Il presente lavoro descrive le fasi per la produzione di qPCR pronta all'uso per il rilevamento del DNA di T. cruzi che può essere precaricata sul recipiente di reazione e conservata in frigorifero per diversi mesi.
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Articolo metodologico
qPCR pronta all'uso per la rilevazione del DNA da Trypanosoma cruzi o altri organismi patogeni
In questo articolo
Sommario
Abstract
La PCR in tempo reale (qPCR) è una tecnica straordinariamente sensibile e precisa che consente di amplificare piccole quantità di bersagli di acidi nucleici da una moltitudine di campioni. È stato ampiamente utilizzato in molte aree di ricerca e ha raggiunto l'applicazione industriale in campi come la diagnostica umana e la selezione dei tratti nelle colture di colture di organismi geneticamente modificati (OGM). Tuttavia, la qPCR non è una tecnica a prova di errore. La miscelazione di tutti i reagenti in un'unica miscela master successivamente distribuita su 96 pozzetti di una normale piastra qPCR potrebbe portare a errori dell'operatore come una miscelazione errata dei reagenti o un'erogazione imprecisa nei pozzetti. Qui viene presentata una tecnica chiamata gelificazione, in base alla quale la maggior parte dell'acqua presente nella miscela master viene sostituita da reagenti che formano una miscela sol-gel quando viene sottoposta al vuoto. Di conseguenza, i reagenti qPCR vengono efficacemente conservati per alcune settimane a temperatura ambiente o alcuni mesi a 2-8 °C. I dettagli della preparazione di ciascuna soluzione sono mostrati qui insieme all'aspetto atteso di una reazione gelificata progettata per rilevare il DNA satellite di T. cruzi (satDNA). Una procedura simile può essere applicata per rilevare altri organismi. Avviare una qPCR gelificata è semplice come rimuovere la piastra dal frigorifero, aggiungere i campioni ai rispettivi pozzetti e iniziare la corsa, riducendo così il tempo di configurazione di una reazione a piastra intera al tempo necessario per caricare i campioni. Inoltre, le reazioni PCR gelificate possono essere prodotte e controllate per la qualità in lotti, risparmiando tempo ed evitando errori comuni dell'operatore durante l'esecuzione di reazioni PCR di routine.
Introduzione
La malattia di Chagas è stata scoperta all'inizio del 20° secolo nelle regioni rurali del Brasile, dove la povertà era diffusa 1,2. Ancora oggi, la malattia continua ad essere collegata ai determinanti sociali ed economici della salute nelle Americhe. La malattia di Chagas è bifasica, comprendente una fase acuta e una cronica. È causata dall'infezione da parte del parassita Trypanosoma cruzi, trasmessa da insetti vettori, trasfusioni di sangue per via congenita o ingestione orale di alimenti contaminati 3,4.
La diagnosi della malattia di Chagas può essere effettuata attraverso l'osservazione dei sintomi clinici (in particolare il segno di Romaña), la microscopia dello striscio di sangue, la sierologia e i test molecolari come la PCR in tempo reale (qPCR) o l'amplificazione isotermica 4,5,6,7,8,9. I sintomi clinici e la microscopia a striscio di sangue sono utilizzati nei casi sospetti di infezioni acute, mentre la ricerca di anticorpi viene utilizzata come strumento di screening nei pazienti asintomatici. A causa della sua sensibilità e specificità, la qPCR è stata suggerita per essere utilizzata come strumento di monitoraggio per i pazienti cronici, per i pazienti acuti sottoposti a trattamento che misura il carico parassitario nel sangue e come marker surrogato di fallimento terapeutico 6,8,10,11,12 . Sebbene più sensibile e specifico dei test attualmente disponibili, la qPCR è effettivamente impedita di essere conosciuta come strumento diagnostico nelle regioni svantaggiate di tutto il mondo a causa della necessità di temperature di congelamento per il trasporto e lo stoccaggio13,14,15.
Per aggirare questo ostacolo, sono state esplorate tecniche di conservazione come la liofilizzazione e la gelificazione16,17. Mentre la liofilizzazione fornisce la conservazione per anni, richiede reagenti appositamente realizzati senza la presenza di glicerolo, che è comunemente usato per la stabilizzazione / conservazione degli enzimi18. Mentre la gelificazione ha dimostrato di fornire conservazione per mesi, consente l'uso di reagenti regolari19. La soluzione di gelificazione comprende quattro componenti, ciascuno con ruoli specifici nel processo: gli zuccheri trealosio e melezitosio proteggono le biomolecole durante il processo di essiccazione riducendo le molecole di acqua libera nella soluzione, il glicogeno produce una matrice protettiva più ampia e l'amminoacido lisina viene utilizzato come scavenger dei radicali liberi per inibire le reazioni ossidanti tra il carbossile della biomolecola, gruppi amminico e fosfato. Questi componenti definiscono una miscela sol-gel che impedisce la perdita della struttura terziaria o quaternaria durante il processo di essiccazione, contribuendo così a mantenere l'attività delle biomolecole dopo la reidratazione19. Una volta stabilizzate all'interno delle provette di reazione, le reazioni possono essere conservate per alcuni mesi a 2-8 °C o alcune settimane a 21-23 °C invece dei normali -20 °C. Questo approccio è già stato incorporato in test progettati per aiutare a diagnosticare malattie come la malattia di Chagas, la malaria, la leishmaniosi, la tubercolosi e la ciclosporiasi13,14,15,20.
Il presente lavoro descrive tutte le fasi per preparare le soluzioni richieste per la procedura di gelificazione, le insidie del processo e l'aspetto finale previsto di una qPCR gelificata pronta all'uso all'interno di strisce a otto tubi. Lo stesso protocollo può essere adattato per tubi singoli o piastre a 96 pozzetti. Infine, la rilevazione del DNA di T. cruzi sarà mostrata come una corsa di controllo.
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Protocollo
1. Preparazione di soluzioni madre e miscela di gelificazione
NOTA: Saranno preparate quattro soluzioni madre (400 mg/ml di melezitosio, 400 mg/ml di trealosio, 0,75 mg/ml di lisina e 200 mg/ml di glicogeno) e miscelate secondo la proporzione indicata nella tabella 1 per ottenere la miscela di gelificazione. Sebbene il protocollo descriva 10 ml di produzione di soluzioni stock, può essere adattato per volumi inferiori o superiori.
- Soluzione di melezitosio
- Pesare 4 g di melezitosio in un tubo di plastica da 15 ml, aggiungere 6 ml di acqua priva di nucleasi e vortice alla massima velocità dello strumento fino a solubilizzare la polvere.
NOTA: Si può aggiungere più acqua per facilitare la solubilizzazione, facendo attenzione a non superare il volume finale (vedi sotto). - Portare il volume finale a 10 mL con acqua priva di nucleasi. Etichettare e conservare a 2-8 °C per un massimo di 6 mesi.
- Pesare 4 g di melezitosio in un tubo di plastica da 15 ml, aggiungere 6 ml di acqua priva di nucleasi e vortice alla massima velocità dello strumento fino a solubilizzare la polvere.
- Soluzione di trealosio
- Pesare 4 g di trealosio in un tubo di plastica da 15 ml, aggiungere 6 ml di acqua priva di nucleasi e vortice alla velocità massima dello strumento fino a solubilizzazione della polvere.
NOTA: Si può aggiungere più acqua per facilitare la solubilizzazione, facendo attenzione a non superare il volume finale (vedi sotto). - Portare il volume a 10 mL con acqua priva di nucleasi e filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,2 μm. Etichettare e conservare a 2-8 °C per un massimo di 6 mesi.
- Pesare 4 g di trealosio in un tubo di plastica da 15 ml, aggiungere 6 ml di acqua priva di nucleasi e vortice alla velocità massima dello strumento fino a solubilizzazione della polvere.
- Soluzione di glicogeno
- Pesare 2 g di glicogeno in un tubo di plastica da 15 ml, aggiungere 6 ml di acqua priva di nucleasi e vortice alla velocità massima dello strumento fino a quando la polvere non è solubilizzata.
NOTA: Si può aggiungere più acqua per facilitare la solubilizzazione, facendo attenzione a non superare il volume finale (vedi sotto). - Mantenere la soluzione a riposo a 2-8 °C per 8-12 ore perché la solubilizzazione del glicogeno produce molte bolle (Figura 1). Portare il volume a 10 ml con acqua priva di nucleasi. Etichettare e conservare a 2-8 °C per un massimo di 6 mesi.
- Pesare 2 g di glicogeno in un tubo di plastica da 15 ml, aggiungere 6 ml di acqua priva di nucleasi e vortice alla velocità massima dello strumento fino a quando la polvere non è solubilizzata.
- Soluzione di lisina
- Pesare 7,5 mg di lisina in un tubo di plastica da 15 ml, aggiungere 6 ml di acqua senza nucleasi. Vortice alla massima velocità dello strumento fino a quando la polvere non è solubilizzata.
NOTA: Si può aggiungere più acqua per facilitare la solubilizzazione, facendo attenzione a non superare il volume finale (vedi sotto). - Portare il volume a 10 mL con acqua priva di nucleasi e filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,2 μm. Trasferire la soluzione in un matraccio ambrato o proteggerlo dalla luce. Etichettare e conservare a 2-8 °C per un massimo di 6 mesi.
- Pesare 7,5 mg di lisina in un tubo di plastica da 15 ml, aggiungere 6 ml di acqua senza nucleasi. Vortice alla massima velocità dello strumento fino a quando la polvere non è solubilizzata.
- Miscela di gelificazione (GM)
- In un tubo di plastica da 50 ml, mescolare i volumi delle soluzioni madre secondo la Tabella 1.
- Mescolare i reagenti mediante dieci inversioni end-to-end del tubo.
NOTA: non è necessaria una fase di filtrazione se questa fase viene eseguita in una cappa di sicurezza a flusso laminare. Se questo passaggio non viene eseguito in un ambiente pulito, filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,2 μm prima di trasferirla in un matraccio ambrato. - Trasferire la soluzione in un matraccio ambrato o proteggerlo dalla luce. Etichettare e conservare a 2-8 °C per un massimo di 3 mesi.
NOTA: come fase di controllo qualità per la preparazione della miscela di gelificazione, assicurarsi che i valori misurati di pH, conducibilità e densità rientrino nei seguenti intervalli: pH 5,55-6,66; conducibilità 0,630-0,757 mS/cm; e densità 1,08-1,11 g/cm3. Tutte le misurazioni devono essere effettuate a 25 °C.
2. Preparazione della miscela master qPCR per la gelificazione
NOTA: In questa fase, viene preparata la miscela master qPCR per la gelificazione. Quindi, l'acqua non viene aggiunta alla miscela, ma viene aggiunta la miscela di gelificazione (Tabella 2).
- Scongelare i reagenti in un contenitore refrigerato. Mescolare i reagenti in una provetta da 1,5 mL secondo la Tabella 2. Un esempio di reazione con un volume finale di 25 μL contenente 5 μL di campione di DNA è mostrato qui.
NOTA: il campione di DNA non viene aggiunto alla miscela in questa fase; qui viene utilizzato esclusivamente per calcolare i volumi finali di ciascun reagente della miscela master qPCR. I campioni di DNA devono essere aggiunti subito prima di iniziare la corsa (vedere il passaggio 4 di seguito).
3. Gelificazione dei reagenti sui recipienti di reazione
- Moltiplicare opportunamente i volumi indicati nella tabella 2 per la preparazione di una striscia di otto tubi o di una piastra da 96 pozzetti.
- Pipet 18,5 μL della miscela master di gelificazione mostrata nella Tabella 2 su ciascun pozzetto di reazione.
NOTA: Questo volume rappresenta i volumi di miscela oligonucleotidica, tampone PCR e miscela di gelificazione utilizzati per una reazione (secondo la Tabella 2) e varierà a seconda della concentrazione dei reagenti e del volume necessario per una reazione. Il volume finale nella miscela master di gelificazione è diverso dal volume in una miscela master normale perché non viene aggiunta acqua. - Posizionare i tubi/piastre nel supporto termoconduttivo (ad esempio, alluminio) all'interno del forno sottovuoto.
NOTA: Il supporto termoconduttivo è opzionale. L'operatore deve assicurarsi che il fondo dei tubi sia a contatto con il ripiano del forno a vuoto per consentire un rapido equilibrio termico. - Posizionare un sacchetto di argilla bentonitica ogni due piastre da 96 pozzetti.
NOTA: I sacchetti di argilla bentonitica vengono utilizzati per assorbire l'acqua rimossa dalla miscela master di gelificazione dalla pressione differenziale esercitata dal vuoto. I sacchi di argilla di bentonite sono risultati non necessari per meno di due piastre da 96 pozzetti. - Sottoporre i tubi/piastra contenenti la miscela master di gelificazione a tre cicli di vuoto (30 ± 5 mBar) di 30 min ciascuno, alternati al rilascio del vuoto fino al raggiungimento della pressione atmosferica (900-930 mBar), a temperatura controllata (30 °C ± 1 °C) (Figura 2).
NOTA: Lo strumento utilizza un software per controllare i parametri e un esempio del ciclo è mostrato nella Figura 2. L'utente deve creare il profilo per l'esecuzione, indicando i parametri scelti. - Al termine del ciclo, controllare i provette/piastre per una corretta gelificazione dei reagenti assicurandosi che il volume sia visibilmente ridotto (Figura 3) e che i liquidi non si muovano picchiettando i tubi/piastre con le dita.
NOTA: se la gelificazione non si verifica, la soluzione schizza sulle pareti del tubo quando i tubi vengono toccati (Figura 3). - Sigillare e conservare i tubi/piastre a 2-8 °C per 8-12 ore prima dell'uso.
4. Utilizzo di una qPCR gelificata
- Rimuovere la striscia tubiera o la piastra dal frigorifero e aprirla in una workstation per la manipolazione del campione. Aggiungere 15 μL di acqua esente da nucleasi a ciascun recipiente di reazione.
NOTA: Il volume dei reagenti gelificati è considerato di circa 5 μL. Quindi, insieme al volume del campione di DNA (vedi sotto), il volume finale di reazione è di 25 μL. - Aggiungere 5 μL di campione di DNA.
NOTA: È possibile utilizzare qualsiasi modello di DNA di qualità qPCR. Nel presente lavoro, il DNA è stato estratto da 108epimastigoti di T. cruzi (ceppo Dm28c) ed è stato diluito in serie con un rapporto 1:10 utilizzando tampone TE. - Sigillare i tubi/piastre e procedere all'apparecchiatura scelta. Esegui l'esperimento e procedi all'analisi regolare dei dati.
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Risultati
Tre dei reagenti che formano la miscela di gelificazione sono facilmente solubilizzati dopo un vigoroso vortice. Tuttavia, il glicogeno richiede un attento vortice per garantire che la polvere sia stata completamente solubilizzata. Sfortunatamente, il vortice vigoroso produce molte bolle, il che rende difficile determinare il volume effettivo della soluzione (Figura 1A-B). Pertanto, è essenziale lasciare riposare la soluzione di glicogeno nel frigorifero fin...
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Discussione
Gli ultimi anni hanno evidenziato la necessità di trovare tecnologie più sensibili e specifiche per aiutare a diagnosticare le malattie tropicali e trascurate. Sebbene importanti per il controllo epidemiologico, i test parassitologici (microscopia ottica) e sierologici hanno dei limiti, soprattutto per quanto riguarda la sensibilità e l'applicabilità al punto di cura. Le tecniche di amplificazione del DNA come la PCR, l'amplificazione isotermica e le rispettive variazioni sono state a lungo utilizzate in ambienti di labo...
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano esprimere la loro gratitudine ad Aline Burda Farias per l'assistenza tecnica con il forno a vuoto, nonché all'amministrazione dell'Instituto de Biologia Molecular do Parana (IBMP, Curitiba, Brasile) per aver permesso l'accesso a tali apparecchiature. Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dalla sovvenzione CNPq 445954/2020-5.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sacchi di argilla bentonitica (attivato) | Embamat Global Packaging Solutions (Barcellona, Spagna) | 026157/STD | Da non confondere con gli impacchi di gel di silice |
| Glicogeno | Amersham Bioscience | Cat# US16445 | |
| Lisina | Acros Organic | Cat# 365650250 | |
| Melezitoze | Sigma-Aldrich | Cat# 63620 | |
| Acqua | priva di nucleasifornitore | ||
| Oligonucleotidi | fornitore | ||
| PCR mastermix | fornitore preferito o Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP, Curitiba, Brasile) | Chagas NAT kit | |
| PCR termociclatore | software fornitore preferito | ||
| per forno a vuoto | Memmert Gmbh | Celsius v10.0 | |
| Trehalose | Sigma-Aldrich | Cat# T9531 | |
| Trypanosoma cruzi DNA | da parassiti coltivati internamente, o acquistato da fornitori accreditati come ATCC | ||
| Forno a vuoto | Memmert Gmbh | VO-400 |
Riferimenti
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