Metodi in vitro e in vivo per esplorare la megacariopoiesi

François Lanza; Christian Gachet; Anita Eckly

doi:10.3791/63286

Articolo metodologico

Metodi in vitro e in vivo per esplorare la megacariopoiesi

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DOI:

10.3791/63286

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17 novembre 2021

François Lanza¹ , Christian Gachet¹ , Anita Eckly¹

¹Université de Strasbourg, INSERM, EFS Grand Est, BPPS UMR-S 1255, FMTS, F-67065 Strasbourg, France

In questo articolo

Abstract

ARTICOLI DISCUSSI:

1. Pongerard, A., Mallo, L., Gachet, C., Lanza, F., Strassel, C. Filtri per leucodeplezione Cellule CD34+ derivate come fonte cellulare per studiare la differenziazione dei megacariociti e la formazione delle piastrine. Giornale di esperimenti visualizzati: JoVE. (171), E62499 (2021).

2. Kimmerlin, Q., Tavian, M., Gachet, C., Lanza, F., Brouard, N. Isolamento dei progenitori megacariociti di topo. Giornale di esperimenti visualizzati: JoVE. (171), E62498 (2021).

3. Boscher, J., Gachet, C., Lanza, F., Léon, C. Coltura di megacariociti in idrogel 3D a base di metilcellulosa per migliorare la maturazione cellulare e studiare l'impatto della rigidità e del confinamento. Giornale di esperimenti visualizzati: JoVE. (171), E62511 (2021).

4. Scandola, C., Lanza, F., Gachet, C., Eckly, A. Esplorazione in situ della megacariopoiesi murina utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione. Giornale di esperimenti visualizzati: JoVE. (171) E62494 (2021).

5. Guinard, I., Gachet, C., Lanza, F., Léon, C., Eckly, A. Dinamica della formazione delle propiastrine degli espianti di midollo osseo fresco di topo. Giornale di esperimenti visualizzati: JoVE. (171), E62501 (2021).

6. Bornert, A., Pertuy, F., Gachet, C., Lanza, F., Léon, C. Imaging in vivo a due fotoni di megacariociti e propiastrine nel midollo osseo del cranio di topo. Giornale di esperimenti visualizzati: JoVE. (171), E62515 (2021)

Editoriale

Le piastrine sono piccole cellule del sangue anucleate, essenziali per l'emostasi, che derivano dai megacariociti (MK) nel midollo osseo (BM). Durante la loro differenziazione dalle cellule staminali ematopoietiche, le MK si sviluppano in cellule giganti in un complesso processo di differenziazione e maturazione che include la poliploidizzazione e la maturazione citoplasmatica. Nella fase finale dello sviluppo, quando le MK sono a contatto con le cellule endoteliali, raggiungono il loro stadio maturo ed estendono lunghe estensioni citoplasmatiche, chiamate propiastrine, nei vasi sanguigni, che poi si frammentano per dare origine alle piastrine nel flusso sanguigno ^1,2. I meccanismi che regolano la maturazione delle MK e la formazione transendoteliale delle propiastrine non sono ancora completamente compresi. L'obiettivo di questa collezione è quello di riunire metodi complementari che contribuiranno a comprendere meglio la biologia delle MK in vitro e in vivo.

L'espansione e il differenziamento in vitro delle MK è ampiamente utilizzato per studiare i meccanismi alla base della biogenesi piastrinica. Nel protocollo di Pongerard et al., gli autori descrivono un protocollo di coltura standardizzato per la differenziazione dei MK dai progenitori ematopoietici CD34⁺ umani. Sottolineano in particolare che i filtri per leucociti disponibili nei centri trasfusionali sono una fonte eccezionale per la raccolta di cellule CD34⁺. Il loro articolo contiene diverse linee guida essenziali su come estrarre le cellule CD34⁺, come valutarne la purezza e l'importanza della loro densità di semina. Gli autori propongono anche un metodo di pipettaggio calibrato, cinque volte di seguito, per rilasciare in modo efficiente le piastrine funzionali. Interessanti applicazioni di questo metodo sono la possibilità di valutare composti farmacologici o di manipolare geneticamente cellule CD34⁺ utilizzando un metodo di editing genomico CRISPR-Cas9 ^3,4. Per gli studi sui topi, Kimmerlin et al. presentano una strategia di smistamento cellulare per purificare i progenitori MK in numero sufficiente compatibile con i saggi molecolari e cellulari. Gli autori discutono i vantaggi dell'utilizzo della cresta iliaca come fonte di midollo osseo contenente un gran numero di progenitori ematopoietici e dell'esecuzione di una deplezione magnetica in due fasi delle cellule indesiderate prima dello smistamento cellulare utilizzando una combinazione di marcatori di superficie cellulare. Uno dei principali vantaggi di questo metodo è la riduzione del numero di animali necessari per ottenere progenitori MK altamente purificati che, ad esempio, può essere di interesse per i ricercatori che studiano la gerarchia dei progenitori ematopoietici e la loro differenziazione. In questo contesto, Boscher et al. descrivono un metodo per far crescere i progenitori in un terreno 3D composto dal 2% di metilcellulosa per imitare meglio l'ambiente in vivo. Infatti, questi autori hanno precedentemente dimostrato che gli MK cresciuti in un idrogel 3D raggiungono uno stato di maturazione maggiore e una maggiore capacità di formare progenitori rispetto a quelli cresciuti in un mezzo liquido⁵. In questo protocollo vengono evidenziati passaggi critici come il volume appropriato di metilcellulosa per ottenere una rigidità ottimale del mezzo, il numero di cellule che dovrebbero essere equivalenti in ciascuna condizione sperimentale e il rischio di contaminazione. Per la verifica funzionale del livello di maturazione, gli autori spiegano come risospendere le cellule in coltura gel in terreno liquido il terzo giorno di coltura e come fissare le cellule per analisi future mediante immunocolorazione, citometria a flusso o microscopia elettronica. La microscopia elettronica a trasmissione (TEM) è l'approccio di imaging preferito per fornire ultrastrutture ad alta risoluzione di MK. Qui, Scandola et al. condividono un protocollo per analizzare l'ultrastruttura dei MK nel loro ambiente naturale di midollo osseo, e per quantificare la loro densità cellulare e valutare le diverse fasi di maturazione. Gli autori utilizzano la TEM per analizzare gli eventi cellulari che si verificano quando le MK interagiscono con la parete sinusoidale, come le loro brevi sporgenze invasive simili a podosomi che penetrano nell'endotelio⁶. Un limite del metodo è che la fase iniziale dell'impegno di MK non può essere analizzata a causa della mancanza di specifiche caratteristiche ultrastrutturali di queste cellule immature. Come notato, questo approccio di imaging ha il vantaggio di utilizzare piccoli campioni di midollo osseo che consentono di eseguire più studi con un singolo topo. Ad esempio, gli altri campioni di midollo osseo possono essere utilizzati per la tecnica di espianto del midollo osseo presentata in questa raccolta da Guinard et al. per studiare l'estensione dinamica delle propiastrine da MK. Il punto di forza di questo metodo risiede nell'uso di MK che si sono sviluppati nel midollo osseo, evitando così qualsiasi potenziale interpretazione errata derivante da artefatti di differenziazione cellulare in coltura. Infatti, questo è stato precedentemente documentato in topi con inattivazione di MYH9 MK-limitata, dove sono stati trovati risultati divergenti in vitro ed ex vivo⁷. Gli autori sottolineano anche la natura semplice, riproducibile e rapida di questo approccio. Una nota interessante del loro protocollo è la capacità di utilizzare microscopi dotati di software di navigazione per facilitare il tracciamento/quantificazione delle propiastrine che estendono i MK. Un metodo complementare del modello di espiantazione è l'imaging a due fotoni di MK nel cranio del topo. L'unicità di questa tecnica è la capacità di studiare in vivo il comportamento dinamico di MK marcate in fluorescenza nel midollo osseo e di visualizzare l'estensione propiastrinica. Questo protocollo ha il vantaggio di essere minimamente invasivo, con interventi chirurgici limitati, evitando così reazioni infiammatorie che sono state segnalate per avere un impatto sulla formazione delle propiastrine. Come notano Bornert et al., una limitazione di questo metodo è la ridotta profondità che può essere ripresa a causa della densità dell'osso, che impone anche l'uso di topi più giovani. Questa tecnica può essere applicata a topi geneticamente modificati per studiare il ruolo di geni di interesse nella formazione di piastrine in vivo. Ad esempio, gli autori hanno utilizzato questa tecnica per dimostrare che il ruolo dei microtubuli nell'allungamento delle propiastrine differisce tra le condizioni in vitro e in vivo ⁸.

Lo sviluppo anomalo di MK e la produzione di piastrine possono portare a trombocitopenia o trombocitemia, aumentando il rischio di sanguinamento o trombosi, rispettivamente. I continui sforzi per analizzare i meccanismi molecolari che regolano la biogenesi piastrinica aumenteranno la nostra capacità di sviluppare nuove strategie per il trattamento della trombocitopenia e della trombocitemia. Nel campo della ricerca trasfusionale, questi sforzi getteranno le basi per la produzione di piastrine in coltura come alternativa trasfusionale in situazioni selezionate⁹.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), dall'Unione Europea attraverso il Fondo Europeo di Sviluppo Regionale (FESR) e dalla sovvenzione ANR-17-CE14-Megaplatprod a H.d.S e ANR-18-CE14-PlatForMechanics a C.L.

Riferimenti

Boscher, J., et al. Blood platelet formation at a glance. Journal of Cell Science. 133 (20), 244731(2020).
Machlus, K. R., Italiano, J. E. The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation. The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
Strassel, C., et al. Aryl hydrocarbon receptor-dependent enrichment of a megakaryocytic precursor with a high potential to produce proplatelets. Blood. 127 (18), 2231-2240 (2016).
Montenont, E., et al. CRISPR-edited megakaryocytes for rapid screening of platelet gene functions. Blood Advances. 5 (9), 2362-2374 (2021).
Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128 (16), 2022-2032 (2016).
Eckly, A., et al. Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (11), 2987-3001 (2020).
Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. 106 (5), 1368-1380 (2021).
Strassel, C., Gachet, C., Lanza, F. On the way to in vitro platelet production. Transfusion Clinique et Biologique. 25 (3), 220-227 (2018).

Ristampe e permessi

Tag

Megakaryocyte Differentiation Platelet Formation CD34+ Cells Mouse Megakaryocyte Progenitors 3D Methylcellulose-based Hydrogel Cell Maturation Murine Megakaryopoiesis Transmission Electron Microscopy Proplatelet Formation Dynamics Two-photon Imaging Bone Marrow Explants