Articolo metodologico

Analisi video al microscopio ad alta velocità per la diagnosi di prima linea della discinesia ciliare primaria

DOI:

10.3791/63292

⸱

19 gennaio 2022

 ,  ,  , 
1Allergy Centre, Tampere University Hospital, 2Department of Pediatrics, Turku University Hospital, 3Turku Bioscience Center, University of Turku and Åbo Akademi University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'analisi videomicroscopica ad alta velocità è uno strumento relativamente facile da eseguire, veloce, economico e, in mani esperte, uno strumento considerevolmente affidabile per la diagnostica di prima linea della discinesia ciliare primaria, che dovrebbe essere disponibile in ogni centro coinvolto nella diagnostica e nel trattamento di gravi malattie polmonari.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La discinesia ciliare primaria (PCD) è una malattia congenita prevalentemente ereditata in un tratto autosomico recessivo. Il disturbo provoca disturbi nel movimento delle ciglia, portando a una grave compromissione della clearance mucociliare (MCC). Se non diagnosticata o diagnosticata troppo tardi, la condizione porta allo sviluppo di bronchiectasie e gravi danni ai polmoni in età avanzata. La maggior parte dei metodi per diagnosticare la PCD richiedono molto tempo e richiedono ampie risorse economiche per stabilirli. L'analisi videomicroscopica ad alta velocità (HSVMA) è l'unico strumento diagnostico per visualizzare e analizzare le cellule respiratorie viventi con ciglia battenti in vitro. È veloce, economico e, in mani esperte, molto affidabile come strumento diagnostico per PCD. Inoltre, le misure diagnostiche classiche come la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) non sono applicabili per alcune mutazioni in quanto i cambiamenti morfologici sono assenti.

Questo documento descrive il processo di raccolta delle cellule epiteliali respiratorie, l'ulteriore preparazione del campione e il processo di HSVMA. Descriviamo anche come le cellule spazzolate possono essere mantenute con successo illese e picchiate tenendole in un mezzo nutriente per lo stoccaggio e il trasporto al sito di indagine nei casi in cui una clinica non possiede l'attrezzatura per eseguire HSVMA. Vengono mostrati anche video con modelli di battito patologico di pazienti con una mutazione nel gene della catena pesante del braccio di dineina 11 (DNAH11), che non può essere diagnosticato con TEM; il risultato di un HSVMA inconcludente a causa dell'infezione delle vie aeree superiori, nonché di una spazzolatura infruttuosa con sovrapposizione di globuli rossi. Con questo articolo, vorremmo incoraggiare ogni unità che si occupa di pazienti pneumologici e malattie polmonari rare a eseguire HSVMA come parte della loro diagnostica di routine quotidiana per PCD o inviare i campioni a un centro specializzato nell'esecuzione di HSVMA.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La discinesia ciliare primaria (PCD) è una rara malattia genetica ereditaria, che causa disturbi nel movimento delle ciglia che battono. Se non diagnosticato, porta a gravi danni polmonari in età avanzata a causa di una grave compromissione del MCC. In passato, la sua prevalenza è stata stimata nell'intervallo da 1:4.000 a 50.000. A causa del costante miglioramento della diagnostica e di una crescente consapevolezza della condizione, gli aggiornamenti sulla prevalenza della PCD suggeriscono che potrebbe essere molto più comune e probabilmente nell'intervallo da 1: 4.000 a 20.000 invecedi 1,2. Tuttavia, i pazienti con PCD sono ancora sottodiagnosticati o diagnosticati troppo tardi 1,3. Pertanto, i neonati con situs inversus congenito e/o eterotassia o rinorrea perinatale, distress respiratorio neonatale, naso chiuso e difficoltà di alimentazione dovrebbero essere sospetti per la PCD. In età avanzata, otite cronica, polmonite ricorrente, rinosinusite e una tosse umida cronica e tipica a causa di MCC compromesso sono i sintomi caratteristici della PCD, che in combinazione con bronchiectasie e compromissione della funzione polmonare, continuano nell'età adulta2.

I pazienti sospettati di avere PCD possono essere diagnosticati utilizzando diversi strumenti diagnostici. TEM è stato considerato il gold standard per la diagnostica di prima linea in passato. Tuttavia, fino al 30% dei casi di PCD non mostra un'ultrastruttura anormale 1,3,4,5,6, richiedendo un approccio diagnostico diverso. Pertanto, un numero crescente di centri e le linee guida della European Respiratory Society (ERS) suggeriscono una combinazione di ossido nitrico nasale (nNO) e HSVMA come diagnostica di prima linea 1,7,9,10. HSVMA e nNO sono anche le opzioni più convenienti nell'identificazione di un paziente con PCD11. Tuttavia, anche se i test genetici fossero inclusi nella diagnostica, si deve tenere presente che attualmente non esiste un test autonomo o una combinazione di test che possa escludere la PCD con certezza al 100% 8,9,10.

Tra le opzioni diagnostiche disponibili, HSVMA è l'unico test che si concentra sulle cellule respiratorie viventi rivestite di ciglia e valuta il modello di battito ciliare (CBP) e la frequenza del battito ciliare (CBF). A differenza di TEM, i risultati di HSVMA sono disponibili rapidamente, di solito il giorno del test, mentre i risultati di TEM potrebbero arrivare mesi dopo che il campione è stato prelevato. HSVMA può essere applicato a tutte le fasce d'età, mentre nNO richiede un alto grado di conformità; i tentativi di usarlo sotto i 5 anni di solito non hanno successo10. In mani esperte, HSVMA ha un'eccellente sensibilità e specificità per diagnosticare la PCD al 100% e al 96%, rispettivamente12.

Questo documento descrive la procedura passo-passo per eseguire HSVMA, compresa la raccolta di cellule respiratorie rivestite di ciglia dal turbinato inferiore del naso, la conservazione delle cellule raccolte in un mezzo nutritivo cellulare per il trasporto al sito di indagine e il processo di analisi video microscopica per determinare CBF e CBP. Inoltre, vengono mostrati alcuni video clip dei pazienti, confrontando CBP e CFF normali con funzione ciglia anormale (Video 3, Video 4, Video 5, Video 6, Video 7 e Video 8).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dichiarazione etica:

Questo studio è stato approvato dal comitato etico locale (69/2017) ed è stato condotto in conformità con la dichiarazione di Helsinki.

1. Raccolta e trasporto di cellule epiteliali respiratorie

  1. Spazzolatura
    1. Prima di spazzolare, somministrare un ciclo di due settimane di acido amoxicillina-clavulanico orale al paziente per sradicare i biofilm che interferiscono con la funzione delle ciglia. Assicurarsi che l'antibiotico venga interrotto 2 giorni prima della procedura.
    2. Per diminuire una sovrapposizione di materiale mucoso sulle strisce cellulari epiteliali spazzolate, chiedere al paziente di soffiarsi accuratamente il naso. Chiedi ai genitori di aiutare i loro bambini piccoli a soffiarsi il naso.
    3. Per la spazzolatura, utilizzare una spazzola interdentale di dimensioni 0,6 mm (vedere la Tabella dei materiali). Tenere la testa del paziente fissata con una mano e, con l'altra mano, spazzolare il turbinato inferiore di entrambe le narici per raccogliere sufficienti strisce di cellule epiteliali.
      NOTA: di solito si verifica una leggera resistenza quando si inserisce la spazzola interdentale in profondità sotto il turbinato inferiore. La spazzolatura nasale viene effettuata mediante rapida rotazione e prelievo per circa 2 s. Una spazzolatura più lunga e intensa potrebbe altrimenti causare gravi lesioni epiteliali ed epistassi consecutiva.
    4. Se la broncoscopia è pianificata per motivi diversi dalla sospetta PCD, raccogliere campioni durante la broncoscopia spazzolando la carina o l'epitelio bronchiale o mediante biopsia13.
    5. Far cadere le strisce cellulari raccolte in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL contenente il Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco che nutre le cellule.
      NOTA: le strisce di cellule epiteliali di solito cadono dalla spazzola più facilmente lanciando e ruotando la spazzola contro la parete del tubo.
    6. Chiudere il coperchio del tubo microcentrifuga e tenere il tubo contro una fonte di luce. Agitare il tubo per scoprire strisce e conglomerati di cellule raccolte.
  2. Trasporto dell'esemplare
    1. Posizionare i tubi microcentrifuga in una scatola di polistirolo ben chiusa e assicurarsi che il coperchio dei tubi sia correttamente chiuso e che i tubi siano fissati all'interno della scatola.
    2. Aggiungere un impacco freddo; tuttavia, evitare di congelare il campione.
      NOTA: la temperatura ottimale per conservare il campione prima dell'indagine è di circa 4-8 °C (39,2-46,4 °F).
    3. Assicurarsi che i campioni conservati vengano analizzati durante le successive 24 ore.
      NOTA: In questi esperimenti, il tempo medio tra le spazzolature e hSVMA è stato di 3 ore.

2. Analisi video al microscopio ad alta velocità (HSVMA)

  1. Videomicroscopia dei campioni
    1. Dopo aver ricevuto i tubi di microcentrifuga contenenti i campioni, riscaldarli fino a 37 °C (98,6 °F) per imitare un ambiente ottimale, simile a quello in vivo.
    2. Se il microscopio è dotato di un'unità di riscaldamento, posizionare i tubi sotto il cofano e riscaldarli lassù. In alternativa, utilizzare un'incubatrice per riscaldare i campioni.
    3. Avviare la fotocamera e il software dell'unità video sul PC.
    4. Usando una pipetta, prendi una piccola quantità del campione e metti due gocce in una cuvetta o in un piatto con fondo di vetro (vedi la Tabella dei materiali). Coprire la cuvetta o il piatto con un coperchio e metterlo sotto il microscopio.
    5. Per la valutazione dei campioni, utilizzare un microscopio a interferenza differenziale dotato di sorgente a luce fredda e di una videocamera in grado di registrare ad alta velocità (almeno 200 fotogrammi/s). Utilizzare una lente ad immersione in olio con un ingrandimento di 100x e mettere una goccia di olio ad immersione sulla superficie dell'ottica.
      NOTA: si consigliano microscopi con una lente che si avvicina dal basso.
    6. Avvicinati al fondo del piatto con la lente del microscopio e cerca cluster di cellule senza globuli rossi e con basso contenuto di muco. Dopo aver trovato una regione rappresentativa di interesse (ROI), concentrati su un gruppo specifico di ciglia battenti con i più grandi movimenti di ciglia e registra una sequenza video. Registra le cellule con le ciglia che battono lateralmente e dall'alto. Successivamente, cerca un altro gruppo rappresentativo di celle e ripeti la registrazione.
      NOTA: le cellule rivestite di ciglia devono essere studiate con un ingrandimento di 1.000x e le ciglia battenti devono essere registrate con una telecamera video digitale ad alta velocità (DHSV) impostata su un frame rate di 200 / s o più (256 / s in questo protocollo). Poiché i dati ottenuti dai video clip registrati richiedono molto spazio sul disco rigido, si consiglia un disco rigido SSD esterno.
  2. Analisi di sequenze video
    1. Per determinare CBF e CBP, riproducete i clip video fotogramma per fotogramma.
    2. Per determinare il CBF, imposta la frequenza dei fotogrammi al rallentatore con 15 fotogrammi/s e conta 10 battiti consecutivi.
    3. Registrare il numero di fotogrammi che passano durante un singolo ciclo di 10 battiti e inserire il risultato in Eq (1). Determinare la frequenza calcolando la media di tutti i cicli di battito delle ciglia registrati e confrontare il risultato con i valori di riferimento per l'età (vedere Tabella 1)14.
      figure-protocol-1 (1)
      Dove X è il numero di fotogrammi che passano durante un ciclo di 10 battiti.
    4. Per valutare il CBP, controllare se il movimento delle ciglia che battono è in gamma completa (vedere Figura 1) e sincronizzato. Chiedi a due operatori indipendenti di valutare il CBP per prevenire la distorsione della selezione.
    5. Segnalare che i risultati dell'analisi HSVMA sono compatibili, improbabili o inconcludenti con la PCD.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I video 1 e 2 mostrano un controllo normale in cui CBF e CBP si trovano nell'intervallo normale (vedere la Figura 1). Video 3, Video 4, Video 5 e Video 6 rappresentano due casi di pazienti con PCD con una mutazione omozigote nel gene DNAH11 (c.2341G > A; p. Glu781Lys)3. Questi video rappresentativi sono stati scelti perché i fenotipi delle...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, il processo diagnostico per PCD utilizzando HSVMA è descritto e discusso alla luce della diagnostica di prima linea. Nonostante sia relativamente facile da stabilire, conveniente11 e un metodo affidabile in maniesperte 12, HSVMA non è una misura diagnostica senza insidie. CBF e CBP anormali possono essere dovuti a infezioni secondarie, che portano all'infiammazione dell'epitelio bronco-respiratorio15 e, per lo stesso motivo, gli individui che fu...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Desideriamo esprimere un ringraziamento speciale all'infermiera pediatrica Johanna Juvankoski per il suo eccellente aiuto con le spazzolature. Vorremmo anche esprimere una speciale gratitudine al professor Heymut Omran (University Clinic Münster, UKM) per aver concesso il permesso di utilizzare la figura schematica del normale movimento ciliare dal loro sito web. Infine, vorremmo ringraziare il signor Alan Brown BA (Hons), PGCE, per la correzione di bozze del manoscritto.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Amoxicilina-acido clavulanicoOrion Oyj40 mg/kg diviso in 2 dosi/giorno, per adulti 875/125 mg 1 compressa x2/giorno
Software della fotocameraHamamatsuHCI Image
Cold packqualsiasiper la conservazione e il trasporto
Microscopio ad interferenza differenzialeCarl ZeissMicroscopio invertito, osservatore cellulare
Digitial High VideocameraHamamatsuOrca Flash 4.0, fotocamera digitale tipo C11440
Dulbecco´ s Terreno di coltura cellulare basale ThermoFisher Thermo Fisher10565018
Provetta EppendorfEppendorf30120086provetta da 1,5 mL
Piastra per micropozzetti con fondo in vetroCuvetta MatTekP35G-1,5-14-Cper microscopia
Unità di riscaldamentoCarl Zeiss/PeCon810-450001Elementi di incubazione Carl Zeiss con controllo
della temperatura PeCon TempModule S1Spazzolino interdentale 0,6 mmDoft872267Spazzolino interdentale su un filo lungo con manico riutilizzabile e tappo in zipbag
ObiettivoCarl Zeiss100x/1,46, α Obiettivo Plan-Apochromat DIC
Piccola scatola in polistirene con coperchioqualsiasiper il trasporto

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Werner, C., Onnebrink, J. G., Omran, H. Diagnosis and management of primary ciliary dyskinesia. Cilia. 4 (1), 2(2015).
  2. Mirra, V., Werner, C., Santamaria, F. Primary ciliary dyskinesia: An update on clinical aspects, genetics, diagnosis and future treatment strategies. Frontiers in Pediatrics. 5, 135(2017).
  3. Schultz, R., Elenius, V., Lukkarinen, H., Saarela, T. Two novel mutations in the DNAH11 gene in primary ciliary dyskinesia (CILD7) with considerable variety in the clinical and beating cilia phenotype. BMC Medical Genetics. 21 (1), 237(2020).
  4. Knowles, M. R., et al. Mutations of DNAH11 in patients with primary ciliary dyskinesia with normal ciliary ultrastructure. Thorax. 67 (5), 433-441 (2012).
  5. Boon, M., et al. Primary ciliary dyskinesia: critical evaluation of clinical symptoms and diagnosis in patients with normal and abnormal ultrastructure. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9, 11(2014).
  6. Kouis, P., et al. Prevalence of primary ciliary dyskinesia in consecutive referrals of suspected cases and the transmission electron microscopy detection rate: a systematic review and meta-analysis. Pediatric Research. 81 (3), 398-405 (2017).
  7. Marthin, J. K., Nielsen, K. G. Choice of nasal nitric oxide technique as first-line test for primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 37 (3), 559-565 (2011).
  8. Jackson, C. L., Behan, L., Collins, S. A. Accuracy of diagnostic testing in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 47 (3), 837-848 (2016).
  9. Lucas, J. S., et al. European Respiratory Society guidelines for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 49 (1), 1601090(2017).
  10. Shoemark, A., Dell, S., Shapiro, A., Lucas, J. S. ERS and ATS diagnostic guidelines for primary ciliary dyskinesia: similarities and differences in approach to diagnosis. European Respiratory Journal. 54 (3), 1901066(2019).
  11. Kouis, P. Cost-effectiveness analysis of three algorithms for diagnosing primary ciliary dyskinesia: a simulation study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 14 (1), 142(2019).
  12. Rubbo, B., et al. Accuracy of high-speed video analysis to diagnose primary ciliary dyskinesia. Chest. 155 (5), 1008-1017 (2019).
  13. Friedman, N. R., Pachigolla, R., Deskin, R. W., Hawkins, H. K. Optimal technique to diagnose primary ciliary dyskinesia. The Laryngoscope. 110 (9), 1548-1551 (2000).
  14. Chilvers, M. A., Rutman, A., O´Callaghan, C. Functional analysis of cilia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults. Thorax. 58 (4), 333-338 (2003).
  15. Lucas, J. S., Paff, T., Goggin, P., Haarman, E. Diagnostic methods in primary ciliary dyskinesia. Paediatric Respiratory Reviews. 18, 8-17 (2016).
  16. Ballenger, J. J. Experimental effect of cigarette smoke on human respiratory cilia. New England Journal of Medicine. 263, 832-835 (1960).
  17. Stanley, P. J., Wilson, R., Greenstone, M. A., Mac William, L., Cole, P. J. Effect of cigarette smoking on nasal mucociliary clearance and ciliary beat frequency. Thorax. 41 (7), 519-523 (1986).
  18. Kobbernagel, H. E., et al. Efficacy and safety of azithromycin maintenance therapy in primary cilia dyskinesia (BESTCILIA): a multicentre, double-blind, randomised, placebo-controlled phase 3 trial. Lancet Respiratory Medicine. 8 (5), 493-505 (2020).
  19. Takeyama, K., Tamaoki, J., Chiyotani, A., Tagaya, E., Konno, K. Effect of macrolide antibiotics on ciliary motility in rabbit airway epithelium in-vitro. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 45 (8), 756-758 (1993).
  20. Toskala, E., Haataja, J., Shirasaki, H., Rautliainen, M. Culture of cells harvested with nasal brushing: a method for evaluating ciliary function. Rhinology. 43 (2), 121-124 (2005).
  21. Pifferi, M., et al. Simplified cell culture method for the diagnosis of atypical primary ciliary dyskinesia. Thorax. 64 (12), 1077-1081 (2009).
  22. Hirst, R. A., et al. Culture of primary ciliary dyskinesia epithelial cells at air liquid interface can alter ciliary phenotype but remains a robust and informative, diagnostic aid. PLoS One. 9 (2), 89675(2014).
  23. Papon, J. F., et al. Quantitative analysis of ciliary beating in primary ciliary dyskinesia: a pilot study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 7 (10), 78(2012).
  24. Smith, C. M., et al. Cilia FA: a research tool for automated, high-throughput measurement of ciliary beat frequency using freely available software. Cilia. 1 (8), 14(2012).
  25. Sampaio, P., et al. Ciliar Move: new software for evaluating ciliary beat frequency helps find novel mutations by a Portuguese multidisciplinary team on primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal Open Research. 7 (1), 00792(2021).
  26. Mullowney, T., et al. Primary ciliary dyskinesia and neonatal respiratory distress. Pediatrics. 134 (6), 1160-1166 (2014).
  27. Leigh, M. W., et al. Standardizing nasal nitric oxide measurement as a test for primary ciliary dyskinesia. Annals of the American Thoracic Society. 10 (6), 574-581 (2013).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Pattern di battito ciliarecellule epiteliali respiratoriefrequenza di battito ciliaremicroscopia elettronicamicroscopia a immunofluorescenzamutazione DNAH11clearance mucociliareisolamento di cellule ciliate

Articoli correlati