Il presente protocollo descrive un modello unico e clinicamente rilevante di arteriopatia periferica che combina l'elettrocoagulazione dell'arteria femorale e venosa con la somministrazione di un inibitore dell'ossido nitrico sintasi per indurre la cancrena degli arti posteriori nei topi FVB. La perfusione intracardiaca di DiI viene quindi utilizzata per l'imaging tridimensionale ad alta risoluzione della vascolarizzazione del footpad.
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Articolo metodologico
Imaging tridimensionale ad alta risoluzione della vascolarizzazione del footpad in un modello di cancrena posteriore murina
In questo articolo
Sommario
Abstract
La malattia arteriosa periferica (PAD) è una causa significativa di morbilità derivante dall'esposizione cronica a fattori di rischio aterosclerotici. I pazienti affetti dalla sua forma più grave, l'ischemia cronica che minaccia gli arti (CLTI), affrontano notevoli menomazioni nella vita quotidiana, tra cui dolore cronico, distanza a piedi limitata senza dolore e ferite non cicatrizzanti. Modelli preclinici sono stati sviluppati in vari animali per studiare la PAD, ma l'ischemia degli arti posteriori del topo rimane la più utilizzata. Ci possono essere variazioni significative nella risposta all'insulto ischemico in questi modelli a seconda del ceppo di topo utilizzato e del sito, del numero e dei mezzi di interruzione arteriosa. Questo protocollo descrive un metodo unico che combina l'elettrocoagulazione dell'arteria femorale e della vena con la somministrazione di un inibitore dell'ossido nitrico sintasi (NOS) per indurre in modo affidabile la cancrena del footpad nei topi Friend Virus B (FVB) che assomiglia alla perdita di tessuto di CLTI. Mentre i mezzi tradizionali di valutazione della riperfusione come l'imaging laser doppler perfusione (LDPI) sono ancora raccomandati, la perfusione intracardiaca del colorante lipofilo 1,1'-diottadecil-3,3,3',3'-tetrametilindocarbocianina perclorato (DiI) viene utilizzata per etichettare la vascolarizzazione. La successiva microscopia a scansione laser confocale a montaggio intero consente la ricostruzione tridimensionale (3D) ad alta risoluzione delle reti vascolari footpad che integra i mezzi tradizionali di valutazione della riperfusione nei modelli di ischemia degli arti posteriori.
Introduzione
La malattia arteriosa periferica (PAD), caratterizzata da un ridotto flusso sanguigno alle estremità a causa dell'aterosclerosi, colpisce 6,5 milioni di persone negli Stati Uniti e 200 milioni di persone in tutto il mondo1. I pazienti con PAD sperimentano una ridotta funzionalità degli arti e qualità della vita, e quelli con CLTI, la forma più grave di PAD, sono ad aumentato rischio di amputazione e morte con un tasso di mortalità a 5 anni vicino al 50%2. Nella pratica clinica, i pazienti con indici caviglia-brachiali (ABI) <0,9 sono considerati affetti da PAD e quelli con ABI < 0,4 associati a dolore a riposo o perdita ....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali descritti nel protocollo sono stati approvati dall'Università di Miami Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Per lo studio sono stati utilizzati topi FVB, sia maschi che femmine, di età compresa tra 8 e 12 settimane.
1. Preparazione della soluzione L-NAME
- In condizioni sterili in una cappa a flusso laminare, preparare una soluzione madre L-NAME sciogliendo 1 g di polvere L-NAME (vedere Tabella dei materiali) con 20 ml di acqua sterile per ottenere 50 mg/mL di soluzione. Conservare la soluzione madre in aliquote da 300-500 μL a -20 °C per un massim....
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Risultati
Questo protocollo descrive un mezzo affidabile per indurre ischemia e perdita di tessuto nella pedana murina utilizzando una combinazione di arteria femorale e coagulazione venosa con la somministrazione di L-NAME, un inibitore dell'ossido nitrico sintasi, in topi FVB sensibili. La Figura 1 descrive in dettaglio l'anatomia della vascolarizzazione murina degli arti posteriori e indica i siti dell'arteria femorale e della coagulazione venosa (X gialla), appena prossimali all'arteria femorale c.......
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Discussione
Mentre l'ischemia del tronco posteriore del topo è il modello preclinico più utilizzato per studiare la neovascolarizzazione in PAD e CLTI, vi è una variazione significativa nella gravità e nel recupero dell'ischemia a seconda del ceppo murino specifico utilizzato e del sito, del numero e del metodo di interruzione arteriosa. La combinazione di legatura dell'arteria femorale e somministrazione IP di L-NAME può indurre in modo affidabile la cancrena degli arti posteriori nei topi FVB11. Lo stesso t.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni a Z-J L e OC V dal National Institutes of Health [R01HL149452 e VITA (NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS)]. Ringraziamo anche la Microscopy and Imaging Facility del Miami Project to Cure Paralysis presso la University of Miami School of Medicine per aver fornito l'accesso al loro software di analisi ed elaborazione delle immagini.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Clip per raccoglitori (piccole) | di forniture per ufficio | ||
| Buprenorfina (a rilascio prolungato) | |||
| Ago a farfalla (25 G con Luer-Lok) | VWR | 10148-584 | |
| Microscopio a scansione laser confocale | Leica | TCS SP5 | |
| DiI (1,1'-Diottadecil-3,3,3',3',3'-tetrametilindocarbocianina perclorato) | Invitrogen | D282 | |
| Dispositivo di elettrocauterizzazione | Gemini Cautery System | 5917 | |
| Etanolo (100%) | VWR | 89370-084 | |
| Fiji (ImageJ) software | NIH | Usato versione 2.1.0. Download gratuito, nessuna licenza richiesta. | |
| Cuscinetti per biopsia in schiuma | Fisher Scientific | 22-038-221 | |
| Formalina (tampone neutro, 10%) | VWR | 89370-094 | |
| FVB topi | Jackson Laboratory | 001800 | |
| Glucosio | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| HCl (1 M) | Sigma-Aldrich | 13-1700 | |
| Imaris software | Oxford Instruments | Versione usata 9.6.0. | |
| Isoflurano | Pivetal | NDC 46066-755-04 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Ketamina | |||
| L-NAME (Nω-Nitro-L-arginina metil estere cloridrato) | Sigma-Aldrich | N5751 | |
| Laser Doppler perfusion imager | MoorLDI | moorLDI2-HIR | Software moorLDI V5 usato. |
| Vetrini per microscopio (25 x 75 x 1 mm) | VWR | 48311-703 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8263 | |
| Aghi (27 G) | BD | 305109 | |
| Tampone di iodio povidone (10%) | Medline | MDS093901ZZ | |
| Strumenti chirurgici | Roboz Surgical | Si consigliano pinze sottili, cacciatore per aghi, forbici a molla ed emostato. | |
| Sutura (5-0 assorbibile) | G275017B0P | DemeTECH | |
| (10 mL) | BD | 305482 | |
| Rubinetti a tre vie | Cole-Parmer | 19406-49 | |
| plug-in | , nessuna licenza richiesta. Vedi riferimento: Elfarnawany (2015). | ||
| Xilazina |
Riferimenti
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139(2020).
- Duff, S., Mafilios, M. S., Bhounsule, P., Hasegawa, J. T. The burden of ....
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Ristampe e permessi
