Monitoraggio dinamico della sieroconversione utilizzando un test multianalyte immunobead per Covid-19

Sommario

Questo articolo descrive un metodo conveniente per monitorare i cambiamenti dinamici nei titoli anticorpali per due isotipi di immunoglobuline contemporaneamente (IgA, IgM o IgG) derivanti da una risposta immunitaria all'infezione o alla vaccinazione da SARS-CoV-2. Questo "Multianalyte Covid-19 Immune Response Panel" impiega tre test immunologici indiretti costruiti su microsfere codificate che vengono lette utilizzando un lettore multiplex basato sul flusso con funzionalità "dual-channel".

Abstract

Le tecnologie multiplex per interrogare più biomarcatori in concerto esistono da diversi decenni; tuttavia, i metodi per valutare più epitopi sullo stesso analita rimangono limitati. Questo rapporto descrive lo sviluppo e l'ottimizzazione di un test di immunosfere multiplexed per i test sierologici di isotipi di immunoglobuline comuni (ad esempio, IgA, IgM e IgG) associati a una risposta immunitaria all'infezione o alla vaccinazione da SARS-CoV-2. I saggi sono stati eseguiti utilizzando un lettore fluorescente multiplex basato sul flusso con capacità a doppio canale. Le ottimizzazioni si sono concentrate sul tempo di cattura degli analiti, sulla concentrazione degli anticorpi di rilevamento e sul tempo di incubazione degli anticorpi di rilevamento. Le caratteristiche analitiche delle prestazioni del saggio (ad esempio, l'intervallo di analisi (compresi i limiti inferiori e superiori di quantificazione) e la precisione intra e inter-saggio) sono state stabilite per la combinazione di sierotipi IgG/IgM o IgA/IgM in tandem utilizzando la modalità "doppio canale". I tempi di acquisizione degli analiti di 30 minuti per IgG, 60 minuti per IgM e 120 minuti per IgA erano adatti per la maggior parte delle applicazioni, fornendo un equilibrio tra prestazioni del test e throughput. Sono state osservate incubazioni ottimali di anticorpi di rilevamento a 4 μg/mL per 30 minuti e sono raccomandate per applicazioni generali, data l'eccellente precisione complessiva (coefficiente percentuale di varianza (%CV) ≤ 20%) e i valori di sensibilità osservati. La gamma dinamica per l'isotipo IgG si estendeva su diversi ordini di grandezza per ciascun saggio (Spike S1, Nucleocapsid e glicoproteine di membrana), che supporta valutazioni robuste del titolo a un fattore di diluizione 1:500 per applicazioni cliniche. Infine, il protocollo ottimizzato è stato applicato al monitoraggio della sieroconversione Spike S1 per soggetti (n = 4) che hanno completato un regime vaccinale SARS-CoV-2. All'interno di questa coorte, i livelli di Spike S1 IgG sono stati osservati per raggiungere i titoli massimi a 14 giorni dopo la somministrazione della seconda dose, ad un'intensità del segnale molto più alta (~ 40 volte) rispetto agli isotipi IgM o IgA. È interessante notare che abbiamo osservato tassi di decadimento del titolo Spike S1 IgG altamente variabili che erano in gran parte dipendenti dal soggetto, che saranno l'argomento di studi futuri.

Introduzione

La misurazione simultanea di più biomarcatori correlati alla malattia in campioni biologici consente approfondimenti descrittivi e predittivi sui processi patologici. Mentre le procedure immunologiche convenzionali ad analita singolo, come i saggi immunoassorbenti enzimatici (ELISA), sono state la pietra angolare delle analisi quantitative sia in ambito clinico che di ricerca, queste tecniche possono avere limitazioni sostanziali per quanto riguarda la produttività, la quantità di campione richiesta per ogni misurazione e il rapporto costo-efficacia che limitano notevolmente lo studio di più elementi biologici che sono frequentemente intrecciati durante il decorso della malattia¹ . La tecnologia multiplexing basata su microsfere è diventata una piattaforma indispensabile sia per le strutture diagnostiche che per quelle di ricerca per la sua capacità di combinare i saggi per migliorare la produttività del laboratorio, mitigare la scarsità di campioni e ridurre i test ripetitivi per massimizzare i risparmi sui costi 1,2,3,4. Recentemente, è stato introdotto un ulteriore aumento di questa potenza multiplexing con strumenti in possesso di capacità dual-reporter. La funzione dual-reporter implementa due canali fluorescenti per il rilevamento, fornendo un'altra dimensione di multiplexing, consentendo il rilevamento di più epitopi sullo stesso analita.

Sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) è l'agente patogeno responsabile dell'attuale pandemia di coronavirus 2019 (COVID-19)⁵. Mentre il test RT-PCR è cruciale per la conferma dell'infezione all'inizio del decorso della malattia, gli esami sierologici dei titoli anticorpali si sono dimostrati indispensabili per la critica accurata e completa degli individui in merito a una precedente esposizione o recupero; una risposta all'immunizzazione; e/o una valutazione dell'efficacia della vaccinazione Covid-19 ^6,7.

Questo rapporto delinea i metodi per misurare la sieroconversione per più antigeni virali SARS-CoV-2 che utilizzano un sistema di doppia segnalazione basato sul flusso e lettore multiplex. In particolare, viene descritta la rilevazione simultanea di due sottotipi di anticorpi (configurati come IgG/IgM o IgA/IgM) per un pannello di antigeni SARS-CoV-2 3-plex che include saggi per glicoproteine Spike S1, Nucleocapsid e Membrane (aka Matrix). Questo approccio fornisce un'impresa ideale per la cattura della sieroconversione longitudinale e contribuisce a uno strumento prezioso nell'arsenale contro la pandemia di Covid-19.

Protocollo

Tutti i soggetti sono stati arruolati con consenso informato scritto con piena approvazione institutional review board (IRB) del Rush University Medical Center ai sensi del protocollo ORA 20101207 con tutte le linee guida istituzionali per la condotta di ricerca etica osservate. Il sangue è stato raccolto tramite flebotomia convenzionale in vacutainers di lavanda (K₂EDTA) ed elaborato con i protocolli raccomandati. Il plasma risultante è stato archiviato a -80 °C fino a quando non sono state eseguite le valutazioni.

1. Preparazione di microsfere coniugate con antigene

1. Selezionare tre diverse fiale di microsfere magnetiche con regioni di perline univoche, registrando l'ID del tallone e le informazioni sul lotto per ogni fiala utilizzata.
   NOTA: i seguenti passaggi verranno seguiti per ogni regione di microsfera distinta. Le microsfere sono sensibili alla luce e devono essere protette dall'esposizione prolungata alla luce. Durante le fasi di lavaggio, fare attenzione a non disturbare le microsfere. Se disturbato, consentire una seconda separazione di 60 s.
2. Vortice del materiale della microsfera per 60 s e sonicare per 5 minuti prima dell'uso per dissociare le perle aggregate.
3. Trasferire 1,0 x 10⁶ perline in un microcentrifugale a bassa legatura proteica da 1,5 mL.
4. Inserire il tubo in un separatore magnetico e consentire la separazione per 60 s. Con il tubo ancora nel separatore magnetico, rimuovere con cura il surnatante senza disturbare il pellet di perline.
5. Rimuovere il tubo dal separatore magnetico, risospesciare le perline con 100 μL di acqua di grado HPLC e vortice per 30 s. Riposizionare il tubo nel separatore magnetico per 60 s e successivamente rimuovere il surnatante. Ripetere questo protocollo di lavaggio due volte.
6. Rimuovere il tubo dal separatore magnetico e risospesciare le microsfere lavate in 90 μL di fosfato di sodio monobasico da 100 mM, pH 6,2 (tampone di attivazione) tramite vortice per 30 s.
7. Aggiungere 10 μL di 50 mg/mL Sulfo-NHS (diluito con Buffer di Attivazione) alle microsfere e vortice delicatamente per 10 s. Aggiungere 10 μL di soluzione EDC da 50 mg/mL (diluita con buffer di attivazione) e vortice delicatamente per 10 s. Incubare microsfere per 20 minuti a temperatura ambiente (RT) con un vortice delicato ogni 10 minuti.
8. Ripetere i passaggi di lavaggio 1,4-1,5 con 50 mM MES, pH 5,0 (Coupling Buffer) al posto dell'acqua di grado LC/ MS per un totale di due lavaggi.
9. Rimuovere il tubo dal separatore magnetico e risospesciare le perline con 100 μL di Coupling Buffer tramite vortice per 30 s seguito immediatamente dall'aggiunta della quantità desiderata di proteine.
10. Portare il volume totale a 150 μL con Coupling Buffer. Reazione di accoppiamento della miscela per vortice per 30 s e incubazione per 2 ore mediante rotazione a RT.
    NOTA: Per i saggi qui definiti, le coniugazioni sono state eseguite con le seguenti concentrazioni proteiche: Spike S1: 5 μg; Nucleocapside: 5 μg; Membrana: 12,5 μg.
11. Ripetere il lavaggio fase 1.4 con Fosfato Tamponato Salino (PBS)-1% Albumina Sierica di Capra, 0,01% Polisorbato-20 (Tampone di Quench) al posto dell'acqua di grado LC/MS per un totale di due lavaggi. Risospesso le microsfere lavate in 100 μL di Tampone di Tempra contenente lo 0,05% di azide di sodio mediante vortice per 30 s.
    NOTA: Lasciare che le perline si estendano completamente per almeno 6 ore prima di procedere a qualsiasi altra procedura.
12. Contare il numero di microsfere recuperate utilizzando un contatore di cellule automatizzato o un emocitometro. Registrare la concentrazione di perline osservata.
13. Refrigerare le microsfere accoppiate a 4 °C al buio.

2. Procedure

1. Prestazioni del test (protocollo di base)
   1. Sospendere le microsfere accoppiate per vortice per 30 s e sonicare per ~60-90 s.
   2. Rimuovere la quantità richiesta di ciascun colloide dal rispettivo tubo e combinare i colloidi di perline in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 ml.
   3. Inserire il tubo in un separatore magnetico e consentire la separazione per 60 secondi. Con il tubo ancora nel separatore magnetico, rimuovere con cura il surnatante senza disturbare il pellet di perline.
   4. Rimuovere le perline dal separatore, risospesciare le perline con 100 μL di PBS-1% di albumina sierica bovina, 0,01% di polisorbato-20 (tampone di dosaggio) e vortice per 30 s. Posizionare il tubo in un separatore magnetico e consentire la separazione per 60 s. Ripetere questo protocollo di lavaggio (ad esempio, i passaggi 2.1.3-2.1.4) due volte
   5. Regolare la concentrazione della miscela di microsfere funzionanti a 3 plex aggiungendo un volume appropriato di tampone di saggio per generare una concentrazione finale di 100 microsfere per 1 μL per ciascun bersaglio.
   6. Aliquota 12,5 μL della miscela di microsfere preparata nella fase 2.1.5 in ciascun pozzetto di una piastra da 384 pozzetti o 25 μL in ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti.
   7. Diluire i campioni di plasma/siero 500 volte in Assay Buffer. Preparare campioni standard in base alla titolazione desiderata.
   8. Aggiungere 12,5 μL di Assay Buffer come campione bianco e aggiungere ciascuno dei campioni diluiti o standard in ciascun pozzetto designato di una piastra campione da 384 pozzetti o 25 μL del campione bianco diluito o standard in ciascun pozzetto di una piastra campione a 96 pozzetti.
   9. Coprire la piastra con un sigillo o un foglio di alluminio e incubare per 1 ora a RT su uno shaker a piastre impostato a 700 giri / min.
      NOTA: lo schema per le curve di diluizione è fornito nella Tabella 1.
   10. Preparare una soluzione di anticorpi anti-umani (soluzioni anticorpali secondarie) a 4 μg/mL con Assay Buffer come specificato al punto 2.1.11.
   11. Preparare IgM anti-uomo di capra, coniugato con super bright 436 (SB) / capra anti-umana IgA, ficoeritrina (PE) Coniugato anticorpi a 4 μg / mL; o Goat-anti-human IgM, SB Conjugate/Goat-anti-human IgG, PE Conjugate rileva anticorpi a 4 μg/mL.
       NOTA: per un formato di piastra a 384 pozzetti, sono necessari 12,5 μL/pozzetto della soluzione anticorpale secondaria preparata e per un formato di piastra a 96 pozzetti sono necessari 25 μL/pozzetto.
   12. Posizionare la piastra su un separatore magnetico, lavare rapidamente e invertire con forza un contenitore a rischio biologico per rimuovere il liquido dai pozzetti. Con la piastra ancora invertita, picchietta con forza la piastra contro una spessa mazzetta di carta.
   13. Lavare ogni pozzetto con 100 μL di Assay Buffer e rimuovere il liquido mediante inversione forzata su un contenitore a rischio biologico, come descritto in precedenza. Ripetere questi passaggi (2.1.12-2.1.13) per un totale di due lavaggi. Scartare tutti i batuffoli di carta usati in un contenitore a rischio biologico.
   14. Aggiungere 12,5 μL della soluzione di lavoro anticorpale secondaria a ciascun pozzetto di una piastra da 384 pozzetti o 25 μL a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Coprire la piastra con un sigillo di alluminio o un foglio e incubare per 30 minuti a RT su uno shaker a piastre impostato a 700 giri / min.
   15. Ripetere i passaggi di lavaggio 2.1.12-2.1.13
   16. Aggiungere 75 μL di Assay Buffer in ogni pozzetto di una piastra da 384 pozzetti o 100 μL in ogni pozzetto di una piastra da 96 pozzetti. Coprire la piastra con un sigillo o un foglio di alluminio e incubare per 5 minuti a RT su uno shaker a piastre impostato a 700 giri / min.
   17. Analizzare 60 μL tramite l'analizzatore dello strumento in base al manuale del sistema.
2. Ottimizzazione del tempo di incubazione della cattura dei campioni
   1. Eseguire i passaggi di cui alla sezione 2.1 utilizzando la durata dei tempi di incubazione di 30 min, 60 min e 120 min nel passaggio 2.1.9.
      NOTA: le incubazioni possono essere eseguite con piastre distinte o fermandosi al punto 2.1.6 fino al momento di procedere al passaggio 2.1.9. per raggiungere i tempi di incubazione desiderati.
   2. Procedere con la lettura delle piastre sull'analizzatore utilizzando 60 μL della miscela di analisi secondo le raccomandazioni del produttore.
3. Ottimizzazione della concentrazione di anticorpi secondari
   1. Eseguire questa procedura come descritto al punto 2.1, ad eccezione delle concentrazioni finali di reagenti nella soluzione di lavoro anticorpale secondaria (preparata nella fase 2.1.10-2.1.11) modificata come segue:
      Anticorpi di rilevamento IgM, SB-coniugati anti-capra (o coniglio) a 8, 4, 2, 1 e 0,5 μg/mL.
      Anticorpi di rilevamento IgA, coniugati di PE-anti-uomo (o coniglio) a 8, 4, 2, 1 e 0,5 μg/mL.
      Anticorpi di rilevamento IgG, coniugati di IgG, CONIUGATI DI CAPRA-ANTI-uomo (o coniglio) a 8, 4, 2, 1 e 0,5 μg/mL.
      IgG anti-capra (o coniglio), PE-coniugato/Capra-anti-umano (o coniglio) IgM, SB-coniugato anticorpi a 8, 4, 2, 1 e 0,5 μg/mL.
      IgA anti-capra (o coniglio), PE-coniugato/Capra-anti-umano (o coniglio) IgM, SB-coniugato anticorpi a 8, 4, 2, 1 e 0,5 μg/mL.
   2. Procedere con la lettura delle piastre sull'analizzatore utilizzando 60 μL della miscela di analisi secondo le raccomandazioni del produttore.
4. Ottimizzazione del tempo di incubazione degli anticorpi secondari
   1. Eseguire questa procedura come descritto nel paragrafo 2.1 con 15 min, 30 min, 60 min e 120 min di durata di incubazione definita nel passaggio 2.1.14.
   2. Procedere con la lettura delle piastre sull'analizzatore utilizzando 60 μL della miscela di analisi secondo le raccomandazioni del produttore.
5. Valutazione di campioni soggetti con saggi a doppio canale ottimizzati
   1. Raccogliere campioni di plasma soggetto (n = 4) ai giorni -21, -11, -1/0, +14, +28, +60, +90 e +120 relativi al completamento della somministrazione del vaccino Covid-19 (cioè seconda dose).
      NOTA: il giorno 0 rappresenta il punto temporale in cui è stata completata la vaccinazione.
   2. Eseguire tutti i test utilizzando il protocollo di base (sezione 2.1.) come saggio a doppio canale IgG/IgM o IgA/IgM.
   3. Normalizzare i risultati al valore massimo osservato di intensità fluorescente mediana (MFI) per ogni immunoglobulina e test specifici.

Risultati

Risultati tipici dei test e valutazioni delle prestazioni
I saggi immunobeadi forniscono comunemente una curva sigmoidale quando valutati su diversi ordini di grandezza (log), come illustrato in ciascuno dei pannelli presentati nella Figura 1. L'utente deve definire sperimentalmente l'intervallo di concentrazione ottimale per ciascun analita nel multiplex per determinare l'intero intervallo di quantificazione, assicurandosi di non sovracampionare gli estremi (aree che si avvicinano al limite inferiore di quantificazione [LLOQ] o al limite superiore di quantificazione [ULOQ]). L'intervallo effettivo richiesto per un test, tuttavia, è dettato dalla distribuzione degli analiti bersaglio in una matrice biologica (cioè le "incognite") a un dato fattore di diluizione. Inoltre, sebbene le curve standard siano tipicamente interpretate tramite regressione lineare con un algoritmo di adattamento parametrico a 4 o 5 parametri, la porzione lineare di una data curva fornisce in genere la massima fiducia nell'accuratezza quantitativa con un modello lineare (y = mx + b) di quantificazione. Abbinare la curva di calibrazione ai valori osservati per un'incognita a un dato fattore di diluizione dovrebbe essere l'obiettivo nello sviluppo del saggio quantitativo.

A questo proposito, è stata valutata una curva standard a 7 punti basata su una serie di diluizioni seriali 1:5 per ciascuno degli anticorpi Spike S1, Nucleocapsid e Membrane che variano tra 1 μg/mL e 0,000064 μg/mL per Spike S1 e Nucleocapsid e 5 μg/mL e 0,00032 μg/mL per Membrane, come mostrato nella Figura 1. Il limite inferiore di rilevazione (LLOD) per ciascun test è stato definito come la più bassa concentrazione di analita che ha prodotto un segnale distinguibile dal suo sfondo. LLOD può essere identificato dall'equazione descritta in precedenza ^8,9, LLOD = LoB + 1.645 (campione_{sD a bassa concentrazione}). LoB è il limite inferiore del bianco, ed è la concentrazione "apparente" di analita che viene prodotta dal bianco quando è previsto un valore zero, e può essere accertato usando questa equazione LoB =_{Vuoto medio} + 1.645 (SD_vuoto)⁸. Sulla base di questo metodo, i valori MFI per il test Spike S1 variavano da 134,38 a 20191,2, con 134,38 MFI che rappresentavano 0,00024 μg / mL e definiti come LLOD. Per il test a membrana, l'intervallo pratico di MFI era compreso tra 52,24 e 4764,9, con 52,24 MFI calcolato in 0,004885 μg / mL e assegnato come LLOD. L'intervallo MFI per il test Nucleocapsid era compreso tra 517,9 e 19666,34, con 517,9 specificato come 0,00024 μg / mL, che era il LLOD. Il limite superiore di rilevazione (ULOD) è definito come la concentrazione di analita dopo la quale la variazione dell'IFM non è più lineare e la risposta del segnale è satura. Va notato che il carattere sigmoidale completo di queste curve non è osservabile per gli standard testati, ad eccezione della curva nucleocapside. Tuttavia, dati i valori MFI osservati per tutte le incognite analizzate fino ad oggi (a una diluizione 1:500) rientrano nell'intervallo di curva presentato per ciascun analita e sono facilmente quantificabili utilizzando un adattamento parametrico a 4 o 5 tramite regressione lineare.

Precisione del saggio
Precisione intra-saggio: quattro repliche di saggi sono state eseguite sulla stessa piastra per valutare la precisione del saggio, calcolata come %CV, o quoziente della deviazione standard e la media moltiplicata per 100. Per queste tabulazioni sono stati selezionati i punti standard 2 e 5, con i valori catalogati nella Tabella 2. La tipica soglia limite superiore accettabile per i valori %CV è ≤20%, che è stata osservata per questi dati, ad eccezione di quella per lo standard 2 di Membrane IgG, che probabilmente deriva da livelli di fondo e può essere rettificato eliminando i valori periferici (dati non mostrati). Va notato che è stata osservata un'apparente instabilità del valore di lettura per i saggi di membrana in cui i valori MFI erano <200, più comunemente nel caso degli isotipi IgA e IgM.

Precisione tra i test: tre distinti lotti di set di perline sono stati preparati e testati per ciascun test, come definito per la precisione intra-saggio (sopra e come visto nella Figura 1). La variabilità tra i test è stata valutata calcolando il %CV dai risultati medi per ciascuno dei tre lotti, come mostrato nella Tabella 3. Anche in questo caso, la soglia limite superiore per un %CV accettabile è fissata a ≤20%, che esiste per tutte le condizioni testate (con un effetto simile con lo standard 2 di Membrane IgG, come visto sopra). Va notato che la variabilità da lotto a lotto nei valori netti di IFM è comunemente osservata all'interno di più lotti degli stessi immunoreagenti durante lo sviluppo di test personalizzati. L'uso di una curva di calibrazione eretta da un anticorpo anti-bersaglio ottenuto commercialmente (ad esempio, coniglio anti-Spike S1) seguito da un anticorpo anti-specie di rilevamento può fornire coerenza nei risultati analitici e consentire confronti tra più lotti in diversi periodi di tempo.

Precisione inter-test con campioni umani: la valutazione della precisione inter-assay è stata ripetuta con campioni di plasma umano (n = 5) raccolti entro un mese dai primi sintomi riportati per un'infezione da SARS-CoV-2; realizzato con tre distinti lotti di saggi (cioè diversi preparati dei set di perline). Questi risultati sono illustrati nella Tabella 4 e dimostrano la precisione con un valore %CV con il tipico valore limite di soglia superiore di ≤20%. I valori medi %CV per i titoli Spike S1, Nucleocapsid e Membrane IgG sono stati calcolati rispettivamente al 9,9% (intervallo 2,6%-18%), all'11,0% (intervallo 3,5%-24,4%) e al 7,6% (intervallo 3,2%-12,9%). Osservazioni simili sono state fatte con i titoli IgM e IgA di questi tre analiti, tutti fornendo valori %CV <20%. L'unica eccezione a questo è stata la materia 5 titoli IgM per la proteina di membrana, che è stata successivamente esclusa come outlier. I valori di precisione per le valutazioni del soggetto umano sono coerenti con quelli osservati sopra per gli anticorpi del coniglio, il che suggerisce che questi saggi possono essere facilmente riconfigurati per valutare i titoli degli antigeni in più specie con un impatto minimo sulla precisione del test. Come notato sopra, c'è stata un'apparente instabilità nel leggere i valori osservati per i saggi di membrana in cui i valori MFI erano <200, più comunemente nel caso degli isotipi IgA e IgM.

Ottimizzazione della concentrazione di anticorpi primari
Il "tempo di cattura" dell'analita è stato valutato con le perle coniugate con antigene e gli anticorpi nei campioni di plasma o negli standard sono stati testati modificando la durata dell'incubazione primaria (30 min, 1 h, 2 h e 4 h). La differenza tra l'IFM media è presentata come il quoziente di una specifica incubazione e il tempo massimo di incubazione, chiamato % Max., nella Figura 2, tra un'incubazione di 30 minuti (durata minima) e un'incubazione di 4 ore (durata massima). I valori a 120 minuti erano ottimali per i titoli IgG per gli anticorpi Spike S1, Membrane e Nucleocapsid, indicando una cinetica di legame anticorpale primaria veloce, consentendo flessibilità per aumentare la produttività del test. Tuttavia, sono state osservate cinetiche più lente per gli isotipi IgA e IgM (dati non mostrati), dimostrando i livelli di cattura di picco al punto temporale di 4 ore, come mostrato nella Figura 2. Nel complesso, esiste un equilibrio tra l'approccio alla saturazione del saggio e l'opportunità di tempo pratico per l'esecuzione di ciascun test durante la produzione (per massimizzare la produttività). Con questo, in questi risultati sono stati osservati segnali adatti per scopi quantitativi a tempi di incubazione minimi di 30 minuti per IgG, 60 minuti per IgM e 120 minuti per IgA.

Ottimizzazione della concentrazione di anticorpi secondari
Sono state testate cinque concentrazioni di anticorpi secondari (IgG anti-umana di capra, coniugato con PE; IgA anti-umano di capra, coniugato con PE; IgM anti-umano di capra, coniugato SB) (0,5, 1, 2, 4 e 8 μg / mL). Tutti gli anticorpi hanno rivelato ampi intervalli di segnale, senza un'evidente saturazione del segnale in nessuna condizione, garantendo così una misurazione lineare per una qualsiasi delle concentrazioni. Ad esempio, il segnale medio generato dal test Spike S1 utilizzando IgM anti-umani di capra, coniugato SB a 0,5 μg/mL era il 13,2% dell'IFM generato dal segnale massimo (8 μg/mL), mentre l'IFM generata da 4 μg/mL era il 73,3% dell'IFM manifestata al segnale massimo. I dettagli della gamma di segnali provenienti dagli altri isotipi degli anticorpi Spike S1, degli anticorpi di membrana e degli anticorpi nucleocapsidi sono inclusi nella Tabella 5 e nella Figura 3. Come punto pratico, l'impatto primario tra la concentrazione ottimale di anticorpi secondari e la concentrazione di anticorpi secondari 4 μg/mL precedentemente dichiarata si riflette in termini di sensibilità del saggio e costo del test. Cioè, una concentrazione di anticorpi secondari di 8 μg / mL può essere desiderabile per l'applicazione con titoli anticorpali bassi o basse quantità di campione prezioso, ma il costo associato a questi saggi sarebbe considerevolmente superiore all'uso della concentrazione di 4 μg / mL precedentemente definita. Inversamente, i casi in cui si osservassero titoli anticorpali elevati (come individui che hanno subito vaccinazioni Covid-19 o con quantità non limitanti di sieri) vedrebbero un rapporto costi-benefici attraverso l'applicazione delle quantità inferiori di anticorpi secondari (ad esempio, 1 μg / mL).

Ottimizzazione dell'incubazione degli anticorpi secondari
La potenziale influenza della durata dell'incubazione dell'anticorpo secondario è stata studiata anche modificando la durata dell'incubazione (15, 30, 60 e 120 min). Generalmente, la differenza tra l'IFM media presentata come il quoziente di un'incubazione specifica e il tempo massimo di incubazione, denominato %Max, tra un'incubazione di 15 minuti (durata minima) e un'incubazione di 120 minuti (durata massima) non ha superato il 30%, il 55% e il 50% rispettivamente per gli anticorpi Spike S1, membrana e nucleocapside, indicando una fase cinetica veloce nel legame anticorpale secondario e un mezzo per aumentare la produttività del saggio. La Tabella 6 include dettagli sulle variazioni del segnale per tutti i tempi di incubazione. Le illustrazioni dei segnali osservati da diverse incubazioni di questa analisi sono mostrate nella Figura 4.

Prestazioni e specificità del doppio canale
Per ogni analita, una singola esecuzione del formato reporter (solo IgG-PE, solo IgA-PE o solo IgM-SB) è stata confrontata con il segnale generato per lo stesso analita quando è stato eseguito in un formato dual-reporter (ad esempio, Spike S1 IgG-PE solo contro Spike S1 IgG-PE in combinazione con Spike S1 IgM-SB nel formato dual-reporter). La precisione del saggio (espressa in %CV) per i segnali creati nei due formati è stata utilizzata per analizzare la relazione nei risultati di questo esperimento. I valori %CV dei saggi Spike S1 erano rispettivamente del 6,19%, 16,4% e 23% per IgM, IgG e IgA. Per il test di membrana, i valori %CV erano rispettivamente del 3,3%, 7,9% e 16,4% per IgM, IgG e IgA. Infine, il test Nucleocapsid ha fornito valori %CV all'8,7%, 10,3% e 24,2% rispettivamente per IgM, IgG e IgA. I valori di precisione osservati per gli isotipi IgM e IgA suggeriscono che un tempo di incubazione più lungo può conferire risultati di test superiori a causa delle note differenze cinetiche di legame tra queste classi di immunoglobuline. La Figura 4 mostra l'accordo tra i formati delle diverse concentrazioni di anticorpi secondari.

Per confermare la specificità dei canali reporter, un singolo canale reporter è stato testato contemporaneamente mentre l'altro canale è stato assegnato come vuoto per informarsi sul segnale non specifico (effetto sanguinamento). Questi risultati indicano che c'è una trascurabile contaminazione cross-signal tra i due canali reporter, data l'elevata specificità in tutto lo spettro delle condizioni. Questi risultati sono illustrati nella Figura 5. Nel complesso, abbiamo osservato un'interferenza del 6,45% tra il canale 1 e il canale 2. Tuttavia, quando è stata presa in considerazione l'entità dei segnali, abbiamo osservato i seguenti potenziali livelli di interferenza in modalità dual reporter: Spike IgG / IgM al 71,98%, Spike IgA / IgM al 28,11%; Membrana IgG/IgM al 7,41%, Membrana IgA/IgM al 134,61%; e Nucleocapsid IgG/IgM al 146,03%, Nucleocapsid IgA/IgM al 112,13%. Nella configurazione specificata, ciò richiederebbe la misurazione di Spike IgM in combinazione con l'isotipo IgA, L'IgM di membrana con l'isotipo IgM e le misurazioni nucleocapsidi non eseguite in un formato a doppio canale. Questa scoperta potrebbe richiedere l'esplorazione dell'inversione della strategia di etichettatura in base alla quale IgA e IgG devono essere misurate nel canale 2 e IgM nel canale 1.

Valutazione degli eventi di sieroconversione a seguito della vaccinazione Covid-19
La sieroconversione è stata monitorata in quattro soggetti dopo la valutazione di IgA, IgM e IgG con il test Spike S1 in momenti che vanno dalla pre-vaccinazione a quattro mesi dopo il completamento della serie di vaccinazioni Covid-19. Le misurazioni sono state effettuate in modalità a doppio canale (IgG / IgM e IgA / IgM, con valori IgM medi). Tutti i soggetti hanno ricevuto il vaccino come immunizzazione in 2 fasi, secondo la pratica standard, con un intervallo di 21 giorni tra la prima e la seconda dose. I grafici della risposta immunitaria di ciascun soggetto sono mostrati nella Figura 6A-C. I valori di risposta immunitaria per gli antigeni nucleocapside e di membrana sono stati osservati a livelli di fondo per tutte le immunoglobuline valutate (dati non mostrati), il che era coerente con i soggetti che non avevano documentato una precedente infezione da SARS-CoV-2 nel tempo precedente la vaccinazione. Nel complesso, i valori di Spike S1 IgA e IgM osservati erano circa 40 volte inferiori ai titoli isotipi IgG, con titoli di picco che aumentavano non appena 14 giorni per entrambi gli isotipi IgM e IgG e l'isotipo IgA raggiungeva i titoli di picco tra il tempo della seconda dose (giorno 0) e 14 giorni dopo la seconda dose, a seconda del soggetto. In particolare, i titoli Spike S1 IgG iniziano a decadere nel corso dei quattro mesi successivi al completamento della vaccinazione a un tasso altamente variabile, in modo dipendente dal soggetto.

Figura 1: Curve standard rappresentative a 3 plex. Curve standard rappresentative per i tre analiti; presentato come una curva di diluizione seriale 1:5 a 7 punti a partire da (A) 1 μg/mL per Spike S1, (B) 5 μg/mL per Membrana e (C) 1 μg/mL per Nucleocapside e anticorpi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Ottimizzazione del tempo di incubazione dell'anticorpo primario/campione: il segnale MFI medio prodotto da diversi tempi di incubazione di anticorpi/campioni primari (cattura anticorpale) che vanno da 30 minuti a 4 ore per gli standard 1-7 (come indicato nella Tabella 1). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Ottimizzazione della concentrazione di anticorpi secondari e prestazioni a doppio canale. Le curve illustrano l'IFM media (normalizzata al valore più alto registrato nella serie) prodotta da concentrazioni di anticorpi secondari testati, comprese tra 0,5-8 μg/ml. Ogni istanza è stata eseguita sia come test a canale singolo che a doppio canale per apprezzare le differenze nel formato sperimentale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Ottimizzazione del tempo di incubazione degli anticorpi secondari, formato a doppio canale. Grafici rappresentativi dei valori MFI osservati (normalizzati al valore più alto registrato nella serie) rispetto al tempo di incubazione con anticorpi secondari. Gli esperimenti sono stati eseguiti come saggi a doppio canale come combinazioni (A-C) IgA / IgM o (D-F) IgG / IgM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Valutazioni di specificità per saggi a doppio canale. Risultati del test del formato di saggio a doppio canale con uno di ogni combinazione designato come vuoto per illustrare la mancanza di fluorescenza o interferenza cross-channel. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Illustrazione della sieroconversione a seguito della vaccinazione Covid-19. Grafici che illustrano i titoli relativi degli anticorpi (A) IgG, (B) IgM e (C) IgA per l'antigene Spike S1 durante il corso della vaccinazione Covid-19 (Pre-vaccinazione - 4 mesi dopo il completamento); il tempo è indicato in giorni relativi al completamento della serie di vaccinazioni; sono indicati i punti generali della somministrazione del vaccino (linee rosse). Gli esperimenti sono stati eseguiti in modalità a doppio canale, come descritto nel Protocollo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Numero Standard	Serie di diluizione	Anti-Spike S1 o N (μg/mL)	Anti-membrana (μg/mL)
Vuoto	Vuoto	-	-
1	STD7 1:1	1	5
2	STD6 1:5	0.2	1
3	STD5 1:25	0.04	0.2
4	STD4 1:125	0.008	0.04
5	STD3 1:625	0.0016	0.008
6	STD2 1:3125	0.00032	0.0016
7	STD1 1:15625	0.000064	0.00032

Tabella 1: Serie di diluizione per curve standard: Tabella dei fattori di diluizione utilizzati per le curve standard per il sierotipo IgG; presentato come una curva di diluizione seriale 1:5 a 7 punti a partire da 1 μg/mL per α-Spike S1 e α-Nucleocapsid e 5 μg/mL per gli anticorpi α-Membrana.

Analita	Campione	Rep 1	Rep 2	Rep 3 ·	Rep 4	Ave	Sd	%CV
Picco S1	STD2 ·	369.4	356.9	295.2	271.5	323.3	47.4	14.6
	STD5 ·	3869.1	3437	3970.2	4240.7	3879.3	334	8.6
Membrana	STD2 ·	40.6	37.7	49.9	27.8	39	9.1	23.3
	STD5 ·	733.2	731.3	724	678.1	716.7	26	3.6
Nucleocapside	STD2 ·	1746.7	1790.8	1577.3	1664.8	1694.9	94.2	5.6
	STD5 ·	15598.1	14735.5	18369.5	17408.5	16527.9	1657.7	10

Tabella 2: Precisione intradosaggio: Coefficiente percentuale di varianza (%CV) calcolato da quattro repliche di miscele di anticorpi standard allo standard 2 (STD2) e allo standard 5 (STD5) con un singolo lotto di test nello stesso esperimento. I valori forniti per le repliche e le medie rappresentano i valori delle IFM osservati.

Analita	Campione	Lotto 1	Lotto 2	Lotto3	Ave	Sd	%CV
Picco S1	STD2 ·	383.2	424.4	379.9	395.8	24.8	6.3
	STD5 ·	5639.7	6062.5	6384.3	6028.8	373.4	6.2
Membrana	STD2 ·	39.1	58.5	59.1	52.2	11.4	21.8
	STD5 ·	732.3	941.4	701.1	791.6	130.7	16.5
Nucleocapside	STD2 ·	1342.6	1621	1718.2	1560.6	195	12.5
	STD5 ·	13543.9	14843.2	17883.4	15423.5	2227.2	14.4

Tabella 3: Precisione inter-saggio con campioni standard: Coefficiente percentuale di varianza (%CV) calcolato da tre distinti lotti di saggi, valutati allo standard 2 e allo standard 5 nello stesso esperimento. I valori forniti per le repliche e le medie rappresentano i valori delle IFM osservati.

		IgG-PE		IgM-SB		IgA-PE
		Ave. MFI	%CV	Ave. MFI	%CV	Ave. MFI	%CV
Picco S1	Oggetto 1	8002.3	17.7	1949.5	1.3	2045.8	5.5
	Oggetto 2	19155.8	7.3	918.6	4.1	1684.5	3.9
	Oggetto 3	17865.6	18.0	549.4	3.8	961.3	8.1
	Oggetto 4	11901.1	2.6	1603	4.8	8736.4	5.5
	Oggetto 5	9801.8	4.0	1014.1	3.0	2747.6	9.3
Nucleocapside	Oggetto 1	15097.8	11.3	1049.7	9.9	5276.5	3.9
	Oggetto 2	15204.3	12.1	265.9	5.2	6761.3	11.9
	Oggetto 3	18471.7	24.4	329.1	4.5	14308	2.9
	Oggetto 4	16424.7	3.5	2418.1	0.1	4234.7	4.2
	Oggetto 5	13344.9	3.6	225.6	10.0	13436.5	9.7
Membrana	Oggetto 1	514.6	8.6	180.6	14.0	141.2	9.8
	Oggetto 2	196.8	5.2	57	20.7	55.5	13.0
	Oggetto 3	553.7	12.9	54.5	21.2	191.2	18.6
	Oggetto 4	377.9	3.2	68.1	22.1	62	2.3
	Oggetto 5	325.4	8.2	11.4	91.6	74.6	20.8

Tabella 4: Precisione inter-saggio con campioni umani: Coefficiente percentuale medio di varianza (%CV) calcolato da tre lotti di saggi testati con campioni di plasma (diluiti 500 volte) da cinque soggetti umani con infezioni da SARS-CoV-2.

		Picco S1		Membrana		Nucleocapside
	μg/mL	Ave. MFI	% Max.	Ave. MFI	% Max.	Ave. MFI	% Max.
Igm	0.5	186	13.2	32	25.2	132.7	13.6
	1	304.2	21.6	45.8	36	194.4	19.9
	2	664.5	47.2	78.8	61.9	458.2	47
	4	1032.1	73.3	101.3	79.6	707.8	72.6
	8	1407.1	100	127.2	100	975	100
IgG	0.5	809.7	4.9	27.5	15	1355.6	6.3
	1	1696.9	10.2	40.6	22.2	2782.1	13
	2	4543.8	27.3	68.3	37.3	6661.2	31.2
	4	10003.5	60	110.7	60.5	12605.6	59
	8	16662.8	100	182.9	100	21360.6	100
IgA	0.5	797.4	19.3	31.1	47.2	2056.5	16.1
	1	1529.5	37	41.4	62.8	3869	30.4
	2	2261.3	54.7	48.6	73.3	6648.9	52.2
	4	2320.4	56.2	48.3	73.2	6548.1	51.4
	8	4132.2	100	65.9	100	12744.8	100

Tabella 5: Ottimizzazione della concentrazione di anticorpi secondari: Il segnale MFI medio prodotto da diverse concentrazioni di anticorpi secondari che vanno da 0,5 μg/mL a 8 μg/mL. Il valore di ciascun segnale è anche presentato come percentuale del segnale a 8 μg/mL ("Max.") per dimostrare la grandezza relativa del segnale.

		Picco S1		Membrana		Nucleocapside
	Tempo di incubazione (min.)	Ave. MFI	% Max.	Ave. MFI	% Max.	Ave. MFI	% Max.
Igm	15	1185	72.2	40.4	48.9	609.5	53.3
	30	1416.6	86.3	58.4	70.7	894.2	78.2
	60	1324.8	80.7	73.6	89.1	945.6	82.7
	120	1641.2	100	82.6	100	1143.2	100
IgG	15	12917.6	80.5	244.4	44.9	15429.8	80.8
	30	14915.4	92.9	434.7	79.9	18797	98.5
	60	15340.3	95.6	421.4	77.5	18694.4	97.9
	120	16050.3	100	544	100	19085.8	100
IgA	15	3141.9	78.2	75	66.8	9103	86.6
	30	3569.1	88.8	83.9	74.8	9563.8	91
	60	3539.1	88	86	76.6	9555.7	90.9
	120	4020	100	112.2	100	10512.9	100

Tabella 6: Ottimizzazione del tempo di incubazione degli anticorpi secondari: Il segnale MFI medio prodotto da diversi tempi di incubazione di anticorpi secondari che vanno da 15 min a 120 min. Il valore di ciascun segnale è anche rappresentato come percentuale del segnale a 120 minuti ("Max.") per dimostrare la grandezza relativa del segnale.

Discussione

L'apprezzamento di una risposta immunitaria all'esposizione a SARS-CoV-2, in combinazione con la sorveglianza dello stato di infezione basata su RT-PCR, è stato ben descritto come una prescrizione per chiarire il corso di recupero da Covid-19, per servire come mezzo per identificare il plasma convalescente con potenziale valore terapeutico e per esaminare i tassi di infezione su scala di popolazione^10,11. Diversi esempi di comprensione della sieroconversione in soggetti umani includono array di proteine (antigene)¹², immunoblots¹³, costrutti immunocromatografici rapidi¹⁴ e saggi immunoassorbenti enzimatici (ELISA)15,16,17. Ognuna di queste tecniche di cui sopra può valutare più isotipi di immunoglobuline individualmente con piccole modifiche. Queste procedure, tuttavia, non sono in grado di essere praticamente riproposte per consentire l'analisi parallela di più isotipi, come presentato in questo manoscritto, rendendo i fattori di costo e throughput come limitazioni per la loro amministrazione su una strategia di test su scala basata sulla popolazione. Molte di queste applicazioni offrono anche l'opportunità di concatenare livelli di antigeni multipli in parallelo come presentato o in formati alterati, come un multiplex ELISA^18,19. Infine, la piattaforma immunobead fornisce la possibilità di valutare i livelli di antigeni multipli in parallelo^20,21, ma è stata limitata a un singolo epitopo (cioè isotipo di immunoglobuline) per test a meno che, tuttavia, non venga utilizzato il recente strumento con capacità di analisi "a doppio canale".

In questo rapporto, vengono enumerati protocolli che stabiliscono la misurazione affidabile di più epitopi in un test immunobead utilizzando lo strumento in modalità "dual-channel" in un caso di studio di sieroconversione di individui vaccinati covid-19. Il metodo ha dimostrato un'eccellente precisione (%valori CV in genere <20%) utilizzando progetti di test manuali che possono essere migliorati con l'integrazione di sistemi automatizzati di laboratorio. La sensibilità del saggio e la gamma dinamica per tutti gli analiti ed epitopi selezionati erano adatti per le valutazioni di routine. Sebbene la mancanza di immunoregenti antiantigeni IgA e IgM disponibili in commercio abbia limitato la quantificazione all'isotipo IgG, tale restrizione non preclude la capacità di offrire valutazioni o valutazioni semiquanti quantitative relative a un campione specifico come calibrante^22,23.

Il test immunobead convalidato è stato assegnato per studiare la sieroconversione in una coorte di individui immunizzati con il vaccino Covid-19. A differenza di altre piattaforme simili, la famiglia di strumentazione consente la prospezione di sieroconversione in centinaia di individui al giorno in un flusso di lavoro manuale e migliaia al giorno in uno schema automatizzato. Nel complesso, questi risultati confermano che l'approccio "a doppio canale" ha una sensibilità appropriata per la descrizione di più epitopi in parallelo per il test identico ed è praticabile in un contesto multianalitico. Una differenza di sensibilità al canale 1 e al canale 2, come eseguita rispettivamente con fluorofori ficoeritrina e Super Bright 436, può giustificare la progettazione di un esperimento specifico per garantire che vengano acquisiti risultati analitici validi per un determinato esperimento. Cioè, la riserva del canale 1 per epitopi o analiti di una prevalenza inferiore può essere necessaria per mantenere un intervallo dinamico del test che includa i valori osservati di incognite. Al di là di questa considerazione, la progettazione del saggio era ovvia e dovrebbe essere facilmente accessibile ai laboratori con capacità analitiche limitate. Certamente, questa considerazione dovrebbe essere soppesata quando si considera l'interferenza da canale 1 a canale 2, come abbiamo notato per la Figura 5, per cui l'interferenza da isotipi di maggiore abbondanza può causare errori analitici fuorvianti per quelli in abbondanza molto inferiore se misurati in un formato a doppio canale. Questo potenziale di interferenza con situazioni con concentrazioni di analita molto diverse può rappresentare una limitazione significativa all'approccio se non gestito correttamente nella fase di progettazione del saggio.

In conclusione, è stato presentato un metodo per misurare rapidamente i titoli anticorpali dei principali isotipi di immunoglobuline associati a una risposta immunitaria all'infezione o alla vaccinazione da Covid-19. L'applicazione di questo approccio in modo longitudinale per valutare la sieroconversione può fornire approfondimenti che potrebbero essere meglio utilizzati per gestire e / o monitorare il decorso della malattia o, in alternativa, guidare i potenziali programmi di richiamo del vaccino Covid-19.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastre per microtitolazione in polistirene nero a 384 pozzetti	Thermo Fisher	12-565-346
Tampone di attivazione (0,1 M NaH2PO4, pH 6,2)	Preparato internamente
Tampone di saggio (PBS, 1% albumina sierica bovina, 0,01% polisorbato-20)	Preparato internamente
Albumina sierica bovina, frazione di shock termico	MilliporeSigma	A-7888-50G
Tampone di accoppiamento (50 mM MES, pH 5.0)	Preparato internamente
COVID 19 M Coronavirus Recombinant Matrix Protein (6xHis tag)	MyBioSource	MBS8574735
Puntali
EDC (1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimmide cloridrato)	Thermo Fisher	PIA35391
Albumina di capra, Frazione V in polvere	MilliporeSigma	A2514-1G
IgA Capra anti-umano, R-PE, Thermo Fisher policlonale		OB205009
IgG Capra anti-umano, R-PE, Thermo Fisher policlonale		OB204009
IgG Capra anti-coniglio, R-PE, Thermo Fisher policlonale		OB403009
IgM capra anti-umano, R-PE, Thermo Fisher policlonale
IgM Mouse anti-Human, SB 436, Clone SA-DA4	Thermo Fisher	62999842
Instrument Analyzer	Luminex Corp.	INTELLIFLEX-RUO
(1,5 mL)	Thermo Fisher	13-698-794
Microsfere MagPlex-C, Regione XXX	Luminex Corp.	MC10XXX-01
MES idrato (2-(N-Morpholino) etano acido solfonico idrato)	MilliporeSigma	M2933
Nastro sigillante in alluminio per micropiastre	Thermo Fisher	07-200-683
Polisorbato-20	Thermo Fisher	BP337-500
Quality Biological Inc. PBS, pH 7.2	Thermo Fisher	50-751-7328
Tampone di estinzione (PBS, 1% albumina sierica di capra, 0,01% polisorbato-20)	Preparato in casa
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Proteina nucleocapside (His tag)	Sino Biologicals	40588-V08B
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Protein (S1 Subunit, His tag)	Sino Biologicals	40591-V08H
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike RBD Antibody, coniglio pAb	Sino Biologicals	40592-T62
Anticorpo nucleocapside SARS-CoV-2 (2019-nCoV), anticorpo monoclonale di coniglio	Sino Biologicals	40588-R0004
anticorpo di membrana (IN) SARS-CoV-2 (COVID-19), anticorpo di membrana (IN) pAb di coniglio	ProSci	10-516
Sulfo-NHS (N-idrossisulfosuccinimide)	Thermo Fisher	PIA39269
Wash Buffer (PBS, 0,01% polisorbato-20)	Preparato internamente
Acqua, grado LC/MS	Thermo Fisher	W-64