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Articolo metodologico

Valutazione terapeutica del trapianto di microbiota fecale in un modello murino carente di interleuchina 10

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DOI:

10.3791/63350

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6 aprile 2022

 ,  ,  , 
1Division of Gastroenterology, Department of Internal Medicine, University of Texas Medical Branch at Galveston, 2Department of Gastroenterology, Xiangya Hospital of Central South University

In questo articolo

Sommario

L'interazione tra suscettibilità genetica, immunità mucosa e ambiente microecologico intestinale è coinvolta nella patogenesi della malattia infiammatoria intestinale (IBD). In questo studio, abbiamo applicato il trapianto di microbiota fecale a topi carenti di IL-10 e abbiamo studiato il suo impatto sull'infiammazione del colon e sulla funzione cardiaca.

Abstract

Con lo sviluppo della microecologia negli ultimi anni, la relazione tra batteri intestinali e malattie infiammatorie intestinali (IBD) ha attirato una notevole attenzione. Prove crescenti suggeriscono che il microbiota disbiotico svolge un ruolo attivo nell'innescare o peggiorare il processo infiammatorio nell'IBD e che il trapianto di microbiota fecale (FMT) è una strategia terapeutica interessante poiché il trasferimento di un microbiota sano al paziente con IBD potrebbe ripristinare la comunicazione ospite-microbiota appropriata. Tuttavia, i meccanismi molecolari non sono chiari e l'efficacia della FMT non è stata molto ben stabilita. Pertanto, sono necessari ulteriori studi su modelli animali di IBD. In questo metodo, abbiamo applicato FMT da topi selvatici C57BL / 6J a topi carenti di IL-10, un modello murino ampiamente utilizzato di colite. Lo studio elabora la raccolta di pellet fecali dai topi donatori, la produzione della soluzione / sospensione fecale, la somministrazione della soluzione fecale e il monitoraggio della malattia. Abbiamo scoperto che l'FMT ha mitigato significativamente la compromissione cardiaca nei topi knockout IL-10, sottolineando il suo potenziale terapeutico per la gestione delle IBD.

Introduzione

Il microecosistema intestinale umano è estremamente complesso, con più di 1000 specie di batteri nell'intestino di una persona sana1. La flora intestinale è coinvolta nel mantenimento delle normali funzioni fisiologiche dell'intestino e della risposta immunitaria e ha un rapporto inscindibile con il corpo umano. L'accumulo di prove suggerisce che il microbioma intestinale costituisce l'ultimo organo umano, che fa parte del corpo umano, non solo un gruppo di parassiti2. Una relazione simbiotica "sana" tra il microbiota intestinale, i loro metaboliti e il sistema immunitario dell'ospite stabilito nei primi anni di vita è fondamentale per mantenere l'omeostasi intestinale. In alcune condizioni anormali come l'infiammazione cronica, i cambiamenti nell'ambiente interno ed esterno del corpo interrompono seriamente l'omeostasi intestinale, con conseguente squilibrio persistente della comunità microbica dell'intestino, chiamato disbiosi3. Infatti, l'esposizione a molteplici fattori ambientali, tra cui dieta, farmaci e agenti patogeni, può portare a cambiamenti nel microbiota.

La disbiosi è associata alla patogenesi di una varietà di malattie intestinali, come la malattia infiammatoria intestinale (IBD), la sindrome dell'intestino irritabile (IBS) e l'enterite pseudomembranosa, nonché un elenco crescente di disturbi extra-intestinali, tra cui malattie cardiovascolari, obesità e allergia4. Il profilo del microbiota ha rivelato che i pazienti con IBD hanno una drastica diminuzione della diversità batterica, nonché marcate alterazioni nelle popolazioni di alcuni ceppi batterici specifici 5,6. Questi studi hanno dimostrato meno Lachnospiraceae e Bacteroidetes ma più Proteobacteria e Actinobacteria nei pazienti con IBD. Si ritiene che la patogenesi dell'IBD sia correlata a vari fattori patogeni, tra cui flora intestinale anormale, risposta immunitaria disregolata, sfide ambientali e varianti genetiche7. Abbondanti prove suggeriscono che i batteri intestinali svolgono un ruolo nelle fasi di inizio e applicazione di IBD8,9, indicando che la correzione della disbiosi intestinale può rappresentare un nuovo approccio per la terapia e / o il trattamento di mantenimento dell'IBD.

Il prototipo del trapianto di microbiota fecale (FMT) è iniziato nell'antica Cina10. Nel 1958, il Dr. Eiseman e i suoi colleghi trattarono con successo quattro casi di grave enterite pseudomembranosa con materia fecale da donatori sani tramite clistere, aprendo un nuovo capitolo nella moderna medicina occidentale usando le feci umane per curare le malattie umane11. L'infezione da Clostridium difficile (CDI) è risultata essere la causa principale dell'enterite pseudomembranosa12 e l'FMT è altamente efficace nel trattamento della CDI. Negli ultimi otto anni, l'FMT è diventata una terapia standard per il trattamento della CDI13 ricorrente, spingendo ulteriori studi che indagano il ruolo dell'FMT in altri disturbi, come l'IBD. Negli ultimi vent'anni, numerosi casi clinici e studi di coorte hanno documentato l'uso di FMT in pazienti con IBD14. Una meta-analisi, inclusi 12 studi, ha mostrato che il 62% dei pazienti con malattia di Crohn (MC) ha raggiunto la remissione clinica dopo FMT e il 69% dei pazienti con CD ha avuto una risposta clinica15. Nonostante questi risultati incoraggianti, il ruolo dell'FMT nella gestione dell'IBD rimane incerto e i meccanismi con cui l'FMT migliora l'infiammazione intestinale sono poco conosciuti. Sono necessarie ulteriori indagini prima che FMT possa unirsi all'attuale armamentario di opzioni di trattamento per IBD nelle cliniche.

In questo protocollo, abbiamo applicato FMT su topi IL-10-/-, che sviluppano colite spontaneamente dopo lo svezzamento e sono serviti come gold standard per rispecchiare la natura multifattoriale di IBD16,17,18. I topi IL-10−/− sono stati ampiamente utilizzati per sezionare l'eziologia dell'IBD perché presentano caratteristiche molecolari e istologiche simili ai pazienti con IBD e, come i pazienti, la malattia può essere migliorata con la terapia anti-TNFα16. I topi IL10−/− (>9 mesi di età) hanno una maggiore dimensione del cuore e una funzione cardiaca compromessa rispetto ai topi wild-type di pari età19, rendendolo un modello eccellente per lo studio delle malattie cardiache indotte da colite. Tuttavia, possono essere utilizzati anche altri modelli murini di colite, come il modello di solfato di sodio destrano e il modello di colite indotta da cellule T. Abbiamo somministrato sospensione fecale tramite sonda orale gastrica, dimostrata una via efficace e migliore rispetto al clistere negli esseri umani20.

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Protocollo

Tutte le procedure eseguite sugli animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee della University of Texas Medical Branch di Galveston (Protocollo # 1512071A).

1. Raccolta di pellet fecali freschi

  1. Preparare asciugamani di carta sterili, pinze smussate e tubi conici da 50 ml.
    1. Mettere alcuni tovaglioli di carta e pinze in sacchetti separati per autoclave e sterilizzarli in autoclave a 180 °C a fuoco secco per 30 minuti. Utilizzare anche tubi conici sterili. Pesare i tubi conici e annotare il loro peso sui tubi.
  2. Accendi l'armadietto di biosicurezza nella stanza degli animali.
  3. Prendi una gabbia per topi pulita autoclavata senza lettiera e mettila nell'armadio di biosicurezza. Rimuovere il coperchio e il portacibo e posizionarli all'interno dell'armadietto.
  4. Posizionare alcuni tovaglioli di carta sterili sul fondo della gabbia e riposizionare il rack di metallo sopra la gabbia.
  5. Identificare i donatori fecali di età corrispondente e posizionare la gabbia del topo nell'armadietto di biosicurezza. Aprire la gabbia e afferrare delicatamente un topo donatore (C57BL/6J) per la coda e posizionarlo sul rack metallico sopra la gabbia pulita.
  6. Posizionare il coperchio della gabbia sulla parte superiore del rack e attendere che l'animale o gli animali defechino.
    NOTA: Mettere alcuni compagni di cucciolata di topo sul rack contemporaneamente.
  7. Raccogliere i pellet fecali e metterli in un tubo conico sterile da 50 ml. Raggruppa i pellet per sesso. Non mescolare pellet fecali raccolti da maschi e femmine.
  8. Pesare nuovamente il tubo e calcolare il peso dei pellet fecali.

2. Preparazione della sospensione fecale

  1. Preparare una soluzione sterile (10% di glicerolo in soluzione salina normale).
  2. Aggiungere 10 ml di glicerolo al 10% / soluzione salina normale al tubo conico per ogni grammo di pellet fecale.
    NOTA: se necessario, aumentare il volume della soluzione a 20 ml. Questo studio ha utilizzato anche 1 ml di soluzione per ogni pellet (5-10 mg).
  3. Omogeneizzare la miscela a bassa velocità con un omogeneizzatore da banco o un frullatore all'interno di una cappa aspirante per risospendere le feci (3 X 30 s).
  4. Filtrare la sospensione fecale attraverso 2 strati di garza di cotone sterile (10,2 cm x 10,2 cm). Conservare temporaneamente il filtrato in frigorifero per un massimo di 6 ore o confezionarlo in flaconcini criogenici sterili e conservarlo in un congelatore a -80 °C.
  5. Pulire accuratamente l'omogeneizzatore o il frullatore seguendo una procedura standard.

3. Somministrazione di sospensione fecale mediante sonda gastrica orale

  1. Scongelare la sospensione fecale congelata sul ghiaccio se si utilizzano campioni congelati. Mescolare la sospensione fecale scongelata mediante vortice.
  2. Trasferire la sospensione fecale fresca o scongelata in siringhe da 1 ml.
    NOTA: Ogni topo riceverà un totale di 200 μL di sospensione fecale e ogni topo IL-10-/- nel gruppo di controllo riceverà 200 μL di glicerolo al 10% / soluzione salina normale17.
  3. Pesare i topi e scegliere la giusta dimensione dell'ago gastrico e il volume massimo di dosaggio.
    NOTA: Per i topi con un peso corporeo compreso tra 20-25 grammi, utilizzare un ago da 20 G con sonda curva da 3,81 cm con una sfera da 2,25 mm. Si prega di controllare gavageneedle.com per ulteriori informazioni.
  4. Testare l'ago gastrico misurando la lunghezza dalla punta del naso del topo al processo xifoideo (fondo dello sterno). Riempire la siringa con glicerolo/soluzione salina o sospensione fecale al 10% e rimuovere le bolle d'aria all'interno della siringa e dell'ago.
    NOTA: Se l'ago è più lungo della lunghezza, apporre un segno sull'albero/tubo dell'ago a livello del naso. Non far passare l'ago / tubo attraverso l'animale oltre quel punto per evitare la perforazione gastrica.
  5. Posizionare una gabbia per topi nell'armadio di biosicurezza, rimuovere il coperchio della gabbia di plastica e lasciare il rack metallico in posizione.
  6. Prendi un mouse per la coda e mettilo sul rack di metallo. Tieni il mouse per la coda con una mano e usa il pollice e il medio di un'altra mano per trattenere l'animale afferrando la pelle sopra le spalle. In questo modo, le zampe anteriori sono distese lateralmente, il che impedirà ai piedi anteriori di spingere l'ago fuori. Estendi delicatamente la testa dell'animale all'indietro e tieni la testa in posizione con una mano.
    NOTA: esercitarsi a gestire il mouse fino a quando lo sperimentatore non ha piena fiducia prima di procedere all'esperimento.
  7. Posizionare l'ago di gavage sulla parte superiore della lingua all'interno della bocca. Avanzare delicatamente lungo il palato superiore fino a quando l'ago raggiunge l'esofago. Passare l'ago senza intoppi in un solo movimento. Non forzare l'ago se si avverte resistenza. Estrai l'ago e riprova.
  8. Una volta che l'ago è posizionato correttamente e verificato, somministrare lentamente il materiale spingendo la siringa attaccata all'ago. Non ruotare l'ago o spingere l'ago in avanti, che potrebbe rompere l'esofago. Dopo la somministrazione, estrarre delicatamente l'ago.
  9. Riportare il mouse nella sua gabbia di casa. Monitorare l'animale per 5-10 minuti cercando segni di respiro affannoso o angoscia. Monitorare nuovamente i topi tra 12-24 ore dopo l'FMT.

4. Monitoraggio delle malattie ed eutanasia

  1. Monitorare i topi longitudinalmente per l'insorgenza di IBD mediante sangue fecale occulto e / o colonscopia21. Valutare la funzione cardiaca mediante ecocardiografia trans-toracica22,23.
  2. Eutanasia degli animali per decapitazione sotto un piano profondo di anestesia con isoflurano (1% -4%).
  3. Raccogliere il sangue in provette da microcentrifuga con anticoagulante e centrifugare a 1000-2000 x g per 10 minuti in centrifuga refrigerata (4 °C). Conservare il plasma supernatante designato in un congelatore a -80°C.
  4. Dopo l'eutanasia, preparare il colon del topo utilizzando la tecnica Swiss-roll24 per l'analisi istopatologica (colorazione H & E)25.
  5. Misurare il peptide natriuretico di tipo B (BNP) nel plasma utilizzando un kit di dosaggio immunoenzimatico (EIA)23.

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Risultati

Abbiamo eseguito FMT donatore sano 3 volte (una volta al mese per 3 mesi) su topi selvatici C57BL / 6J di 2 mesi (WT) e IL-10 knockout. Topi C57BL / 6J di età corrispondente (la differenza di età dovrebbe essere <2 mesi) sono serviti come donatori fecali e ogni volta sono stati utilizzati pellet fecali freschi. I test EIA hanno rivelato che il BNP era marcatamente elevato nel plasma dei topi con deficit di IL-10 e che l'FMT del donatore sano ha mitigato significativamente l'aumento dei livelli di BNP (

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Discussione

Come trattamento sperimentale innovativo, FMT è diventato un argomento caldo nel trattamento di vari disturbi negli ultimi anni poiché la disbiosi del microbiota commensale è implicata nella patogenesi di più malattie umane, tra cui IBD, obesità, diabete mellito, autismo, malattie cardiache e cancro26. Sebbene il meccanismo non sia stato determinato, si ritiene che FMT funzioni costruendo una nuova flora biologica e prevenendo la perdita di batteri residui. Il metodo qui presentato ha adottato il ...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto, in parte, da sovvenzioni del National Institutes of Health (R01 HL152683 e R21 AI126097 a Q. Li) e dall'American Heart Association Grant-in-Aid 17GRNT33460395 (a Q. Li) (heart.org).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Siringa BD, 1 mLFisher Scientific14-829-10F
Pinze terminali smussateKnipex926443
Kit EIA per peptide natriuretico cerebraleSigmaRAB0386
topi C57BL/6JJackson Lab000664
CentrifugaEppendorf5415R
Provette conicheThermoFisher339650
Aghi di alimentazione curviKent ScientificFNC-20-1.5-2
GLH-115 omogeneizzatoreOmni InternationalGLH-115
GliceroloMilliporeSigmaG5516
IL-10 topi knockoutJackson Lab004366
IsofluranoPiramal Terapia intensivaNDC66794-017-10
USP soluzione salina normaleGrainger6280
VaporizzatoreEuthanex Corp.EZ-108SA

Riferimenti

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