In questo protocollo, viene descritto un modello di colite di trasferimento adottivo delle cellule T antigene-antigene specifico per l'intestino. Le cellule T CD4+ sono isolate da topi transgenici CBir1 TCR. Questi sono specifici per un antigene del microbiota intestinale immunodominante CBir1 flagellina, che viene trasferito nei topi Rag1-/- riceventi, portando all'infiammazione intestinale.
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Articolo metodologico
Induzione dell'infiammazione intestinale mediante trasferimento adottivo di cellule T CBir1 TCR transgeniche CD4 + a topi immunodeficienti
In questo articolo
Sommario
Abstract
Con l'aumento dell'incidenza, le malattie infiammatorie intestinali (IBD), che sono malattie croniche che colpiscono il tratto gastrointestinale, impongono un notevole onere sanitario e finanziario agli individui e alla società. Pertanto, è fondamentale studiare i meccanismi alla base della patogenesi e dello sviluppo dell'IBD. Qui, viene descritto un modello di colite da trasferimento delle cellule T antigene-antigene specifico del microbiota intestinale. La flagellina CBir1 è stata riconosciuta come l'antigene batterico intestinale immunodominante nella colite sperimentale e nei pazienti con malattia di Crohn. Le cellule T CBir1 TCR transgeniche naϊve CD4+ , specifiche per la flagellina CBir1, possono indurre la colite cronica dopo il trasferimento adottivo in topi Rag1-/- immunodeficienti. La gravità della malattia è valutata dall'istopatologia. Vengono anche determinati i fenotipi delle cellule T CD4+ nella lamina propria del colon. Questo modello assomiglia molto allo sviluppo dell'IBD, che fornisce un modello murino ideale per studiare i meccanismi che guidano la patogenesi dell'IBD e testare i potenziali farmaci per il trattamento dell'IBD.
Introduzione
Le malattie infiammatorie intestinali (IBD), tra cui principalmente il morbo di Crohn (CD) e la colite ulcerosa (UC), sono caratterizzate da infiammazione cronica, recidivante-remittente del tratto gastrointestinale, che colpisce milioni di persone in tutto il mondo1. Diversi fattori sono stati implicati nello sviluppo e nella patogenesi dell'IBD, tra cui la suscettibilità genetica, il microbiota intestinale, le risposte immunitarie, la dieta e lo stile di vita2. Tuttavia, l'esatto meccanismo di IBD non è ancora completamente compreso.
Uno degli interessi particolari è l'interazione tra il mic....
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Protocollo
Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite secondo il Comitato per l'uso e la cura degli animali dell'Università del Texas Medical Branch. I topi CBir1 TCR Tg sono stati forniti dal Dr. Charles Elson dell'Università dell'Alabama a Birmingham. I topi CBir1 TCR Tg possono essere femmine o maschi, ma dovrebbero essere a 8-12 settimane. I topi Rag1-/- sullo sfondo C57BL/6 sono stati ottenuti dal Jackson Laboratory10. I topi Rag1-/- devono essere abbinati al sesso e all'età, e possono essere usati maschi o femmine, ma dovrebbero essere a 8-12 settimane. L'intero protocollo è riassunto nella
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Risultati
Circa 5 x 106 cellule TG CBir1 TCR naϊve CD4+ per milza sono state isolate da un topo adulto CBir1 TCR Tg. Il trasferimento di cellule TN CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ ha indotto la colite cronica nei topi Rag1-/- riceventi. Dopo il trasferimento cellulare, i segni clinici sono stati monitorati per valutare la progressione dell'infiammazione intestinale, compresa la perdita di peso, la consistenza delle feci e la postura curva. Come previsto, i topi hanno iniziato a perdere .......
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Discussione
Sebbene ogni passaggio sia essenziale per la riproducibilità di questo modello di colite, ci sono diversi passaggi critici. I topi Rag-/- riceventi devono ricevere adeguate cellule T naϊve CD4+ vitali per indurre l'infiammazione intestinale. Abbiamo usato la milza per l'isolamento di cellule T CD4+ ingenue invece di MLN. Perché la resa delle cellule T CD4+ ingenue nelle MLN è molto più bassa che nella milza. CD62L è altamente espresso nelle cellule T naïve e CD44 e CD2.......
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Dichiarazioni
Nessun autore ha interessi finanziari, professionali o personali contrastanti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato in parte dalle sovvenzioni del National Institutes of Health DK125011, AI150210 e DK124132, dal premio STARs dell'Università del Texas System (Y.C.) e dal James W. McLaughlin Fellowship Fund della University of Texas Medical Branch di Galveston (W.Y.). La Figura 1 è stata creata con BioRender.com.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,22 µ m filtro monouso per flaconi a vuoto | MilliporeSigma | SCGPS05RE | |
| 100x Penicillina-Streptomicina | Corning | 30-002-CI | |
| 100-µ m colino | BD Biosciences | 352360 | |
| Pipetta di trasferimento da 3 ml | Fisherbrand | 13-711-9CM | |
| Anti-Mouse CD16/32 | Biolegend | 101302 | |
| Anti-Mouse CD25-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 102030 | |
| Anti-mouse CD3-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 100327 | |
| Anti-Mouse CD4 APC | Biolegend | ||
| Particelle magnetiche CD4 anti-topo | BD Biosciences | 551539 | |
| Anti-topo CD4-BV421 | Biolegend | 100544 | |
| Anti-topo CD62L-PE | Biolegend | 104408 | |
| Anti-topo Foxp3-PE | ThermoFisher | 12-5773-82 | |
| Anti-topo IFNγ-FITC | Biolegend | 505806 | |
| Anti-topo IL-17A-PE/Cy7 | Biolegend | 506922 | |
| Contatore cellulare automatizzato | Bio-rad | TC20 | |
| Brefeldin A | BD Biosciences | 555029 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
| C tubo | Miltenyi | 130-093-237 | |
| Magnete di separazione cellulare | BD Biosciences | 552311 | |
| Collagenasi IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Macchina dissociatrice | Miltenyi | 130-096-427 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | ||
| EDTA Corning | 46-034-CI | ||
| EDTA (0.5 M, PH 8.0) | Corning | 46-034-CI | |
| FBS | R& D Systems | S11550 | |
| Citometro a flusso | BD Biosciences | LSD Fortessa | |
| Lampada termica | CoverShield | BR40 | |
| Ematossilina ed eosina (H& E) Kit colorante | Abcam | ab245880 | |
| Siringhe da insulina | BD Biosciences | 329412 | |
| Ionomicina | ThermoFisher | I24222 | |
| Kit di colorazione per cellule morte vicino all'infrarosso fissabile vivo/morto | ThermoFisher | L10119 | |
| MaxQ 6000 Agitatori impilabili incubati/refrigerati | ThermoFisher | SHKE6000 | |
| NH4Cl | Thermo Scientific | A687-500 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Forbolo-12-miristato 13-acetato | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| RPMI 1640 Medium | Cytiva HyClone | SH3002702 | |
| Sorter | BD Biosciences | Arial Fusion | |
| Tissue Automatic Processor | ThermoFisher | STP120 | |
| Fisher Healthcare | 22048142 | ||
| Tris Base | Thermo Scientific | BP154-1 | |
| Set di tamponi per fattore di trascrizione nucleare vero (incluso tampone per la permanente) | Biolegend | 424401 |
Riferimenti
- Kaplan, G. G. The global burden of IBD: From 2015 to 2025. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (12), 720-727 (2015).
- Ananthakrishnan, A. N. Epidemiology and risk factors for IBD. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12
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Ristampe e permessi
