Approccio chirurgico stereotassico per microiniettare il tronco encefalico caudale e il midollo spinale cervicale superiore tramite la Cisterna Magna nei topi

La chirurgia stereotassica standard per colpire i siti cerebrali nei topi¹ comporta comunemente la fissazione del cranio utilizzando una serie di barre auricolari e una barra della bocca. Le coordinate vengono quindi stimate in base agli atlanti^{di riferimento 2,3} e ai punti di riferimento del cranio, vale a dire, bregma (il punto in cui le suture delle ossa frontali e parietali si uniscono) o lambda (il punto in cui le suture delle ossa parietale e occipitale si uniscono; Figura 1A,B). Attraverso un foro di bava nel cranio sopra il bersaglio stimato, la regione target può quindi essere raggiunta, sia per la consegna di microiniezioni che per la strumentazione con cannule o fibre ottiche. A causa della variazione nell'anatomia di queste suture e degli errori nella localizzazione di bregma o lambda ^4,5, la posizione dei punti zero in relazione al cervello varia da animale ad animale. Mentre piccoli errori nel targeting, che derivano da questa variabilità, non sono un problema per bersagli grandi o vicini, il loro impatto è maggiore per aree di interesse più piccole che sono lontane dai punti zero nei piani anteroposterior o dorsoventral e / o quando si studiano animali di dimensioni variabili a causa dell'età, della tensione e / o del sesso. Ci sono diverse sfide aggiuntive che sono uniche per il midollo allungato e il cordone cervicale superiore. In primo luogo, piccoli cambiamenti nelle coordinate anteroposteriore sono associati a cambiamenti significativi nelle coordinate dorsoventrali rispetto alla dura, a causa della posizione e della forma del cervelletto (Figura 1Bi)^2,6,7. In secondo luogo, il cordone cervicale superiore non è contenuto all'interno del cranio². In terzo luogo, la posizione obliqua dell'osso occipitale e lo strato sovrastante dei muscoli del collo² rendono l'approccio stereotassico standard ancora più impegnativo per le strutture situate vicino alla transizione tra il tronco cerebrale e il midollo spinale (Figura 1Bi). Infine, molti bersagli di interesse nel tronco cerebrale caudale e nel midollo cervicale sono piccoli², che richiedono iniezioni precise e riproducibili ^8,9.

Un approccio alternativo attraverso la cisterna magna aggira questi problemi. La cisterna magna è un grande spazio che si estende dall'osso occipitale all'atlante (Figura 1A, cioè il secondo osso vertebrale)¹⁰. È riempito con liquido cerebrospinale e coperto da dura madre¹⁰. Questo spazio tra l'osso occipitale e l'atlante si apre quando si anterofisce la testa. È possibile accedervi navigando tra le pance accoppiate sovrastanti del muscolo longus capitis, esponendo la superficie dorsale del tronco cerebrale caudale. Le regioni di interesse possono quindi essere prese di mira in base ai punti di riferimento di queste regioni stesse se si trovano vicino alla superficie dorsale; o usando l'obex, il punto in cui il canale centrale si apre nel ventricolo IV, come punto zero per le coordinate per raggiungere strutture più profonde. Questo approccio è stato utilizzato con successo in una varietà di specie, tra cui il ratto¹¹, il gatto¹², il topo ^8,9 e il primate non umano¹³ per colpire il gruppo respiratorio ventrale, la formazione reticolare mediale midollare, il nucleo del tratto solitario, l'area postrema o il nucleo ipoglosso. Tuttavia, questo approccio non è ampiamente utilizzato in quanto richiede conoscenze di anatomia, un toolkit specializzato e competenze chirurgiche più avanzate rispetto all'approccio stereotassico standard.

Qui descriviamo un approccio chirurgico passo-passo per raggiungere il tronco cerebrale e il cordone cervicale superiore attraverso la cisterna magna, visualizzare i punti di riferimento, impostare il punto zero (Figura 2) e stimare e ottimizzare le coordinate target per la consegna stereotassica di microiniezioni nelle regioni discrete del tronco cerebrale e del midollo spinale di interesse (Figura 3). Discutiamo quindi i vantaggi e gli svantaggi legati a questo approccio.

L'autore dichiara che il protocollo segue le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso il Beth Israel Deaconess Medical Center.

1. Preparazione di strumenti chirurgici e telaio stereotassico

NOTA: L'intervento viene eseguito in condizioni asettiche. La sterilità viene mantenuta utilizzando la tecnica della punta sterile.

1. Installare il braccio stereotassico con una micropipetta o una siringa riempita con un iniettabile di scelta (virus adeno-associato (AAV) o tracciante convenzionale) sul telaio stereotassico e preparare l'adattatore per mouse (Figura 2A).
2. Preparare strumenti chirurgici autoclavati (Tabella dei materiali) e posizionarli su una superficie sterile.

2. Induzione dell'anestesia e preparazione del topo

1. Accendere O₂ a 0,5 L/min e impostare il vaporizzatore isoflurano a 4.0, assicurandosi che il flusso di O₂ sia alla scatola di induzione.
   ATTENZIONE: Assicurarsi che la scatola di induzione dell'isoflurano sia collocata in un cappuccio e che l'isoflurano sia rimosso dal sito chirurgico.
2. Posizionare il mouse (maschio di 10 settimane C57BL/6J) nella camera di induzione.
3. Una volta che la respirazione è rallentata, aprire la camera di induzione e sollevare leggermente il mouse. Usa i tagliacapelli per rimuovere i peli dalla testa alle spalle.

3. Posizionamento del mouse nel frame stereotassico

1. Spostare il mouse sulla cornice stereotassica e posizionare il naso in un cono nasale flessibile. In questa fase, assicurarsi che il flusso di O₂ sia ora diretto al cono del naso.
2. Posizionare il mouse nella cornice stereotassica utilizzando solo le barre auricolari.
   NOTA: Assicurarsi che le barre auricolari siano uniformi e che la testa sia in piano.
3. Anteroflex la testa del mouse ad un angolo di 90° guidando manualmente il naso. Per fissare questa posizione, posizionare una barriera di plastica tra i montanti del padiglione auricolare dell'adattatore del mouse, parallelamente ai pilastri. La parte piatta del cranio funge da riferimento, simile all'approccio del cranio piatto nella chirurgia stereotassica convenzionale.
   NOTA: Non flettere eccessivamente la testa (cioè oltre un angolo di 90° tra il piano dell'osso cranico frontale e il piano della superficie del tavolo) in quanto ciò impedisce il flusso d'aria attraverso le vie aeree superiori. Se il flusso d'aria è ostacolato, riposizionare il mouse, assicurandosi che il corpo sia supportato sotto il tronco e che una carta di plastica sia posizionata a 90 ° tra il piano dell'osso cranico frontale e il piano della superficie del tavolo come indicato nella Figura 2A, C.
4. Posizionare la piastra riscaldante sotto il mouse, quindi assicurarsi che il collo e il resto del corpo siano posizionati allo stesso livello (cioè a circa 180 ° o parallelamente al tavolo). La cassetta degli attrezzi che contiene le forbici a molla può essere utilizzata per sollevare il corpo in questa posizione.
   NOTA: Questo passaggio è importante in quanto il tronco cerebrale caudale e il cordone cervicale superiore si muovono a seconda della posizione, in contrasto con più parti rostrali del SNC che sono tenute in posizione dal cranio.
5. Iniettare una singola dose di 4 mg/kg di Meloxicam a lento rilascio (SR) per via sottocutanea (s.c.) ad un volume di 2 μL/g di peso corporeo e posizionare il lubrificante sugli occhi.
6. Pulire prima il sito di incisione chirurgica con un tampone di preparazione all'alcol al 70%, poi con un tampone di preparazione betadine, e poi di nuovo con un tampone di preparazione dell'alcol e lasciare asciugare.
7. Posiziona un drappo sotto il corpo.
8. Disinfettare le mani e indossare guanti sterili.
9. Posizionare un drappo nel sito chirurgico.

4. Chirurgia per accedere alla cisterna magna

1. Assicurarsi che il mouse sia opportunamente anestetizzato pizzicando le dita dei piedi o controllando il riflesso corneale.
2. Ridurre l'isoflurano a livelli di manutenzione (2.0).
3. Fai un'incisione di 1-1,2 cm con la lama chirurgica #10 dal bordo dell'osso occipitale verso le spalle in un movimento regolare.
4. Fai un'incisione nel rafe della linea mediana del muscolo trapezio. Questo espone i muscoli longus capitis accoppiati.
   NOTA: Nei topi, il muscolo trapezio è un muscolo molto sottile, quasi trasparente. Assicurati di rimanere nella linea mediana e non tagliare i muscoli sottostanti in quanto ciò causerà sanguinamento inutile.
5. Posiziona entrambi i ganci di riavvolgimento tra i muscoli longus capitis accoppiati, uno orientato a sinistra e l'altro a destra. Il peso degli emostati fornisce tensione ai ganci di riavvolgimento che possono essere modificati regolando nuovamente la posizione degli emostati.
6. Posizionare il microscopio chirurgico in posizione per visualizzare meglio il campo chirurgico.
7. Utilizzare la pinza smussata per laminectomia per separare il ventre sinistro e destro del muscolo longus capitis accoppiato, a partire dall'occipite, dove la linea mediana è facilmente visibile. Guida la pinza smussata attraverso l'osso dell'occipite nella linea mediana fino a dove incontra la dura madre cisternale, quindi continua attraverso la dura madre fino all'atlante.
   NOTA: Non è necessario tagliare i muscoli longus capitis accoppiati poiché nulla li tiene insieme nella linea mediana; in questo modo causerà sanguinamento inutile.
8. Riposizionare i riavvolgitori e regolare la tensione riposizionando gli emostati, aprendo la vista della cisterna magna.
9. Utilizzare la pinza di laminectomia smussata per separare ulteriormente i muscoli nella linea mediana per ottenere una buona finestra di visualizzazione del tronco cerebrale e del cervelletto.
10. Ripetere i passaggi 4.7-4.9 secondo necessità fino a quando il cervelletto e il tronco cerebrale vengono visualizzati sotto la dura.
11. Usando una pinza per laminectomia smussata, liberare la dura dei piccoli fili di tessuto connettivo spostando la pinza dalla linea mediana in direzione laterale, fino a quando non vi è una visione chiara del tronco cerebrale e creare più spazio laterale, se necessario per il bersaglio.

5. Apertura della membrana cisternale

1. Usa la pinza Dumont angolata (#4/45) per afferrare la dura, che si estende dall'osso occipitale all'atlante. Afferrare la dura vicino all'osso occipitale e utilizzare le forbici a molla per creare una piccola apertura (~ 0,5 a 1,5 mm) nella dura.
   NOTA: In questa posizione rostrale, lo spazio tra il tronco cerebrale e la dura sovrastante è più ampio, fornendo ampio spazio per la manipolazione sicura della dura.
2. Utilizzare le forbici a molla per sollevare la dura e aprire ulteriormente la dura. La dimensione della finestra dipende dalla destinazione.
   NOTA: Sarà necessaria una finestra più grande quando si effettuano iniezioni longitudinali multiple o iniezioni bilaterali; una piccola finestra sarà sufficiente quando si effettuano iniezioni unilaterali o intermedie singole.
3. Una volta aperta la dura, drenare il liquido cerebrospinale in eccesso con una punta sterile.

6. Identificazione dei punti di riferimento e del punto zero

1. Visualizza la superficie dorsale del tronco cerebrale con punti di riferimento dettagliati attraverso la dura aperta. L'obex, il punto in cui il canale centrale si apre nel ventricolo IV, è il punto zero anteriore-posteriore e mediolaterale standard.

7. Coordinate target

NOTA: Per vari target, abbiamo incluso un elenco di coordinate standard con coordinate anteriori posteriori (AP) e mediolaterali (ML) relative alle coordinate bregma e cisterna magna a punto zero con coordinate AP e ML relative all'obex a punto zero per facilitare la transizione tra le metodologie (Tabella 1). Le coordinate dorsoventrali (DV) sono relative alla superficie del cervello o del cervelletto (approccio standard) o alla superficie del tronco cerebrale o del cordone cervicale superiore (approccio cisterna magna) nel punto di ingresso AP e ML. La pianificazione dovrebbe essere fatta prima dell'intervento chirurgico.

1. Utilizzare i tre set di coordinate per determinare la destinazione: AP, ML e DV. A causa della posizione della testa, l'orientamento relativo delle strutture del tronco cerebrale varia in base alla posizione.
   1. Per la distanza target >0,4 mm dall'ombelico all'obex (Figura 1B, verde) eseguire le seguenti operazioni.
      1. AP: Utilizzare qualsiasi atlante di riferimento stereotassico standard (ad esempio, Paxinos e Franklin atlas²) o serie di tessuti tagliati nel piano trasversale per stimare la distanza AP tra obex e il bersaglio.
      2. ML: Utilizzare qualsiasi atlante di riferimento stereotassico standard o serie di tessuti tagliati nel piano trasversale per stimare la distanza ML tra obex e il bersaglio.
      3. DV: Stimare le coordinate relative alla superficie del cervello o del cervelletto nel punto target AP e ML. Utilizzare qualsiasi atlante di riferimento stereotassico standard o serie di tessuti tagliati nel piano trasversale per stimare la distanza tra la superficie del tronco cerebrale alle coordinate AP e ML desiderate e il bersaglio.
   2. Per la distanza target <0,4 mm dall'caudale all'obex (Figura 1B, arancione) eseguire quanto segue.
      1. AP: Regola le coordinate per tenere conto dell'anteroflessione del tronco cerebrale. Per le coordinate ventrali e rostrali, il punto di ingresso del tronco cerebrale AP sarà più caudale rispetto alla coordinata AP target nel piano standard.
      2. ML: Derivare le coordinate target da un atlante di riferimento stereotassico standard o da una serie di tessuti tagliati nel piano trasversale. Le coordinate saranno relative alla linea mediana visualizzata a livello di AP di destinazione.
      3. DV: Stimare le coordinate relative alla superficie del tronco cerebrale nel punto target AP e ML. Regola DV per tenere conto dell'anteroflessione del tronco cerebrale. Per le coordinate ventrali e rostrali, le coordinate DV saranno maggiori della distanza dalla superficie dorsale del tronco cerebrale nel piano standard.

8. Iniezione del bersaglio

1. Abbassare la pipetta o la siringa sul bersaglio utilizzando il braccio stereotassico e iniettare la soluzione come per gli approcci stereotassici standard. Lasciare in posa per 1-5 minuti dopo l'iniezione, per evitare una traccia dell'ago quando si utilizzano volumi compresi tra 3-50 nL. Quindi, sollevare la pipetta o la siringa utilizzando il braccio stereotassico.
2. Ripetere il passaggio 8.1. per obiettivi multipli.

9. Chiusura del campo chirurgico

1. Rimuovere i ganci con attenzione dal campo chirurgico. I muscoli longus capitis accoppiati ricadranno in una posizione neutra, coprendo completamente la cisterna magna. Non chiudere il muscolo trapezio e la dura madre nella linea mediana in quanto sono troppo fragili per contenere le suture.
2. Chiudere la pelle con tre punti di sutura in nylon o polipropilene (5-0 o 6-0).

10. Assistenza post-operatoria

1. Spegnere l'isoflurano e rimuovere il mouse dalla cornice stereotassica. Metti il mouse in una gabbia pulita su una piastra riscaldante e osserva fino a quando non sei sveglio e in movimento.
2. Monitorare lo stato di salute, il peso e le suture nei giorni post-operatori 1-3. Rimuovere le suture il giorno 10 se non sono già state rimosse.

L'approccio cisterna magna consente di colpire il tronco cerebrale caudale e le strutture del cordone cervicale superiore che sono altrimenti difficili da raggiungere tramite approcci stereotassici standard o sono inclini a targeting incoerente. L'intervento chirurgico per raggiungere la cisterna magna richiede incisioni della pelle, un sottile strato di muscolo trapezio e l'apertura della dura madre ed è quindi ben tollerato dai topi. È particolarmente efficiente e meno invasivo quando si prendono di mira più siti (dispersi longitudinalmente o bilaterali), in quanto non richiede la perforazione di più fori di bava come negli approcci stereotasssici standard. Nei topi, abbiamo regolarmente mirato strutture come il nucleo ipoglosso9, il gruppo respiratorio ventrale8 e la formazione reticolare adiacente 8 nel troncocerebrale caudale usando l'approccio cisterna magna, come illustriamo ulteriormente per il nucleo ipoglosso e il midollo ventromediale (GiV) nella Figura 3. Ad esempio, il nucleo ipoglosso è una colonna sottile ma rostrocaudamente allungata di motoneuroni nel midollo allungato dorsale e il suo polo rostrale può essere mirato tramite un approccio standard. Tuttavia, poiché le coordinate DV (~ 4,5 mm) sono per lo più dettate dal cervelletto sovrastante con solo 1,2-1,4 mm che entrano nel tronco cerebrale, una differenza relativamente piccola nel posizionamento della testa del topo potrebbe quindi facilmente provocare un'iniezione fuori posto. A causa della vicinanza di questo obiettivo all'obex di punto zero, può essere mirato in modo più affidabile tramite l'approccio cisterna magna. Inoltre, l'estremità caudale del nucleo ipoglosso che si estende fino alla transizione tra tronco cerebrale e midollo spinale può essere presa di mira dallo stesso approccio cisterna magna, mentre l'approccio standard dovrebbe essere modificato per raggiungere tale sito caudale angolando l'approccio AP e regolando le coordinate per evitare l'osso occipitale e la muscolatura del collo sovrastante.

Al fine di determinare l'accuratezza dell'approccio cisterna magna rispetto all'approccio standard, abbiamo misurato la distanza tra i siti bersaglio previsti ed effettivi nei piani anteroposteriore, mediolaterale e dorsoventrale per il ventrale (midollo ventromediale; Gia/V; N = 10) e dorsale (NuXII; N = 16) regioni. Le misurazioni sono state effettuate in sezioni trasversali del tronco cerebrale caudale (Figura 3). I risultati (Figura 4) mostrano errori significativamente più piccoli nei piani anteroposteriori, mediolaterali e soprattutto dorsoventrali per l'approccio cisterna magna rispetto all'approccio standard. Questi risultati evidenziano la maggiore precisione dell'approccio cisterna magna per questi obiettivi. Abbiamo incluso coordinate stereotassiche standard (relative al bregma, derivate da Paxinos e Franklin 2, ma ottimizzate per i nostri studi) e coordinate cisterna magna (relative all'obex) nella Tabella 1. Queste coordinate sono state tutte ottimizzate e verificate come mostrato per il nucleo ipoglosso e il midollo ventromediale nella Figura 3.

Figura 1: Rappresentazione schematica dei punti di riferimento chiave, delle aree target e del piano dell'approccio stereotassico della cisterna magna. (A) Punti di riferimento anatomici chiave e posizionamento nel piano sagittale. (B) Aree che possono essere raggiunte attraverso l'approccio stereotassico standard rispetto all'approccio stereotassico cisterna magna e relazione con i loro punti di riferimento. i) L'approccio standard fa uso di punti di riferimento ossei bregma e lambda, che sono distanti dalle regioni bersaglio in magenta e viola. L'area in magenta (midollo caudale allungato e midollo cervicale superiore) è difficile da raggiungere a causa dell'osso occipitale obliquo e dei muscoli del collo. L'area in viola (midollo rostrale oblongata) è soggetta a movimenti e distante dai punti di riferimento tradizionali. ii) L'approccio della cisterna magna è appropriato per accedere al midollo caudale allungato e al cordone cervicale superiore e presenta vantaggi nello studio delle strutture del tronco cerebrale che sono organizzate in colonne longitudinali che si estendono dal midollo caudale allungato rostralmente, fino al livello del ponte caudale. (C) Schema dei piani di vari atlanti di riferimento stereotassici in relazione all'approccio cisterna magna. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Panoramica schematica passo-passo dell'approccio cisterna magna stereotassico. (A) Adattatore per mouse con barre auricolari posizionate uniformemente al livello più alto, barra della bocca in posizione ribassata e una scheda di plastica per fissare la testa anteroflessa con un angolo di 90 °. (B) Fissare il mouse nel telaio stereotassico utilizzando le barre auricolari e anteroflex la testa a 90° e mantenere in posizione tramite una carta di plastica rigida, con il telaio stereotassico come riferimento. (C) Assicurarsi che il corpo sia elevato in modo che si trovi sullo stesso piano dell'occipite. Palpa i punti di riferimento chiave. (D) Fare un'incisione cutanea dall'occipite alla parte rostrale delle spalle. (E) Fare un'incisione nel rafe del muscolo trapezio. Assicurati di rimanere nella linea mediana e non tagliare i muscoli sottostanti. (F) Identificare la linea mediana tra le due pance del muscolo longus capitis, a partire dall'occipite, e guidare la pinza di laminectomia in direzione caudale. (G) Posizionare ciascuno dei ganci della ferita tra le pance del muscolo longus capitis e riposizionare fino a quando la cisterna magna non viene in vista. (H) Identificare i punti di riferimento ossei (osso occipitale, atlante), la dura madre che si estende tra queste strutture ossee e il cervelletto sottostante e il tronco cerebrale. Pulire la dura madre secondo necessità per esporre il livello target. (I) Usando forbici a molla e pinze sottili aprire la dura. (J) Identificare l'obex, che forma il punto zero AP e ML. Spostare la pipetta sulle coordinate AP e ML scelte. Abbassare la pipetta fino a raggiungere la superficie dorsale del tronco cerebrale. Questo è il punto zero DV. Abbassare la pipetta alla coordinata desiderata. (K) Rimuovere la pipetta e i ganci della ferita e lasciare che i muscoli longus capitis riprendano la loro posizione originale. (L) Chiudere la ferita e rimuovere il mouse dal telaio stereotassico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Valutazione delle coordinate target. Fotomicrografie a basso ingrandimento del tronco cerebrale caudale. (A) Iniezione di subunità b (CTb; blu) della tossina tracciante retrograda nel nucleo ipoglosso di un topo reporter ChAT-cre L10 GFP (verde) (femmina, 6 mesi). Si noti che l'iniezione di CTb è limitata al nucleo ipoglosso. (B) Trasfezione di cellule glutamatergiche di un topo reporter (verde) vGluT2-ires-cre L10 (verde) (maschio, 2 mesi) con un tracciante anterogrado condizionale (magenta) nella parte ventrale del midollo caudale mediale oblongata (polo caudale della regione GiV). (C) Tracciamento retrogrado condizionale in un topo vGLuT2-ires-cre (maschio, 2 mesi) che mostra la trasfezione TVA (magenta) dei neuroni glutamatergici e l'infezione da rabbia modificata (verde) nel midollo caudale mediale allungato (polo caudale della regione GiV). Il virus della rabbia è stato iniettato nel midollo spinale cervicale superiore. I punti di riferimento interni fungono da guida. Abbreviazioni-cAmb: Nucleo compatto del complesso Ambiguus; Ap: Area Postrema; DMV: Nucleo Motorio Dorsale del Vago; GiV: Nucleo gigantocellulare, parte ventrale; IO: Oliva inferiore; IRt: Nucleo reticolare intermedio; LRN: Nucleo reticolare laterale; NuXII- Nucleo ipoglosso; sol: Nucleo del Tratto Solitario; Sp5: Nucleo trigemino spinale; VRG: gruppo respiratorio ventrale. Barra della scala: 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Confronto dell'accuratezza tra gli approcci standard e cisterna magna. Distanza media tra il centro del bersaglio previsto e il centro del sito effettivo nel piano anteroposteriore (A), nel piano mediolaterale (B) e nel piano dorsoventrale (C). I dati sono stati ottenuti da N = 13 topi adulti utilizzando un approccio standard e N = 13 topi adulti utilizzando un approccio cisterna magna. Il raggio del bersaglio è stato fissato a 30 μm. I risultati mostrano una maggiore precisione nel piano anteroposteriore (t(24) = 2,08, p = 0,049; t-test a due code; alfa 0,05), piano mediolaterale (t(24) = 2,55, p = 0,018; t-test a due code; alfa 0,05) e piano dorsoventrale (t(24) = 4,33, p = 0,0002; t-test a due code; alfa 0,05). I grafici a barre rappresentano la media con deviazione standard e i singoli punti rappresentano i valori in ciascun mouse. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Panoramica delle coordinate stereotasssica standard e cisterna magna per colpire le strutture del tronco cerebrale caudale. Si prega di notare che sia per gli approcci standard che per quelli cisterna magna, le coordinate dell'atlante Paxinos e Franklin2 sono state adattate fino a quando le regioni di interesse non sono state adeguatamente mirate come verificato dall'istologia (Figura 3). Inoltre, si noti che le aree nella formazione reticolare mancano di confini ben definiti e sono qui etichettate come in Paxinos e Franklin2. Abbreviazioni-AP: anteroposterior. ML: mediolaterale. DV: dorsoventrale. ChAT: Colina acetiltransferasi; F: Femmina; M: Maschio; M&F: Maschio e Femmina; NA: non applicabile; Pet1: plasmacitoma espresso fattore di trascrizione 1; Sert: Trasportatore di serotonina, vGaT: Trasportatore GABA vescicolare; vGluT2: Trasportatore di glutammato vescicolare 2; WT: Tipo selvaggio. Tutte le coordinate sono in millimetro (mm). Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.