Articolo metodologico

Screening della libreria di shRNA in pool per identificare i fattori che modulano un fenotipo di resistenza ai farmaci

2.9K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/63383

⸱

17 giugno 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Haematology, Christian Medical College, 2Department of Biotechnology, Thiruvalluvar University, 3Centre for Stem Cell Research, Christian Medical College

In questo articolo

Sommario

Lo screening dell'interferenza dell'RNA ad alto rendimento (RNAi) utilizzando un pool di shRNA lentivirali può essere uno strumento per rilevare bersagli letali sintetici terapeuticamente rilevanti nelle neoplasie maligne. Forniamo un approccio di screening dello shRNA aggregato per studiare gli effettori epigenetici nella leucemia mieloide acuta (LMA).

Abstract

Comprendere i meccanismi driver clinicamente rilevanti della chemio-resistenza acquisita è fondamentale per chiarire i modi per aggirare la resistenza e migliorare la sopravvivenza nei pazienti con leucemia mieloide acuta (LMA). Una piccola frazione di cellule leucemiche che sopravvivono alla chemioterapia hanno uno stato epigenetico pronto a tollerare l'insulto chemioterapico. Un'ulteriore esposizione alla chemioterapia consente a queste cellule persistenti di raggiungere uno stato epigenetico fisso, che porta a un'alterata espressione genica, con conseguente proliferazione di queste popolazioni resistenti ai farmaci e infine malattia recidivante o refrattaria. Pertanto, identificare le modulazioni epigenetiche che richiedono la sopravvivenza delle cellule leucemiche resistenti ai farmaci è fondamentale. Descriviamo in dettaglio un protocollo per identificare i modulatori epigenetici che mediano la resistenza all'analogo nucleosidico citarabina (AraC) utilizzando lo screening della libreria di shRNA aggregato in una linea cellulare AML resistente alla citarabina acquisita. La libreria è composta da 5.485 costrutti shRNA mirati a 407 fattori epigenetici umani, che consentono lo screening dei fattori epigenetici ad alto rendimento.

Introduzione

Le opzioni terapeutiche nella leucemia mieloide acuta (LMA) sono rimaste invariate per quasi gli ultimi cinque decenni, con citarabina (AraC) e antracicline come pietra angolare per il trattamento della malattia. Una delle sfide per il successo della terapia AML è la resistenza delle cellule staminali leucemiche alla chemioterapia, che porta alla recidivadella malattia 1,2. La regolazione epigenetica svolge un ruolo vitale nella patogenesi del cancro e nella resistenza ai farmaci, e diversi fattori epigenetici sono emersi come promettenti bersagli terapeutici 3,4,5. I meccanismi di regolazione epigenetica influenzano la proliferazione e la sopravvivenza in caso di esposizione continua a farmaci chemioterapici. Studi su tumori maligni non ematologici hanno riportato che una piccola frazione di cellule che superano l'effetto del farmaco subisce varie modificazioni epigenetiche, con conseguente sopravvivenza di quelle cellule 6,7. Tuttavia, il ruolo dei fattori epigenetici nel mediare la resistenza acquisita alla citarabina nella LMA non è stato esplorato.

Lo screening ad alto rendimento è un approccio alla scoperta di farmaci che ha acquisito importanza globale nel tempo ed è diventato un metodo standard in diversi aspetti per identificare potenziali bersagli nei meccanismi cellulari, per la profilazione dei percorsi e a livello molecolare 8,9. Il concetto di letalità sintetica coinvolge l'interazione tra due geni in cui la perturbazione di uno dei due geni da solo è praticabile ma di entrambi i geni provoca contemporaneamente la perdita di vitalità10. Sfruttare la letalità sintetica nel trattamento del cancro potrebbe aiutare a identificare e caratterizzare meccanicamente robuste interazioni genetiche sintetiche letali11. Abbiamo adottato un approccio combinatorio di screening shRNA ad alto rendimento con letalità sintetica per identificare i fattori epigenetici responsabili della resistenza acquisita alla citarabina nella LMA.

Le leucemie acute guidate dalla traslocazione cromosomica del gene della leucemia a lignaggio misto (MLL o KMT2A) sono note per essere associate a scarsa sopravvivenza nei pazienti. I prodotti chimerici risultanti dei riarrangiamenti genici MLL , cioè le proteine di fusione MLL (MLL-FP), possono trasformare le cellule staminali / progenitrici ematopoietiche (HSPC) in blasti leucemici con il coinvolgimento di più fattori epigenetici. Questi regolatori epigenetici costituiscono una rete complicata che detta il mantenimento del programma di leucemia e, quindi, potrebbero formare potenziali bersagli terapeutici. In questo contesto, abbiamo utilizzato la linea cellulare MV4-11 (che ospita il gene di fusione MLL MLL-AF4 con la mutazione FLT3-ITD; definita come MV4-11 P) per sviluppare la linea cellulare resistente alla citarabina acquisita, definita come MV4-11 AraC R. La linea cellulare è stata esposta a dosi crescenti di citarabina con recupero intermittente dal trattamento farmacologico, noto come vacanza farmacologica. La concentrazione inibitoria semi-massimale (IC50) è stata valutata mediante test di citotossicità in vitro .

Abbiamo utilizzato la libreria di shRNA epigenetica aggregata (vedi Tabella dei materiali) guidata dal promotore hEF1a con una spina dorsale lentivirale pZIP. Questa libreria comprende shRNA mirati a 407 fattori epigenetici. Ogni fattore ha 5-24 shRNA, con un totale di 5.485 shRNA, tra cui cinque shRNA di controllo non mirati. L'impalcatura miR-30 "UltrmiR" modificata è stata ottimizzata per un'efficiente biogenesi ed espressionedello shRNA primario 12,13.

Lo schema di questo esperimento è illustrato nella Figura 1A. L'attuale protocollo si concentra sullo screening RNAi utilizzando la libreria shRNA del fattore epigenetico nella linea cellulare MV4-11 AraC R (Figura 1B), una linea cellulare in sospensione. Questo protocollo può essere utilizzato per lo screening di qualsiasi libreria mirata in qualsiasi linea cellulare resistente ai farmaci di propria scelta. Va notato che il protocollo di trasduzione sarà diverso per le cellule aderenti.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

Seguire le linee guida dell'Institutional Biosafety Committee (IBSC) e utilizzare la struttura appropriata per gestire il lentivirus (BSL-2). Il personale deve essere adeguatamente addestrato alla manipolazione e allo smaltimento del lentivirus. Questo protocollo segue le linee guida sulla biosicurezza del Christian Medical College, Vellore.

1. Selezione del promotore più potente per ottenere un'espressione persistente e prolungata degli shRNA

NOTA: È essenziale eseguire un esperimento di trasduzione utilizzando vettori lentivirali con diversi promotori che esprimono proteine di fluorescenza per identificare il promotore che fornisce un'espressione stabile e a lungo termine di shRNA nella linea cellulare selezionata per l'esperimento. I promotori più comunemente usati per questo scopo sono i promotori hEF1α (fattore di allungamento umano 1α), hCMV (citomegalovirus umano) e SSFV (virus della formazione del focus della milza) che esprimono la proteina di fluorescenza verde (GFP) (Figura 2A).

  1. Eseguire il conteggio delle celle utilizzando il metodo di esclusione blu trypan. Sospendere le celle MV4-11 AraC R in mezzo RPMI al 10% (RPMI con 10% FBS integrato con 100 U/mL di penicillina e 100 U/mL di streptomicina) contenenti 8 μg/mL di polibrene. Seme 1 x 106 cellule in 1,5 mL di medio/pozzetto di una piastra a sei pozzetti in triplicati.
  2. Aggiungere diversi volumi di lentivirus concentrati (ad esempio, 10 μL, 20 μL e 40 μL a seconda del titolo dei lentivirus) a ciascun pozzetto. Ruotare delicatamente il piatto per mescolare il contenuto.
  3. Eseguire spinfection per centrifugazione a 920 x g a 37 °C per 90 min.
  4. Incubare immediatamente le piastre in un incubatore a CO2 (5% CO2 a 37 °C).
  5. Osservare l'espressione GFP dopo 48 ore al microscopio a fluorescenza per garantire una trasduzione di successo.
  6. Quantificare l'espressione GFP mediante citometria a flusso dopo 72 ore per valutare l'efficienza di trasduzione.
  7. Coltivare le cellule per un totale di 2 settimane e monitorare periodicamente l'espressione della GFP mediante citometria a flusso. La riduzione dell'espressione GFP misurata dall'intensità media di fluorescenza e dalla percentuale di cellule GFP+ indica il silenziamento del promotore.
  8. Ordinare le cellule GFP + il 10 ° giorno e coltivare le cellule per 1 settimana dopo lo smistamento. Controllare periodicamente l'espressione GFP durante la coltura.
  9. Usa le celle non trasdotte per impostare il cancello. Una popolazione oltre la scala 1 x 101 verso destra sull'asse x è considerata una popolazione positiva per GFP.
  10. Scegli il promotore che mostra un'espressione persistente di GFP nella coltura prolungata delle cellule.

2. Preparazione della libreria di shRNA del fattore epigenetico umano lentivirale aggregato

  1. Coltura di cellule 293T (a basso numero di passaggio con un buon tasso di proliferazione) in tre piastre di coltura cellulare da 10 cm con 8 mL di mezzo DMEM al 10% (DMEM con 10% FBS contenente 100 U/ml di penicillina e 100 U/ml di streptomicina) in ogni piastra.
  2. Una volta che le cellule raggiungono il 60% di confluenza, sostituire il mezzo con un mezzo completo.
  3. Preparare la miscela di trasfezione (come indicato nella Tabella 1) che contiene il mezzo privo di siero, il plasmidio lentivirale (psPAX2) e l'involucro (pMD2.G), i plasmidi della libreria in pool e, infine, il reagente di trasfezione.
  4. Toccare il composto per mescolarlo bene e incubare a temperatura ambiente per 15 min.
  5. Aggiungere la miscela di trasfezione alle celle 293T e mescolare delicatamente facendo roteare le piastre. Incubare le piastre in un incubatore a CO2 (5% CO2 a 37 °C). Cambiare il mezzo dopo 24 ore.
  6. Dopo 48 ore, controllare l'espressione GFP al microscopio a fluorescenza per garantire un'elevata efficienza di trasfezione nelle cellule 293T.
  7. Raccogliere i supernatanti virali dopo 48 ore, 60 ore e 72 ore e conservarli a 4 °C. Aggiungere un mezzo fresco (8 ml) in ogni punto temporale dopo aver raccolto il virus.
  8. Raggruppare i supernatanti del virus. Il volume totale dei virus raggruppati sarà: ~8 mL/piastra x 3 raccolte= ~24 mL/piastra; ~24 mL/piastra x 3 piastre = ~72 mL da 3 piastre.
  9. Filtrare i virus raggruppati con il filtro da 0,4 μm.
  10. Per ottenere un titolo elevato di virus, concentrare i virus raggruppati mediante ultracentrifugazione. Trasferire il surnatante del virus filtrato in due tubi da 70 Ti (32 ml/tubo) e centrifugare a 18.000x g per 2 ore con accelerazione e decelerazione lente. Utilizzare un rotore e una centrifuga preraffreddati a 4 °C.
  11. Estrarre delicatamente i tubi dalla centrifuga e rimuovere completamente il surnatante.
  12. Utilizzando una micropipetta, risospesare delicatamente il pellet in 400 μL di DMEM (senza FBS e antibiotici). Incubare sul ghiaccio per 1 ora e mescolare i pellet da entrambi i tubi.
  13. Aliquotare i virus e congelare a -80 °C.
    NOTA: i tubi e i virus devono essere tenuti sul ghiaccio durante le fasi 2.10.-2.13. Evitare la schiuma mentre si risospende il virus con il mezzo semplice. Il mezzo deve essere mantenuto a 4 °C.
  14. Calcolare la concentrazione (x) del virus come di seguito:
    Volume totale prima della concentrazione = 72 mL (72.000 μL)
    Volume dopo concentrazione = 400 μL
    La concentrazione = 72.000/400= 180x

3. Stima dell'efficienza di trasduzione dei lentivirus

  1. Trasdurre cellule 293T con il virus concentrato in diversi volumi (2 μL, 4 μL, 8 μL) per confermare il successo della preparazione dei lentivirus.
    NOTA: Se i virus concentrati mostrano elevate efficienze di trasduzione (>50%) in piccoli volumi (1-2 μL), è consigliabile diluire il virus concentrato nelle quantità desiderate (da 100x a 75x).
  2. Diluire il virus concentrato a 100 volte con DMEM (senza FBS e antibiotici) per eseguire esperimenti di titolazione nella linea cellulare MV4-11 AraC R.
  3. Semina 1 x 106 celle (linea cellulare MV4-11 AraC R in 1,5 mL di mezzo RPMI al 10% contenente 8 μg/mL di polibrene) in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti. Preparare quattro pozzetti per la trasduzione con diversi volumi di virus.
  4. Aggiungere quattro volumi diversi (ad esempio, 1 μL, 1,5 μL, 2 μL e 2,5 μL) di virus 100x.
  5. Eseguire la spinfettura mediante centrifugazione della piastra a 920 x g per 90 min a 37 °C.
  6. Dopo 72 ore, misurare la percentuale di cellule GFP+ mediante citometria a flusso.
  7. Determinare il volume dei virus per ottenere un'efficienza di trasduzione del 30%. Questa bassa efficienza di trasduzione serve a garantire l'integrazione di un singolo shRNA per cella.

4. Trasduzione della libreria di shRNA epigenetici aggregati nella linea cellulare resistente ai farmaci

  1. Mantenere la linea cellulare target MV4-11 AraC R a una densità di 0,5 x 106 celle/ml. Assicurarsi che le cellule siano nella fase di crescita esponenziale in coltura.
  2. Calcola il numero di cellule da prelevare per l'esperimento come di seguito in base al numero di integranti virali.
    Numero di cellule necessarie per la trasduzione = 5.485 (numero di shRNA) × 500 (rappresentazione shRNA piegata) / 0,25 (MOI) = 10.982.000 ~ 11 x 106 celle
  3. Risospesa 1,1 x 107 celle in 16 mL di supporto RPMI al 10%.
  4. Aggiungere il polibrene (8 μg/mL) e mescolare bene. Quindi, aggiungere il volume richiesto di virus per ottenere un'efficienza di trasduzione del 30% come calcolato nella sezione precedente.
  5. Seminare tutte le cellule su una piastra a sei pozzetti ad una densità di 1 x 106 celle / 1,5 ml di 10% RPMI medio per pozzetto.
  6. Centrifugare la piastra per 90 min a 920 x g a 37 °C.
  7. Incubare la piastra durante la notte in un incubatore a CO2 (5% CO2 a 37 °C).
  8. Dopo 24 ore, cambiare il mezzo e trasferire le cellule trasdotte in un pallone T-75.
  9. Dopo 48 ore, controllare la GFP al microscopio a fluorescenza per garantire una trasduzione di successo.
  10. Dopo 72 ore, quantificare la percentuale di cellule GFP+ mediante citometria a flusso.

5. Arricchimento delle cellule GFP positive

NOTA: Espandere le cellule trasdotte coltivandole ad una densità di 0,5 x 106 cellule/mL per 5-7 giorni. Queste cellule sono una popolazione mista di trasdotti e non trasdotti, selezionati in base alla GFP mediante ordinamento, come menzionato nel passaggio successivo.

  1. Esegui lo smistamento del flusso delle celle trasdotte GFP+ con le impostazioni di ordinamento del flusso impostate come elevata purezza e bassa resa. Usa le celle non trasdotte per impostare il cancello. Una popolazione superiore a 1 x 102 verso destra è considerata una popolazione positiva.
  2. Raccogliere le cellule selezionate in RPMI al 5% (RPMI con FBS al 5% integrato con 100 U/mL di penicillina e 100 U/mL di streptomicina).
  3. Coltivare le cellule selezionate in un mezzo RPMI al 10%.
  4. Dopo 72 ore, eseguire la stima post-ordinamento della percentuale di celle GFP+ per garantire >95% di efficienza di smistamento.
    NOTA: Assicurarsi di ottenere ~ 3-5 x 106 celle GFP positive dopo l'ordinamento per ottenere una rappresentazione da 450x a ~ 500x della libreria shRNA.

6. Screening dropout per identificare i fattori epigenetici che mediano la resistenza ai farmaci

  1. Coltivare le cellule trasdotte della libreria shRNA in RPMI al 10% per un massimo di 5 giorni. Crioconservare le cellule trasdotte per esperimenti futuri, se necessario, prima del trattamento farmacologico.
  2. Centrifugare 1 x 107 celle in duplicati a 280 x g per 5 min a 25 °C. Scartare il surnatante e conservare il pellet a -80 °C. Questi campioni serviranno come riferimento di base per la libreria di shRNA epigenetici.
  3. Coltiva le cellule trasdotte rimanenti come duplicati (R1 e R2), ciascuna mantenuta a un conteggio delle cellule che fornisce una rappresentazione 500x della libreria.
  4. Trattare uno dei duplicati con il farmaco (10 μM citarabina) (R2) e l'altro senza il trattamento farmacologico (R1).
  5. Cambiare il mezzo per i palloni con e senza il farmaco ogni 72 ore. Ripetere il cambio medio 3 volte per un'esposizione cumulativa al farmaco di 9 giorni.
  6. Dopo 9 giorni di trattamento farmacologico, controllare la vitalità delle cellule con il metodo di esclusione del tripano blu.
  7. Centrifugare le celle rimanenti a 280 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Risospesciare le cellule in PBS sterile e lavare le cellule. Centrifugare a 280 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
  8. Scartare il surnatante e conservare il pellet a -80 °C per l'estrazione del DNA.

7. Amplificazione degli shRNA integrati mediante PCR

  1. Estrarre il DNA dalle cellule basali trasdotte (T) (fase 6.2.) e dalle cellule trattate con il farmaco (R2) e non trattate con il farmaco (R1).
  2. Controllare la concentrazione del campione utilizzando un fluorometro.
  3. Calcola la quantità di DNA richiesta per la PCR come di seguito:
    5.485 (n. di shRNA) × 500 (rappresentazione shRNA) × 1 x 6,6−12 (genoma g/diploide) = 15 μg di DNA
  4. Sottoporre i campioni al primo ciclo di PCR.
    NOTA: La miscela di reazione PCR è illustrata nella Tabella 2 con le condizioni del ciclo termico. I dettagli dei primer sono forniti nella tabella supplementare 1.
  5. Impostare reazioni multiple contenenti 850 ng di DNA per tubo (per un totale di 43 reazioni).
    NOTA: Il primo ciclo di PCR amplifica le regioni fiancheggianti dello shRNA con conseguente dimensione dell'amplicon di 397 bp.
  6. Raggruppare i prodotti PCR e purificare i prodotti PCR utilizzando 3-4 colonne di un kit di purificazione gel / PCR standard.
    NOTA: i dettagli sono forniti nella Tabella 3.
  7. Eluire il prodotto in 50 μL di tampone da ciascuna colonna e raggruppare gli eluimenti.
  8. Quantificare il DNA e memorizzarlo a -20 °C.
    NOTA: I reagenti sono tabulati nella Tabella 4 con le condizioni del ciclo termico. La PCR di secondo turno utilizza i primer con la sequenza INDEX necessaria per il multiplexing in NGS in una cella a flusso singolo. Quindi, ogni campione dovrebbe essere contrassegnato con un indice diverso. Le sequenze di primer sono fornite nella tabella supplementare 1.
  9. Impostare quattro reazioni con 500 ng del prodotto PCR primario in un volume totale di reazione di 50 μL per ciascun campione e il controllo negativo.
  10. Caricare l'intero prodotto per l'elettroforesi utilizzando il gel di agarosio TBE al 2% e confermare la dimensione della banda utilizzando una scala molecolare da 1 kb. La dimensione dell'amplicon è 399 bp.
  11. Visualizza i prodotti PCR sul sistema di documentazione del gel.
  12. Asportare la fascia specifica e purificare utilizzando un kit di purificazione in gel.
    NOTA: I calcoli per la purificazione con il kit sono forniti nella Tabella 3.
  13. Eluire in un volume finale di 30 μL di tampone di eluizione. La concentrazione approssimativa di ciascun eluente sarà di circa 80-90 ng/μL con un volume totale di 30 μL.

8. Sequenziamento di nuova generazione e analisi dei dati

  1. Sequenziare il prodotto purificato in gel dal punto 7.13. su un sequencer di nuova generazione (ad esempio, Illumina) per ottenere il conteggio delle letture per gli shRNA esauriti.
  2. Tagliare le sequenze dell'adattatore delle letture FastQ generate utilizzando il kit di strumenti Fastx (versione 0.7).
  3. Allineare le letture filtrate alle sequenze di riferimento utilizzando un allineatore Bowtie con il parametro di consentire due mancate corrispondenze. Assicurarsi che la lunghezza di lettura dopo il taglio dell'adattatore sia di circa 21 bp.
  4. Caricare i file utilizzando il programma Samtools (versione 1.9). Utilizzare l'opzione Flagstat e calcolare il riepilogo dell'allineamento.
  5. Carica i file fastQ tagliati nel software CRISPRCloud2 (CC2) (https://crispr.nrihub.org/) insieme alle sequenze shRNA di riferimento sotto forma di file FASTA ed esegui l'analisi secondo le istruzioni.
    1. Fare clic sul collegamento Avvia analisi nel CC2.
    2. Seleziona il tipo di schermo come schermate Sopravvivenza e Dropout. Impostare il numero di gruppi e digitare il nome di ciascun gruppo.
    3. Carica la libreria di riferimento in formato fasta. I dati caricati vengono elaborati. Fare clic sull'URL di output per ottenere i risultati.
      NOTA: Questo software utilizza un modello beta-binomiale con un t-test di Student modificato per misurare le differenze nei livelli di sgRNA / shRNA, seguito dal test di probabilità combinato di Fisher per stimare il significato a livello genetico. Calcola le variazioni complessive stimatedi log 2 volte (Log2Fc) degli shRNA per i fattori epigenetici tra i campioni trattati (arricchiti / impoveriti) e non trattati (basale) con "valori p" e "valori FDR".
  6. Assicurarsi che il valore FDR sia "Negativo" per una schermata Di estrazione e "Positivo" per una schermata di sopravvivenza.
    NOTA: CC2 è una piattaforma di analisi per contare le letture e calcolare la rappresentazione della piega (arricchimento o esaurimento) degli shRNA tra i campioni.
  7. Identificare gli shRNA significativamente arricchiti e impoveriti (FDR <0.05) dai risultati CC2.
    NOTA: Ci sono 5-24 shRNA contro ogni fattore. Controllare i valori FDR per ciascuno degli shRNA; considerare l'FDR, che è <0.01, e prendere una media per gli shRNA selezionati. Considera i primi 40 successi. Traccia il grafico per i fattori selezionati in base ai valori negativi Log2Fc o FDR. Assicurarsi che gli shRNA non mirati abbiano anche valori FDR significativi per garantire l'autenticità dei dati in quanto fungono da shRNA di controllo.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Il flusso di lavoro di screening complessivo è illustrato nella Figura 1A. La citotossicità in vitro dell'AraC R MV4-11 (48 h) ha rivelato che l'IC50 alla citarabina nell'MV4-11 AraC R è superiore all'MV4-11 P (Figura 1B). Questa linea cellulare è stata utilizzata nello studio come modello per lo screening dei fattori epigenetici responsabili della resistenza alla citarabina.

La Figura 2A...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

L'interferenza dell'RNA (RNAi) è ampiamente utilizzata per gli studi di genomica funzionale, che includono lo screening di siRNA e shRNA. Il vantaggio dello shRNA è che possono essere incorporati in vettori plasmidici e integrati nel DNA genomico, con conseguente espressione stabile e, quindi, abbattimento più prolungato dell'mRNA bersaglio. Uno screening della libreria shRNA in pool è robusto ed economico rispetto agli schermi arrayed convenzionali (siRNA). Identificare l'essenzialità di una specifica classe di proteine...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse e nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo studio è finanziato in parte da una sovvenzione del Dipartimento di Biotecnologie BT/PR8742/AGR/36/773/2013 a SRV; e Department of Biotechnology India BT/COE/34/SP13432/2015 e Department of Science and Technology, India: EMR/2017/003880 to P.B. RVS e P.B. sono supportati rispettivamente da Wellcome DBT India Alliance IA/S/17/1/503118 e IA/S/15/1/501842. S.D. è supportato dalla borsa di studio CSIR-UGC e S.I. è supportato da una borsa di ricerca senior ICMR. Ringraziamo Abhirup Bagchi, Sandya Rani e lo staff del CSCR Flow Cytometry Core Facility per il loro aiuto. Ringraziamo anche MedGenome Inc. per l'aiuto con il sequenziamento ad alto throughput e l'analisi dei dati.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagents
100 bp Ladder Hyper LadderBIOLINEBIO-33025
1kb Ladder Hyper LadderBIOLINEBIO-33056
AgarosioLonza Seachekm50004
Betaina (5mM)SigmaB03001VL
Acido BoricoQualigens12005
Plastica per colture cellulariCorningcome appicable
Citosina β-D-arabinofuranoside cloridratoSigmaC1768-500MG
DMEMMP BIO
DMSOWak Chemie GMBHCryosure DMSO 10ml
EDTASigmaE5134
Bromurodi etidioSigmaE1510-10 mL
Fetale BovinoThermo Fisher Scientific16000044
Kit di Purificazione Gel/PCRMACHEREY-NAGELREF  740609.50
Gibco- RPMI 1640Thermo Fisher Scientific23400021
Acido acetico glacialeThermoQ11007
hCMV GFP PlasmideTransomicsTransOmics Selezione del promotore KIT
hEF1a GFPlasmidTransomicsTransOmics Selezione del promotore KIT
HEK 293TATCCCRL-11268
Linea cellulare HL60ATCCCCL-240
KOD Hot Start PolimerasiMerck71086
Linea cellulare Molm13Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USADana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA
Linea cellulare MV4-11ATCCCRL-9591
Penicillina streptomicinaThermo Fisher Scientific
psPAX2 e pMD2.GAddgene Addgeneplasmide n.12260 & Addgene plasmide n. 12259
Qubit dsDNA HS Kit di testInvitrogenREF Q32854
SFFV  GFP PlasmidTransomicsTransOmics Promoter selection KIT
shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from TransomicsTransomicsCat No. TLH UD7409; Lotto n.: A116. V 132.14
Trans-IT-LTI MirusMirus MirusNumero di catalogo: MIR2300
TrisMP Biomedicals0219485591
Trypan BlueSigma-AldrichT8154-100ML
Ultra provette per centrifugaBeckman Coulter  103319
Attrezzature
5% CO2 incubatoreThermo Fisher
BD Aria III selezionatore cellulareBecton Dickinson
Beckman Coltro Optima L-100K- UltracentrifugazioneCentrifuga coltro
Thermo Multiguge 3SR+
Sistema di imaging ChemiDoc ( Fluro Chem M system)Fluro Chem
Leica AF600
Leica Microscopio otticoZeiss Axiovert 40c
NanodropThermo Scientific
Qubit 3.0 FluorimetroInvitrogen
TermociclatoreBioRad
91233354 Siero 15140122Beckman

Riferimenti

  1. Döhner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
  2. De Kouchkovsky, I., Abdul-Hay, M. Acute myeloid leukemia: A comprehensive review and 2016 update. Blood Cancer Journal. 6 (7), 441(2016).
  3. Zuber, J., et al. RNAi screen identifies Brd4 as a therapeutic target in acute myeloid leukaemia. Nature. 478 (7370), 524-528 (2011).
  4. Shi, J., et al. The Polycomb complex PRC2 supports aberrant self-renewal in a mouse model of MLL-AF9;NrasG12D acute myeloid leukemia. Oncogene. 32 (7), 930-938 (2013).
  5. Chen, C. -W., et al. DOT1L inhibits SIRT1-mediated epigenetic silencing to maintain leukemic gene expression in MLL-rearranged leukemia. Nature Medicine. 21 (4), 335-343 (2015).
  6. Li, F., et al. In vivo epigenetic CRISPR screen identifies Asf1a as an immunotherapeutic target in Kras-mutant lung adenocarcinoma. Cancer Discovery. 10 (2), 270-287 (2020).
  7. Balch, C., Huang, T. H. -M., Brown, R., Nephew, K. P. The epigenetics of ovarian cancer drug resistance and resensitization. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 191 (5), 1552-1572 (2004).
  8. Carnero, A. High throughput screening in drug discovery. Clinical and Translational Oncology. 8 (7), 482-490 (2006).
  9. Lal-Nag, M., et al. A high-throughput screening model of the tumor microenvironment for ovarian cancer cell growth. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 22 (5), 494-506 (2017).
  10. O'Neil, N. J., Bailey, M. L., Hieter, P. Synthetic lethality and cancer. Nature Reviews Genetics. 18 (10), 613-623 (2017).
  11. Hoffman, G. R., et al. Functional epigenetics approach identifies BRM/SMARCA2 as a critical synthetic lethal target in BRG1-deficient cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3128-3133 (2014).
  12. Fellmann, C., et al. An optimized microRNA backbone for effective single-copy RNAi. Cell Reports. 5 (6), 1704-1713 (2013).
  13. Knott, S. R. V., et al. A computational algorithm to predict shRNA potency. Molecular Cell. 56 (6), 796-807 (2014).
  14. Papaemmanuil, E., et al. Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
  15. Vidal, S. J., Rodriguez-Bravo, V., Galsky, M., Cordon-Cardo, C., Domingo-Domenech, J. Targeting cancer stem cells to suppress acquired chemotherapy resistance. Oncogene. 33 (36), 4451-4463 (2014).
  16. Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Modulatori epigeneticiresistenza alla citarabinaleucemia mieloide acutatrasduzione lentiviralecitometria a flussoscreening per selezione negativasequenziamento di nuova generazioneknockdown genico

Articoli correlati