i materiali necessari.

2. Preparazione delle teste di Drosophila

  1. Raccogliere mosche adulte in tubi di centrifugazione conica da 50 ml utilizzando il metodo di anestesia CO2 22,23; congelare immediatamente in azoto liquido per 10 minuti e conservare in un congelatore a -80°C.
  2. Dopo aver raccolto un numero sufficiente di mosche, scuotere vigorosamente i tubi conici congelati da 50 ml a mano per separare le gambe, le teste, le ali e i corpi delle mosche. Trasferire la miscela in tre setacci in acciaio inossidabile preraffreddati in sequenza (rispettivamente 20/30/40 dimensioni di maglia) e agitare i setacci.
  3. Successivamente, poiché le teste non possono passare attraverso il setaccio a 40 maglie, utilizzare una spazzola per spazzare via le teste di mosca dal setaccio a 40 maglie, trasferirle in tubi conici da 50 ml e conservarle a -80 ° C.
  4. Raccogliere continuamente le mosche e le loro teste e conservarle in un congelatore a -80 °C fino a quando non raggiungono la quantità necessaria per la sperimentazione (0,5 g). In genere, per raccogliere 0,5 g di teste, sono necessari 35 ml di mosche in un tubo conico da 50 ml. Vedere la Tabella 3 per i materiali necessari.

3. Purificazione del canale TRP di Drosophila

  1. Pesare un totale di 0,5 g di teste e omogeneizzare completamente in azoto liquido utilizzando un pestello di mortaio pre-raffreddato. Sciogliere le teste omogeneizzate in un tampone di lisi 10x v/w (5 mL), incubare in uno shaker a 4 °C per 20 min e quindi centrifugare a 20.817 x g per 20 min a 4 °C.
  2. Raccogliere il surnatante spin-down ("20817 g S", Figura 4) e centrifugarlo ulteriormente a 100.000 x g per 60 minuti a 4 °C. Utilizzare il surnatante spin-down ("100.000 g S", Figura 4) per il seguente test pull-down.
  3. Aggiungere 1 mL di Ni-beads nella colonna di flusso gravitazionale e lavare le perline con 10 mL di H2O (ddH2O) a doppio distillato a 4 °C per un totale di tre volte. Equilibrare le perline con 10 volumi di colonne di tampone di lisi tre volte a 4 °C.
  4. Aggiungere 500 μL di 600 μM purificata con la proteina NORPA 863-1095 purificata (3 x 10-7 mol) nella colonna Ni e incubare per 30 minuti a 4 °C. Sospendere le perline ogni 10 minuti.
  5. Aprire il rubinetto di uscita della colonna per separare le perline e la frazione di flusso. Prendere la frazione di flusso per l'analisi SDS-PAGE (NORPA F, Figura 4). In questa sezione, le proteine dell'esca sono immobilizzate sulle perle di Ni.
  6. Lavare le ni-perline con 10 volumi di colonna di tampone di lisi (10 ml) a 4 °C e mantenere la frazione di lavaggio per l'analisi SDS-PAGE (Wash 1, Figura 4A). Ripetere i passaggi precedenti e conservare il campione per l'analisi SDS-PAGE (Wash 2, Figura 4A). In questa sezione, le proteine eccessive dell'esca sulle perline Ni vengono rimosse.
  7. Aggiungere il surnatante dell'omogeneizzato di testa di Drosophila dopo 100.000 x g di centrifugazione nella colonna Ni a 4 °C, dove il frammento NORPA 863-1095 con etichetta His è stato immobilizzato.
  8. Incubare il surnatante con le Ni-perline a 4 °C per 30 min. Sospendere le perline ogni 10 minuti. Quindi, apri il rubinetto di uscita della colonna per separare le perline e la frazione di flusso.
  9. Raccogliere il surnatante per l'analisi SDS-PAGE (lisi della testa di Dro F, Figura 4A). In questa sezione, i complessi proteici INAD (INAD/TRP/ePKC) negli omogeneizzati della testa sono catturati dai frammenti immobilizzati NORPA 863-1095 sulle ni-perline.
  10. Lavare le ni-perline con 10 volumi di colonna di tampone di lisi (10 ml) a 4 °C e mantenere il surnatante dalla precipitazione per gravità per l'analisi SDS-PAGE (Wash 3, Figura 4A). Ripetere i passaggi precedenti e raccogliere il surnatante per l'analisi SDS-PAGE (Wash 4, Figura 4A). In questa sezione, le proteine non legate sulle perline Ni vengono rimosse.
  11. Aggiungere 500 μL di 600 μM di proteina TRP 1261-1275 con tag GST (3 x 10-7 mol) nelle Ni-beads e incubare per 20 minuti a 4 °C. Sospendere le perline ogni 10 minuti.
  12. Raccogliere la frazione eluita dalla colonna gravitazionale (TRP E1, Figura 4B), che contiene il canale Endogeno Drosophila TRP. Ripetere i passaggi precedenti e raccogliere la frazione di eluizione (TRP E2, Figura 4B). In questa fase, utilizzando i frammenti TRP 1261-1275 con tag GST come concorrente, i canali TRP vengono eluiti dai complessi proteici INAD catturati (INAD / TRP / ePKC) sulle ni-perline.
  13. Lavare le ni-perline con 10 volumi di colonna di tampone di rilegatura (10 ml; Tabella 1) a 4 °C e raccogliere la frazione di lavaggio per l'analisi SDS-PAGE (Wash 5, Figura 4B).
  14. Aggiungere 500 μL di tampone di eluizione (Tabella 1) nelle ni-perline e incubare per 20 minuti a 4 °C. Raccogliere la frazione di eluizione dalla colonna del flusso gravitazionale (NORPA E1, Figura 4B). Ripetere i passaggi precedenti e raccogliere la frazione di eluizione (NORPA E2, Figura 4B).
  15. Utilizzando il tampone di eluizione, eluire il frammento NORPA 863-1095 his-tagged accompagnato dai complessi proteici INAD/ePKC. Successivamente, risospese le Ni-beads in 500 μL di buffer di legame.
  16. Prendi le Ni-beads risospese per eseguire la SDS-PAGE (colorata da Coomassie blue R250) per analizzare l'efficienza dell'eluizione e valutare se il buffer elute funziona (perline, Figura 4B). Vedere la Tabella 4 per i materiali necessari.

4. Purificazione della colonna di esclusione delle dimensioni del canale TRP di Drosophila

  1. Installare una colonna di esclusione dimensionale (grado analitico) sul sistema di purificazione delle proteine. Equilibrare la colonna con il buffer di colonna (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, 0,75 mM DDM), che viene filtrato da un filtro da 0,45 μm.
  2. Concentrare la frazione TRP E1 ed E2 dalla fase 3.14 utilizzando una colonna di spin di ultrafiltrazione da 4 mL, centrifugata a 3.000 x g a 4 °C in una centrifuga refrigerata.
  3. Risciacquare il ciclo di campionamento con il buffer di colonna e caricare il campione nel ciclo di campionamento. Iniettare il campione nella colonna di esclusione dimensionale ed eluire le proteine con una portata adeguata (0,5 ml/min).
  4. Identificare il picco della proteina bersaglio per assorbimento a 280 nm ed eseguire un gel SDS-PAGE per rilevare il canale Endogeno Drosophila TRP purificato (Figura 5). Vedere la Tabella 5 per i materiali necessari.

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Risultati

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In questo articolo, viene dimostrato un metodo di purificazione delle proteine per purificare il canale Endogeno Drosophila TRP (Figura 1).

In primo luogo, l'espressione e la purificazione delle proteine ricombinanti vengono applicate per ottenere l'esca e le proteine concorrenti. Quindi, un frammento TRP 1261-1275 con tag GST viene espresso in cellule E. coli BL21 (DE3) in mezzo LB e purificato utilizzando perline di glutatione e una colonna di ...

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Discussione

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INAD, che contiene cinque domini PDZ, è l'organizzatore principale del macchinario di fototrasduzione Drosophila. Studi precedenti hanno dimostrato che INAD PDZ3 si lega al canale TRP C-terminale coda con squisita specificità (KD = 0,3 μM)18. Il tandem INAD PDZ45 interagisce con il frammento NORPA 863-1095 con un'affinità di legame estremamente elevata (KD = 30 nM). Questi risultati forniscono una solida base biochimica per progettare la purificazione dell'affinità p...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (n. 31870746), Shenzhen Basic Research Grants (JCYJ20200109140414636) e Natural Science Foundation of Guangdong Province, Cina (n. 2021A1515010796) a W. L. Ringraziamo LetPub (www.letpub.com) per la sua assistenza linguistica durante la preparazione di questo manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
ceppi batterici
BL21(DE3) Cellule competentiNovagen69450Sovraespressione proteica
Modelli di esperimento
D.melanogaster: W1118 ceppoBloomington Drosophila Stock CenterBDSC:3605Drosophila preparazione della testa
Material
20/30/40 setacci in acciaio inossidabile a magliaJiufeng azienda di reti metalliche GB/T6003.1Drosophila preparazione della testa
30% acrilammide-N,N′-Metilenbisacrilammide (29:1)LableadA3291SDS-PAGE preparazione del gel
Persolfato di ammonioInvitrogenHC2005Preparazione del gel SDS-PAGE
Cocktail Inibitore della proteasiRoche05892953001Inibitore della proteasi
Coomassie blu brillante R-250Sangon BiotechA100472-0025Colorazione del gel SDS-PAGE
DL-Ditiotreitolo (DTT)Sangon BiotechA620058-0100Preparazione
del tampone della colonna ad esclusione dimensionaleSale disodico dell'acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)Sangon BiotechA500838-0500Preparazione del tampone della colonna ad esclusione dimensionale
GlycineSangon BiotechA610235-0005Preparazione del tampone SDS-PAGE
Glutatione Sepharose 4 perle Fast FlowCytiva17513202Cromatografia di affinità
ImidazoleSangon BiotechA500529-0001Tampone di eluizione preparato per Ni-colonna
Isopropil-beta-D-tiogalattopiranoside (IPTG)Sangon BiotechA600168-0025Induzione della sovraespressione proteica
LB Brodo in polvereSangon BiotechA507002-0250E.coli. coltura cellulare
L-Glutatione ridotto (GSH)Sigma-aldrichG4251-100GPreparazione del tampone di eluizione per perle di glutatione
Perle di Ni-Sepharose excelCytiva17371202Cromatografia di affinità
N-Dodecil beta-D-maltoside (DDM)Sangon BiotechA610424-001Detergente per la purificazione delle proteine
N,N,N',N'-Tetrametiletilendiammina (TEMED)Sigma-aldrichT9281-100MLPreparazione gel SDS-PAGE
PBSSangon BiotechE607008-0500Tampone di omogeneizzazione per cellule E.coli.
PMSFLableadP0754-25GInibitore della proteasi
Marcatore proteico prestainatoThermo Scientific26619/26616Scala proteica prestained
Colonna di esclusione dimensionale (grado di preparazione)Cytiva28989336Colonna HiLoad 26/60 Superdex 200 PG
Colonna di esclusione dimensionale (grado analitico)Cytiva29091596Superose 6 Increase 10/300 GL
colonna Cloruro di sodioSangon BiotechA501218-0001Preparazione del tampone per la purificazione delle proteine
Dodecil solfato di sodio (SDS)Sangon BiotechA500228-0001SDS-PAGE preparazione del gel/tampone
Tris baseSigma-aldrichT1503-10KGPreparazione del tampone per la purificazione delle proteine
Spin per ultrafiltrazione colonnaMilliporeUFC901096/801096Concentrazione di proteine
Attrezzatura
Bilancia analiticaDENVERAPX-60Metage di Drosophila head
Centrifuga refrigerata da tavolo ad alta velocità per provette da centrifugazione coniche da 15 ml e 50 mlEppendorf5810RConcentrazione di proteine
Centrifuga refrigerata ad alta velocità da tavolo Provette per centrifugazione da 1,5 mlEppendorf5417RCentrifugazione del lisato di testa Drosophila dopo l'omogeneizzazione
Colonna di flusso per gravità vuota (diametro interno = 1,0 cm)Bio-Rad738-0015Purificazione delle proteine TRP
Colonna di flusso per gravità vuota (diametro interno = 2,5 cm)Bio-Rad738-0017Purificazione di esche e proteine concorrenti da E.coli.
Gel Sistemadi documentazione Bio-RadUniversal Hood II Gel Doc XR SystemSDS-PAGE imaging
Centrifuga refrigerata ad alta velocitàColtro BeckmanAvanti J-26 XPCentrifugazione di cellule E.coli./lisato cellulare
Omogeneizzatore ad alta pressioneUNION-BIOTECHUH-05Omogeneizzazione delle cellule E.coli.
Serbatoio di azoto liquidoTaylor-WhartonCX-100Drosophila preparazione della testa Sistema di
purificazione delle proteine CytivaAKTA Purificatorediproteine
Frigorifero (-80° C)Thermo900GPem>Drosophila preparazione della testa
SpettrofotometroMAPADAUV-1200OD600 Misurazione di cellule E.coli.
SpettrofotometroThermo ScientificNanoDrop 2000cDeterminazione della concentrazione proteica
UltracentrifugaColtroBeckman Optima XPN-100 UltracentrifugaUltracentrifugazione
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Riferimenti

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  1. Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
  2. Huang, J., et al. Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors. Current Biology: CB. 20 (3), 189-197 (2010).
  3. Chyb, S., Raghu, P., Hardie, R. C. Polyunsaturated fatty acids activate the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL. Nature. 397 (6716), 255-259 (1999).
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