Articolo metodologico
L'imaging cellulare del calcio è una metodologia versatile per studiare la segnalazione dinamica di singole cellule, su popolazioni miste in coltura o anche su animali risvegliati, basata sull'espressione di canali/recettori permeabili al calcio che danno firme funzionali uniche.
Qui, riportiamo modelli selettivi in vitro di circuiti basati su glia (astrociti, oligodendrociti e microglia) e / o neuroni da tessuti periferici (gangli della radice dorsale) e centrali (corteccia, zona subventricolare, organoide) che sono dinamicamente studiati in termini di spostamenti di calcio. Il modello scelto per illustrare i risultati è la retina, un tessuto semplice con complesse interazioni cellulari. Il calcio è un messaggero universale coinvolto nella maggior parte dei ruoli cellulari importanti. Spieghiamo in un protocollo passo-passo come le cellule neuronali-gliali retiniche in coltura possono essere preparate e valutate, immaginando spostamenti di calcio. In questo modello, differenziamo i neuroni dalla glia in base alla loro risposta selettiva a KCl e ATP. I recettori e i canali permeabili al calcio sono espressi selettivamente in diversi compartimenti. Per analizzare le risposte al calcio, utilizziamo stampi fluorescenti raziometrici come Fura-2. Questa sonda quantifica la concentrazione libera di Ca2+ in base alle forme Ca2+-free e Ca2+-bound, presentando due diversi picchi, fondati sull'intensità di fluorescenza percepita su due lunghezze d'onda.
A causa delle proprietà universali del calcio come secondo messaggero, questo ione è coinvolto in un vasto numero di attività di segnalazione: trascrizione genica, nascita e morte, proliferazione, migrazione e differenziazione, trasmissione sinaptica e plasticità. Quindi, un metodo in grado di tracciare le dinamiche di attivazione del calcio con fedeltà e agilità fornirebbe un modo per osservare risposte spazio-temporali uniche. Tale metodo è la tecnica di imaging del calcio cellulare, che correla i dati funzionali degli spostamenti del calcio con fenotipi cellulari specifici in base alle loro risposte distinte.
Le sonde Ca2+ son....
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Tutti gli esperimenti che coinvolgono animali sono stati approvati e condotti seguendo le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università Federale di Rio de Janeiro, seguendo i "Principi di cura degli animali da laboratorio" (NIH, Bethesda, USA); numero di permesso IBCCF-035 per uova di gallina Livorno Bianca fecondate.
1. Preparazione delle soluzioni
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Qui, abbiamo usato le cellule della retina in coltura dai pulcini embrionali del giorno 8 per studiare come i neuroni e la glia segnalano in termini di spostamenti di calcio. Le colture sono state preparate essenzialmente come descritto15,19 come cellule miste neurone-gliali (ad una densità di ≥ 1 x 106 cellula/piatto) in una fase di 7 giorni in vitro (Figura 1A). In alternativa, cellule neuronali arricchite preparate in c.......
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Abbiamo usato il tessuto retinico per dimostrare che le risposte calciche mediate da KCl o ATP sono chiaramente compartimentate in risposte neuronali e gliali, rispettivamente (Figura 1). Sebbene alcuni dati in letteratura implichino che i recettori P2X7 siano espressi in neuroni, che regolano l'attività neuronale e il rilascio di neurotrasmettitori sinaptici20, altri autori mettono in dubbio l'esistenza di recettori P2X7 neuronali. In effetti, i risultati attuali sos.......
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Sovvenzioni, sponsor e fonti di finanziamento: MH è destinatario di una borsa di studio CNPq di dottorato. HRF è destinatario di una borsa di studio postdoc supportata da CNPq (numero di sovvenzione HRF 152071/2020-2). RAMR è supportato da CNPq e FAPERJ (numeri di sovvenzione E-26/202.668/2018, E-26/010.002215/2019, 426342/2018-6 e 312157/2016-9 e INCT-INNT (Istituto Nazionale di Neuroscienze Traslazionali).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Vetrino coprioggetti da 15 mm | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 111550 | Supporto cella |
| 510 nm filtro passa-lungo | Carl Zeiss | ||
| ATP | Sigma | A1852 | |
| B-27 Supplemento | Gibco | 17504044 | Complemento |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| CoolSNAP digitale fotocamera | Roper Scientific, Trenton, NJ | ||
| D-(+)-Glucosio | Neon | 1466 | |
| DMEM/ F-12 | Gibco | 12400-24 | Terreno di coltura cellulare |
| Software Excel Siero | |||
| Sigma-Aldrich | F9665 | Microscopio | |
| fluorescenza | Axiovert 200; Carl Zeiss | B 40-080 | |
| Fura-2 AM | Sonde molecolari | F1221 | Indicatore raziometrico Ca2+ |
| Gentamicina solfato | Calbiochem | 1405-41-0 | antibiotici |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Lambda Apparecchio DG-4 | Sutter Instrument, Novato, CA | DG-4PLUS/OF30 | |
| Laminin | Gibco | 23017-015 | Aiuta l'adesione cellulare |
| Software Metafluor | Universal Imaging Corp. West Chester, PA | ||
| MgCl2 | Sigma | M4880 | |
| Na2HPO4 | Vetec | 129 | |
| NaCl | Isofar | 310 | |
| NaHCO3 | Vetec | 306 | |
| PH3 | Warner Intruments, Hamden, CT | 64-0286 | |
| Pluronic F-127 | Sonde molecolari | P6866 | non ionico, tensioattivo |
| Poli-L-lisina | Sigma-Aldrich | P8920 | Aiuta l'adesione cellulare |
| Tripsina-EDTA 0,25% | Enzima di dissociazione | Gibco | 25200056 |
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