Il protocollo descrive il metodo di caricamento di un colorante di calcio fluorescente attraverso il nervo tagliato nei terminali nervosi motori del topo. Inoltre, viene presentato un metodo unico per registrare i transitori di calcio veloci nelle terminazioni nervose periferiche utilizzando la microscopia confocale.
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Articolo metodologico
Registrazione di transitori di calcio nella giunzione neuromuscolare di topo ad alta risoluzione temporale mediante microscopia confocale
In questo articolo
Sommario
Abstract
La stima del livello di calcio presinaptico è un compito chiave nello studio della trasmissione sinaptica poiché l'ingresso del calcio nella cellula presinaptica innesca una cascata di eventi che portano al rilascio di neurotrasmettitori. Inoltre, i cambiamenti nei livelli di calcio presinaptico mediano l'attività di molte proteine intracellulari e svolgono un ruolo importante nella plasticità sinaptica. Studiare la segnalazione del calcio è anche importante per trovare modi per trattare le malattie neurodegenerative. La giunzione neuromuscolare è un modello adatto per studiare la plasticità sinaptica, in quanto ha un solo tipo di neurotrasmettitore. Questo articolo descrive il metodo per caricare un colorante sensibile al calcio attraverso il fascio nervoso tagliato nelle terminazioni nervose motorie dei topi. Questo metodo consente la stima di tutti i parametri relativi alle variazioni intracellulari del calcio, come il livello basale di calcio e il calcio transitorio. Poiché l'afflusso di calcio dall'esterno cellulare nelle terminazioni nervose e il suo legame / slegamento al colorante sensibile al calcio avvengono nell'intervallo di pochi millisecondi, è necessario un sistema di imaging veloce per registrare questi eventi. In effetti, le telecamere ad alta velocità sono comunemente utilizzate per la registrazione di cambiamenti rapidi del calcio, ma hanno bassi parametri di risoluzione dell'immagine. Il protocollo qui presentato per la registrazione dei transitori di calcio consente una risoluzione spazio-temporale estremamente buona fornita dalla microscopia confocale.
Introduzione
Il problema di misurare le onde veloci di calcio nelle cellule eccitabili è uno degli aspetti più importanti e impegnativi dello studio della trasmissione del segnale nel sistema nervoso centrale e periferico. Gli ioni calcio svolgono un ruolo importante nell'innescare il rilascio di neurotrasmettitori, la plasticità sinaptica e la modulazione dell'attività di varie proteine intracellulari 1,2,3,4,5. Studiare la segnalazione del calcio è anche importante per trovare modi per trattare le malattie neurodegene....
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Protocollo
Sono stati condotti esperimenti su preparati nervo-muscolari isolati di levator auris longus (m. LAL) dai topi BALB/C (20-23 g, 2-3 mesi di età)41. Le procedure sperimentali sono state eseguite in conformità con le linee guida per l'uso di animali da laboratorio dell'Università Federale di Kazan e dell'Università di Medicina di Kazan, in conformità con la Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Il protocollo sperimentale ha soddisfatto i requisiti della direttiva 86/609/CEE del Consiglio delle Comunità europee ed è stato approvato dal Comitato Etico dell'Università di Medicina di Kazan.
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Risultati
Dopo aver caricato la preparazione con colorante secondo la tecnica presentata, la maggior parte delle sinapsi situate vicino al moncone nervoso aveva un livello sufficiente di fluorescenza (vedi Figura 2). Dopo aver caricato la preparazione con il colorante eapplicando il metodo descritto di registrazione e di elaborazione delle immagini, sono stati ottenuti transitori di calcio con la risoluzione spaziale e temporale desiderata (vedi Figura 4). Il calcio trans.......
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Discussione
Il metodo per caricare il colorante sensibile al Ca2+ nelle terminazioni nervose del topo attraverso il moncone nervoso e per registrare un transitorio di calcio veloce utilizzando un microscopio confocale è presentato in questo articolo. Come risultato dell'implementazione di questo metodo di carico, la maggior parte delle sinapsi situate vicino al moncone nervoso aveva un livello sufficiente di fluorescenza per consentire la registrazione dell'ingresso di calcio nelle terminazioni nervose in risposta alla st.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli studi sulla fluorescenza di questo lavoro sono stati condotti con il sostegno finanziario della Russian Science Foundation Grant (progetto n. 19-15-00329). Il metodo è stato sviluppato sotto finanziamento dell'incarico governativo per FRC Kazan Scientific Center di RAS АААА-А18-118022790083-9. La ricerca è stata sviluppata con l'uso delle attrezzature del Centro di ricerca federale "Kazan Scientific Center of RAS". Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Victor I. Ilyin per la lettura critica di questo manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Vetro capillare | Clark Strumenti elettromedicali, Regno Unito | GC150-10 | |
| Sistema di microscopio confocale e multifotone Leica TCS SP5 MP | Leica Microsystems , Heidelberg, Germania | ||
| Estrattore per micropipette fiammante/marrone P 97 | Sutter Instrument, USA | P-97 | |
| Regolatore di flusso | KD Medical GmbH Hospital Products, Germania | KD REG | Set di infusione monouso con regolatore di flusso |
| HEPES | Sigma-Aldrich, USA | H0887 | 100mL |
| Sistema di illuminazione Leica CLS 150X | Leica Microsystems, Germania | ||
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html | |
| Software Las AF | Leica Microsystems, Heidelberg, Germania | ||
| Software Las X | Leica Microsystems, Heidelberg, Germania | https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/ | |
| Supporto magnetico con tubo di aspirazione | BIOSCIENCE TOOLS, USA | MTH-S | |
| Microspin FV 2400 | Biosan, Lettonia | BS-010201-AAA | |
| Minutien Pins | Strumenti per la scienza fine, Canada | 26002-20 | |
| Multi-spin MSC 3000 | Biosan, Lettonia | BS-010205-AAN | |
| Oregon Green 488 BAPTA-1 sale pentapotassico | Sonde molecolari, USA | O6806 | 500 μ g |
| Pipetta | Biohit, Russia | 720210 | 0,5-10 &; L |
| Puntale per pipetta | Biohit, Russia | 781349 | 10 & micro; L |
| Plastilina | produttore | ||
| Aghi ipodermici monouso | Bbraun | 100 Sterican | 0,4&volte; Programma |
| per fogli di calcolo | Microsoft, USA | Microsoft Office Excel | |
| Stereomicroscopio, Leica M80 | Leica Microsystems , Germania | ||
| Elettrodo di aspirazione | Kazakov A. ELETTRODO DI ASPIRAZIONE SEMPLICE PER LA STIMOLAZIONE ELETTRICA DI OGGETTI BIOLOGICI / A. Kazakov, M. Alexandrov, N. V. Zhilyakov et al. // Rivista internazionale di ricerca. - 2015. - No. 9 (40) Parte 3. - P. 13-16. | http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-biologicheskix-obektov/ | |
| Sylgard 184 elastomero | Dow Corning, USA | ||
| Siringa | produttore | 0,5 mL | |
| Siringa | produttore | 60 mL |
Riferimenti
- Llinas, R., Steinberg, I. Z., Walton, K. Presynaptic calcium currents and their relation to synaptic transmission: voltage clamp study in squid giant synapse and theoretical model for the calcium gate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (8), 2918-2922 (1976).
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Ristampe e permessi
