Biotest di applicazione topica per quantificare la tossicità degli insetticidi per zanzare e moscerini della frutta

Summary

Descriviamo la metodologia e l'importanza del biotest di applicazione topica per misurare la suscettibilità agli insetticidi nelle zanzare e nei moscerini della frutta. Il test presentato è ad alto rendimento, utilizza la massa degli insetti, consentendo così di calcolare una dose letale relativizzata alla massa anziché la concentrazione, e probabilmente ha una variabilità inferiore rispetto ad altri metodi simili.

Abstract

L'uso continuato di insetticidi per la salute pubblica e l'agricoltura ha portato a una diffusa resistenza agli insetticidi e all'ostacolo dei metodi di controllo. La sorveglianza della resistenza agli insetticidi delle popolazioni di zanzare viene in genere effettuata attraverso i test biologici delle bottiglie dei Centers for Disease Control and Prevention (CDC) o i test su sondi dell'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS). Tuttavia, questi metodi possono comportare un alto grado di variabilità nei dati di mortalità a causa del contatto variabile dell'insetticida con l'insetto, del numero relativamente piccolo di organismi testati, dell'ampia variazione di massa tra le popolazioni e delle condizioni ambientali in costante cambiamento, portando a risultati variabili. Questo documento presenta il biotest di applicazione topica, adattato come biotest fenotipico ad alto rendimento sia per le zanzare che per i moscerini della frutta, per testare un gran numero di insetti lungo una gamma di concentrazioni di insetticidi.

Questo saggio 1) garantisce un trattamento coerente e il contatto insetticida con ogni organismo, 2) produce curve dose-risposta altamente specifiche che tengono conto delle differenze di massa media tra ceppi e sessi (che è particolarmente importante per gli organismi raccolti sul campo) e 3) consente il calcolo di dosi letali mediane statisticamente rigorose (LD₅₀ ), che sono necessari per il confronto del rapporto di resistenza: un approccio di sorveglianza alternativo dalla mortalità diagnostica della dose, che viene utilizzato anche per la sorveglianza della resistenza ai larvicidi. Questo test sarà uno strumento complementare per fenotipizzare accuratamente le popolazioni di zanzare e, come illustrato utilizzando moscerini della frutta, è facilmente adattabile per l'uso con altri insetti. Sosteniamo che questo test aiuterà a colmare il divario tra resistenza agli insetticidi genotipica e fenotipica in più specie di insetti.

Introduction

Le zanzare sono responsabili di oltre 700.000 morti ogni anno a causa delle malattie che trasmettono agli esseri umani, con oltre la metà di quelle morti dovute alla sola malaria¹. Il principale metodo preventivo contro la trasmissione della malaria e di altre malattie trasmesse da vettori è l'uso di insetticidi, spesso sotto forma di reti insetticide di lunga durata o irrorazione residua interna². Tuttavia, la resistenza agli insetticidi è diffusa tra le zanzare e altri insetti vettori, così come i parassiti agricoli ^3,4. Per gestire efficacemente la resistenza, la sorveglianza è di fondamentale importanza⁵. Per questo, sono necessari metodi di rilevamento della resistenza altamente accurati e ad alta produttività. Attualmente, gli strumenti di sorveglianza della resistenza agli insetticidi più diffusi per le zanzare sono il test del tubo dell'OMS⁶ e il biotest della bottiglia del CDC⁷. Per i moscerini della frutta il metodo di applicazione del contatto residuo (simile al biotest della bottiglia CDC) è un biodosaggio insetticida comunemente usato ^8,9,10. Tuttavia, la variabilità nei dati di questi metodi è in genere elevata, con misurazioni dello stesso ceppo di zanzara di laboratorio che vanno da ~ 20-70% di mortalità nei saggi di bottiglia CDC e 0-50% nei test in prove in prove dell'OMS quando esposti a dosaggi subletali¹¹. Tale variazione è sorprendente perché la limitata variazione genetica nella maggior parte dei ceppi di laboratorio dovrebbe portare a una limitata variazione della suscettibilità agli insetticidi nella popolazione. Tuttavia, c'è ancora un alto livello di variazione osservato nei risultati del biotest.

Le potenziali fonti di questa variazione potrebbero essere il risultato di un'esposizione eterogenea agli insetticidi tra campioni all'interno del biotest a causa dell'esposizione indiretta agli insetticidi attraverso la superficie, degli effetti ambientali eterogenei, della normale variazione biologica tra individui dello stesso genotipo e della variazione della massa di campioni della stessa popolazione¹² . Un metodo usato raramente con una replicabilità più elevata è il biotest di applicazione topica. In questo test, l'insetticida viene applicato direttamente a ciascun insetto^13,14, rimuovendo il fattore di esposizione eterogenea di diversi campioni all'interno dello stesso test. Tuttavia, a causa della natura a lenta produttività di questo metodo, non viene utilizzato abitualmente come strumento di sorveglianza della suscettibilità agli insetticidi per le popolazioni di zanzare. Questo documento presenta un protocollo modificato per il biotest di applicazione topica che consente esposizioni a più alto rendimento, correggendo anche la variazione della massa degli insetti, un parametro correlato ai cambiamenti nella suscettibilità agli insetticidi¹². Una riduzione del rumore e della variazione associata alla massa dei dati di mortalità da esposizione variabile agli insetticidi consentirebbe una sorveglianza tecnica della resistenza più accurata^11,15. Tali dati potrebbero essere utilizzati per associare più accuratamente la resistenza fenotipica con marcatori genetici, parametri di fitness e/o competenza vettoriale. Inoltre, dimostriamo come questo test potrebbe essere facilmente adattato ad altre specie di insetti utilizzando il biotest di applicazione topica sui moscerini della frutta, una specie di insetti di corpo più piccolo.

Il limite principale delle suddette applicazioni di contatto residuo è che l'esposizione agli insetticidi può variare da campione a campione all'interno dello stesso test. Nel caso dei biosaggi delle bottiglie CDC e del metodo di contatto, l'esposizione agli insetticidi può variare tra le repliche dello stesso test. Gli insetti sono esposti a insetticidi che vengono distribuiti all'interno di una bottiglia di vetro (cdc bottle bioassay e metodo di contatto) o su carte impregnate (test della sonda dell'OMS). La concentrazione di insetticida su entrambe le superfici (vetro e carta) è nota e predeterminata mediante lo screening di diverse specie di genotipi noti. Tuttavia, la quantità disponibile per essere potenzialmente assorbita dall'insetto può variare notevolmente a seconda della superficie utilizzata, dei componenti della miscela di insetticidi e di quanto omogeneamente l'insetticida è distribuito sul materiale superficiale^16,17. Nel biotest della bottiglia CDC, il rivestimento insetticida all'interno della bottiglia dipende dalle procedure utilizzate da ciascun laboratorio e utente. Nel test su provetta dell'OMS, le carte trattate con insetticida sono prodotte centralmente e quindi molto probabilmente abbastanza omogenee tra i laboratori. Tuttavia, nel test della sonda dell'OMS, il tubo di esposizione consente ai campioni di atterrare e riposare su reti metalliche non esposte a insetticidi, portando a una potenziale esposizione eterogenea agli insetticidi tra i campioni all'interno di ciascun test. La quantità effettiva di insetticida raccolto e assorbito dai campioni attraverso ciascun metodo deve ancora essere esplorata ulteriormente¹⁸.

Inoltre, il biotest della bottiglia CDC, il test della sonda dell'OMS e il metodo di contatto sono più comunemente usati come saggi di soglia che testano solo una concentrazione di insetticida predeterminata. Questo approccio può rilevare con precisione la presenza di resistenza ed è prezioso per la sorveglianza della resistenza (specialmente quando la resistenza si sta diffondendo). Tuttavia, i saggi di soglia non possono quantificare la forza della resistenza, che potrebbe essere più predittiva dell'efficacia degli strumenti di intervento. Se vengono utilizzate più concentrazioni di insetticidi con questi metodi, possono essere utilizzate come saggi di intensità. I saggi di intensità per il biosasaggio della bottiglia CDC e il test della sonda dell'OMS sono stati introdotti testando 5x e 10 volte i dosaggi discriminanti predeterminati per affrontare questa lacuna nella sorveglianza ^6,19. Pur fornendo una maggiore capacità di distinguere tra popolazioni resistenti, 3-5 dosaggi (predeterminati) forniscono una risoluzione limitata per calcolare le concentrazioni letali. Inoltre, zanzare di varie dimensioni sono utilizzate in tali test. Tuttavia, la massa è importante da misurare in quanto i campioni più grandi potrebbero aver bisogno di una dose più elevata per essere uccisi poiché la dose efficace per unità di massa sarà molto inferiore a quella di un organismo più piccolo¹². Il calcolo di una dose letale relativizzata di massa (quantità di insetticida per massa di insetto) sarebbe una metrica più utile rispetto alla più comune concentrazione letale (ad esempio, quantità di insetticida per superficie) in quanto considera la variazione della massa degli insetti tra sessi, popolazioni e genotipi. Tali dati contribuirebbero a colmare il divario tra resistenza genotipica e fenotipica all'interno del laboratorio e del campo e potrebbero anche fornire un modo semplice per calcolare la concentrazione di applicazione necessaria per trattare una popolazione di insetti di massa media nota.

L'uso di dosaggi letali relativizzati alla massa che uccidono il 50% dei campioni (LD₅₀) incorpora anche molti altri benefici. La valutazione della tossicità di un composto specifico in mg/kg (= ng/mg) è standard nella tossicologia umana e veterinaria¹⁴ e i valori di DL₅₀ si trovano nelle schede di sicurezza dei materiali. I dosaggi letali consentono anche il confronto diretto della tossicità tra diverse sostanze chimiche verso una particolare specie o la stessa sostanza chimica verso diverse specie²⁰, nonché una valutazione di alta qualità di nuovi insetticidi e sostanze chimiche¹³. Inoltre, la LD₅₀ può fornire rapporti di resistenza più significativi e accurati rispetto a quelli derivati dai risultati diagnostici di mortalità della dose, che possono comportare una sovrastima del livello di resistenza presente in una popolazione. Pertanto, questo test sarebbe adatto per i programmi di sorveglianza di routine fornendo un monitoraggio della resistenza più rigoroso basato su dosi letali relativizzate alla massa derivate da più campioni di quanto raccomandato per altri saggi biologici²¹.

Il metodo di applicazione topica è stato utilizzato nella sorveglianza della suscettibilità agli insetticidi per zanzare e mosche come alternativa ai biotest standard di suscettibilità agli insetticidi quando la resistenza è già nota o sospetta^22,23, nonché per la sorveglianza in alcuni insetti nocivi²⁴ per valutare più accuratamente i profili di resistenza e la tossicità intrinseca degli insetticidi²¹ . Nei biosaggi di applicazione topica, l'insetticida viene applicato a ciascun organismo, con conseguente variazione minima nell'esposizione all'insetticida. Questo documento presenta un metodo leggermente adattato e migliorato che consente di applicare l'esposizione agli insetticidi a un gran numero di insetti in un breve periodo, controllando anche la massa degli insetti²². Questo metodo a più alto rendimento con buoni livelli di replicabilità potrebbe essere un utile strumento aggiuntivo per la sorveglianza di routine della suscettibilità agli insetticidi.

Protocol

NOTA: gli insetticidi possono causare pericoli per l'uomo, gli animali e l'ambiente²⁵. Cautela, formazione e dispositivi di protezione individuale sono altamente consigliati. Assicurarsi di seguire le schede di sicurezza dei materiali per tutti gli insetticidi e solventi utilizzati.

1. Esemplari posteriori

1. Zanzare adulte posteriori di 3-5 giorni.
   NOTA: Il protocollo che segue riflette le condizioni per l'allevamento di Aedes aegypti , seguendo da vicino le linee guida²⁶ dell'Organizzazione delle Nazioni Unite per l'alimentazione e l'agricoltura.
   1. Le zanzare posteriori di tutte le fasi della vita a 27 ± 1 °C e 75 ± 5% di umidità relativa con 12:12 h di luce e buio.
   2. Schiudere le uova di zanzara immergendole in acqua deionizzata e aggiungendo lievito²⁶, oppure posizionare le uova sommerse all'interno di una camera a vuoto per 30 min.
      NOTA: Entrambi i metodi riducono il contenuto di ossigeno all'interno dell'acqua e aumentano la schiusa²⁷.
   3. Nutrire le larve appena schiuse con cibo per pesci (o una dieta equivalente come le crocchette di gatto macinate) all'interno di vassoi e mantenere la densità larvale il più simile possibile tra i vassoi poiché la densità larvale influisce sullo sviluppo¹² (ad esempio, 200-250 larve per vassoio contenente un totale di 1,5 L di acqua).
   4. Nutrire le larve a giorni alterni fino a raggiungere lo stadio pupale (circa 7-10 giorni), aumentando la quantità di cibo secondo necessità.
      NOTA: Se nutrita troppo poco, la crescita larvale sarà stentata e le larve potrebbero mangiarsi a vicenda. Se alimentate troppo, le larve possono morire, causando l'acqua a sporco.
   5. Una volta che le pupe si sviluppano, trasferirle quotidianamente in una ciotola d'acqua in gabbie per zanzare adulte e fornire una soluzione di saccarosio al 10% ad libitum.
   6. Registra il primo giorno di emergenza degli adulti. Rimuovere le pupe rimanenti dalla gabbia 2 giorni dopo l'inizio dell'emergenza.
      NOTA: le zanzare maschio emergono più velocemente. Si noti l'emergere di maschi e femmine separatamente e assicurarsi che siano disponibili un numero sufficiente di maschi e femmine per ogni test.
   7. Attendere 3 giorni dopo aver rimosso le pupe per ottenere zanzare di 3-5 giorni per il test.
2. Moscerini della frutta posteriori (seguendo liberamente i protocolli dell'Università di Zurigo²⁸).
   1. I ceppi di Drosophila posteriore in bottiglie stock a 23 ± 1 °C e 60 ± 5% di umidità relativa con 12:12 h di luce e buio.
      NOTA: le bottiglie di Drosophila devono contenere 75 ml di un mezzo di mosca standard, che viene prima versato come liquido sul fondo delle bottiglie e quindi lasciato solidificare durante la notte.
   2. Trasferisci le colonie in nuove bottiglie di stock con cibo fresco ogni due settimane per prevenire la sovrappopolazione e la crescita di muffe. Per fare questo, abbattere le mosche usando un distributore di anidride carbonica (CO₂) portatile, trasferire le mosche anestetizzate su una carta pesata su un impacco di ghiaccio o un tavolo freddo e spazzolare le mosche in una bottiglia di brodo fresco usando un pennello a punta fine. Assicurati di tenere le bottiglie sui lati durante questo processo per evitare che le mosche cadano nel cibo e anneghino.

2. Preparare formulazioni insetticide utilizzando l'approccio gravimetrico

1. Realizzare la prima soluzione madre seguendo l'approccio gravimetrico utilizzando una scala analitica con precisione di 0,1 mg all'interno di una cappa aspirante.
   NOTA: l'approccio gravimetrico utilizza la massa per misurare le quantità di insetticida e solvente aggiunti. La pratica standard (approccio volumetrico) richiederà una scala analitica per misurare la quantità di insetticida (solido) aggiunto quando viene preparata la prima soluzione madre; tuttavia, la quantità di solvente aggiunto e tutte le successive diluizioni sono misurate solo in volume. L'approccio gravimetrico ha un livello di precisione più elevato ed è quindi preferito.
   1. Determinare la concentrazione e il volume target dell'insetticida target (si consiglia un massimo di 10 ml se si utilizzano tubi conici da 15 mL per evitare fuoriuscite durante la conservazione in un congelatore) per la prima soluzione madre e calcolare la quantità di principio attivo insetticida (AI) da aggiungere utilizzando Eq (1):
        (1)
   2. Preparare un tubo di stoccaggio (tubo conico da 15 ml consigliato per volumi maggiori, tubi con tappo a vite microcentrifuga da 1,5 ml consigliati per volumi di 1 mL o meno) ed etichettare con il nome dell'insetticida e del solvente, la concentrazione target e la data di preparazione. Posizionare il tubo e il coperchio sulla bilancia all'interno di un rack o di un supporto e tarare la bilancia.
   3. Pesare la quantità desiderata di insetticida solido o liquido AI determinata dal passaggio 2.1.1. (ad esempio, deltametrina utilizzata per i dati rappresentativi) nel tubo e registrare la massa.
   4. Tarare la scala e aggiungere il volume desiderato di solvente (equivalente al volume target) al tubo, chiudere immediatamente il coperchio e registrare la massa. Chiudere il coperchio del tubo immediatamente dopo aver aggiunto il solvente (acetone utilizzato qui) per evitare l'evaporazione e mescolare la soluzione.
   5. Registrare la temperatura ambiente. Alcuni solventi, come l'acetone, possono avere variazioni significative di volume (e di conseguenza di densità) a seconda della temperatura.
   6. Se si conserva immediatamente, avvolgere il coperchio del tubo in parafilm (per ridurre l'evaporazione), metterlo in un portatubi /supporto (per mantenere in posizione verticale e prevenire perdite), coprire in un foglio (per evitare l'esposizione ai raggi UV), metterlo in un sacchetto di plastica richiudibile (per ridurre l'evaporazione) e posizionare il sacchetto in un congelatore a -20 °C. Se non conservato immediatamente, assicurarsi che il coperchio sia fissato e coperto in un foglio o in un contenitore protetto dalla luce.
   7. Calcolare la concentrazione effettiva della soluzione madre (mg/mL) dividendo la massa di insetticida AI aggiunto per il volume di solvente aggiunto (e il volume di insetticida aggiunto se in forma liquida). Per calcolare il volume di solvente aggiunto (o insetticida liquido), dividere la massa aggiunta per la densità nota appropriata per la temperatura registrata.
   8. Calcolare la densità (g/mL) della soluzione madre dividendo la massa totale aggiunta (insetticida e solvente) per il volume totale aggiunto (solvente e insetticida, se in forma liquida). Vedere il passaggio 2.1.7 per la conversione della massa liquida in volume.
2. Diluire in serie la soluzione madre iniziale tramite diluizioni al 10%. Se necessario, utilizzare queste diluizioni seriali per creare una curva dose-risposta iniziale per identificare l'intervallo target di concentrazioni di insetticidi per il biodosaggio.
   1. Calcolare il volume della soluzione madre di insetticida e il solvente da aggiungere a ciascun tubo (ad esempio, 1 mL di soluzione madre di insetticida diluita in 9 mL di solvente per una diluizione di 10 mL del 10% della concentrazione precedente).
   2. Vortice la soluzione madre per 10 s. Tarare un primo tubo di diluizione premarcato sulla bilancia. Aggiungere il volume richiesto di soluzione madre al primo tubo di diluizione utilizzando una pipetta. Chiudere immediatamente il coperchio di entrambi i tubi e registrare la massa nel primo tubo di diluizione.
   3. Tarare nuovamente il primo tubo di diluizione e aggiungere il volume richiesto di solvente. Chiudere immediatamente il coperchio, registrare la massa del solvente aggiunto e ruotare la prima diluizione per 10 s.
   4. Ripetere i passaggi 2.2.2 e 2.2.3 per le diluizioni rimanenti.
   5. Conservare tutte le diluizioni come descritto sopra al punto 2.1.6.
   6. Calcolare le concentrazioni effettive delle diluizioni seguendo il punto 2.1.7.
   7. Calcolare la densità di ciascuna diluizione di insetticida dividendo la massa totale aggiunta (soluzione di insetticida e solvente) per il volume totale aggiunto (soluzione di insetticida e solvente). Per ogni diluizione seriale, utilizzare la densità della precedente diluizione dello stock di insetticida per calcolare la densità della nuova diluizione seguendo Eq (2):
      (2)
3. Facoltativo: creare diluizioni insetticide con incrementi più piccoli mediante diluizione seriale.
   1. Selezionare le concentrazioni e i volumi di ogni nuova soluzione da realizzare con l'aiuto di una curva dose-risposta delle diluizioni seriali iniziali, degli studi precedenti o della letteratura pubblicata.
      NOTA: le concentrazioni scelte dovrebbero comportare un intervallo di mortalità compreso tra 0 e 100%, con un minimo di tre concentrazioni da questo intervallo per consentire l'analisi Probit.
   2. Utilizzare le diluizioni seriali come soluzioni stock per effettuare ogni nuova diluizione e seguire il passaggio 2.2 per creare le nuove diluizioni tra le diluizioni 10 volte.
4. Facoltativo: Aliquota della soluzione insetticida. Se vengono realizzati volumi maggiori di soluzioni insetticide, aliquotare le soluzioni in tubi con tappo a vite da 1,5 ml per evitare la contaminazione, l'evaporazione e la degradazione delle soluzioni di riserva dovute alla manipolazione frequente e all'esposizione alla luce.
   1. Aliquotare le soluzioni, partendo dalla concentrazione più bassa e lavorare verso la concentrazione più alta per ridurre la potenziale contaminazione. Mescolare ogni soluzione madre vorticando per 10 s prima di aprire e pipettare il volume desiderato (ad esempio, 0,5 ml) in un tubo a vite premarcato.
   2. Conservare le aliquote in un contenitore resistente alla luce in un congelatore a -20 °C.
      NOTA: si raccomanda di sostituire regolarmente (mensilmente) le aliquote con piccole nuove aliquote prelevate direttamente dalle diluizioni dei pesticidi di riserva. Ciò limiterà il potenziale di contaminazione da trasferire in altri esperimenti o cambiamenti dovuti all'evaporazione o alla degradazione UV mentre i campioni vengono utilizzati sul banco. Il protocollo può essere sospeso qui e riavviato anche anni dopo, purché le soluzioni insetticide siano conservate correttamente (vedi punto 2.1.6) e conservate nel congelatore a -20 °C.
5. Utilizzare un pennarello permanente per contrassegnare il menisco prima della conservazione per monitorare l'evaporazione del solvente. Quando si rimuove la soluzione di insetticida per fare aliquote, contrassegnare il menisco ogni volta che la soluzione viene rimossa.

3. Preparare lo spazio di lavoro per biotest di applicazioni topiche

NOTA: Si consiglia di lavorare in una tenda da banco per la manipolazione degli insetti per una più facile cattura di zanzare o mosche in fuga. Vedere la Figura supplementare S1 per le immagini di una tenda per la manipolazione degli insetti.

1. Rimuovere le soluzioni insetticide necessarie dal congelatore, vortice immediatamente e metterle in un contenitore resistente alla luce a temperatura ambiente per lasciare che gli insetticidi si riscaldino a temperatura ambiente prima dell'uso.
   NOTA: le IA insetticide possono separarsi dal solvente a temperature più fredde. Inoltre, il volume dell'acetone cambia con la temperatura, che può alterare la dose di insetticida applicata. Mescolare le soluzioni e lasciarle riscaldare a temperatura ambiente aiuta a garantire la coerenza quando si utilizzano le soluzioni insetticide.
2. Indicare tutti gli strumenti e i materiali necessari per il test di applicazione topica nella tenda per la manipolazione degli insetti, come indicato nella Tabella dei materiali.
3. Pulire la canna e l'ago della siringa con acetone di grado analitico completando 5 lavaggi per aliquota di acetone. Completalo con 5 aliquote separate per un totale di 25 lavaggi. Vedere la Figura supplementare S2 per le parti di pipettor per siringhe e ripetitori.
   1. Disporre di 5 tubi microcentrifuga con 0,5 ml di acetone ciascuno.
   2. Riempire la canna della siringa con 0,025 mL di acetone dal primo tubo e quindi espellere l'acetone in un contenitore per rifiuti premendo rapidamente verso il basso sullo stantuffo. Ripetere altre quattro volte per completare un totale di cinque lavaggi di acetone dalla stessa aliquota di acetone. Quindi, riempire completamente il barile della siringa con aria ed espellere l'aria e i potenziali resti di acetone nel contenitore dei rifiuti. Ripeti altre due volte per completare tre "lavaggi" con l'aria.
   3. Ripetere il passaggio 3.3.2 per i restanti 4 tubi di acetone.
   4. Creare una sacca d'aria all'interno della canna tra lo stantuffo della siringa e la parte superiore dell'ago tirando leggermente verso l'alto lo stantuffo nella canna (~5 mm).
      NOTA: questa sacca d'aria protegge lo stantuffo dal contatto con le soluzioni insetticide e riduce il riporto di insetticidi.
   5. Mettere da parte la siringa fino a quando non è pronta per l'uso per l'applicazione topica.
4. Creare una chiave contenente le dosi da applicare e assegnare ID casuali seguendo generatori di numeri casuali o lettere (vedere File supplementare 1).
5. Etichettare i bicchieri di plastica con l'ID casuale per la valutazione della mortalità cieca.
   NOTA: se necessario, il protocollo può essere messo in pausa qui e riavviato in un giorno e un'ora successivi. Se trascorrono più di qualche ora durante la pausa, si consiglia di ripetere il passaggio 3.3 per assicurarsi che la siringa sia pulita e di rimettere le soluzioni insetticide nel congelatore fino a circa un'ora prima di dosare gli insetti e quindi ripetere il passaggio 3.1.

4. Preparare i campioni per il biodosaggio topico. Vedere la Figura 1 per una panoramica procedurale

1. Ordina e pesa le zanzare
   1. Utilizzando un aspiratore alimentato dall'aspirazione dall'inalazione, aspirare il numero desiderato di zanzare adulte di 3-5 giorni necessarie per il test, inclusa una franchigia per tenere conto degli individui danneggiati. Trasferire le zanzare in un tubo conico (fino a 100 zanzare per tubo) posizionando la punta dell'aspiratore nel tubo con il cotone avvolto attorno alla punta ed espirare delicatamente e picchiettare l'aspiratore. Utilizzare il cotone per tappare il tubo quando viene rimossa la punta dell'aspiratore e quindi chiudere con il coperchio. Evitare di riempire l'aspiratore e i tubi con troppe zanzare contemporaneamente, in quanto ciò aggiunge ulteriore stress alle zanzare e può causare la morte.
   2. Abbattere brevemente le zanzare nei tubi mettendole per un minimo di 10 minuti a 4 °C o seppellendole sotto il ghiaccio in una vaschetta di ghiaccio.
      NOTA: Le zanzare possono essere tenute a 2 °C per diverse ore con mortalità minima²⁹; tuttavia, è meglio ridurre al minimo la durata per la quale le zanzare sono sul ghiaccio per ridurre i potenziali effetti negativi.
   3. Trasferire le zanzare abbattute nella tenda per la manipolazione degli insetti e rovesciare con cura le zanzare su un vassoio di plastica (ad esempio, la capsula di Petri) posto sul ghiaccio. Versare solo circa 50 zanzare alla volta per assicurarsi che ognuna tocchi il vassoio fresco sottostante e rimanga abbattuta.
   4. Ordina le zanzare per sesso raccogliendole delicatamente per le gambe (o le ali) con una pinza e metti ogni sesso in una tazza separata. Conta il numero di zanzare di ogni sesso durante lo smistamento e fermati quando viene raggiunto il numero desiderato. Durante lo smistamento, rimuovere eventuali zanzare che sono ferite (ad esempio, gambe mancanti) o sono extra-grandi (ad esempio, addome anormalmente allargato) o piccole (facilmente distinguibili ad occhio nudo come più piccole della dimensione media delle zanzare di quella popolazione).
      NOTA: Maneggiare le zanzare dalle appendici riduce i danni strutturali ai loro corpi primari morbidi (ad esempio, addome).
   5. Registra il peso di ogni tazza di zanzare usando una bilancia analitica con precisione di 0,1 mg.
      1. Metti una tazza vuota con una capsula di Petri come coperchio sulla bilancia e tara la bilancia. Versare le zanzare nel contenitore, posizionare il coperchio sopra e posizionare il contenitore sulla bilancia.
      2. Registrare il peso combinato e il numero di campioni sul foglio di punteggio (vedere il file supplementare 2). Riposizionare immediatamente la tazza di campioni sul ghiaccio per mantenerli immobilizzati.
      3. Ripetere i passaggi 4.1.5.1-4.1.5.2 fino a quando tutte le tazze di campioni non sono pesate.
   6. Dividere le zanzare preparate in gruppi di 20-25 in tazze separate poste su ghiaccio etichettate con gli ID casuali. Quando si trasferiscono le zanzare, mirare a ridurre lo stress e i danni fisici causati dalla pinza. Idealmente, raccogli le zanzare usando una pinza solo 1-2 volte: una volta per lo smistamento / pesatura e una potenziale seconda volta per il trasferimento alle tazze sperimentali.
      NOTA: Un numero ideale di zanzare per tazza è 20-25, che è sufficiente per una replica, è ragionevole per valutare la mortalità e non dovrebbe causare stress / morte indotti dalla densità nella tazza.
2. Ordinare e pesare i moscerini della frutta
   1. Anestetizzare le mosche usando CO₂ per 7 s.
      NOTA: Se le mosche sono esposte a CO₂ per più di 7 s, potrebbero avere difficoltà a strisciare e volare quando si svegliano³⁰.
   2. Versare le mosche su un impacco di ghiaccio avvolto in carta da banco e utilizzare un pennello a punta fine per separare e contare i maschi e le femmine.
   3. Usa il pennello per raccogliere delicatamente le mosche scelte e metterle in una bottiglia pulita e vuota. Scegli un numero uguale di moscerini della frutta maschi e femmine (ad esempio, 15 maschi e 15 femmine) ed etichetta le bottiglie stock con il nome del ceppo e il totale dei moscerini della frutta (ad esempio, Canton-S, 30 mosche).
      NOTA: È importante avere un numero uguale di moscerini della frutta femminili e maschili perché i moscerini della frutta maschi possono sperimentare una maggiore aggressività l'uno verso l'altro dopo essere stati rimossi dalla presenza di femmine³¹. Pertanto, per evitare mortalità o lesioni non insetticide, è meglio avere un numero uguale di maschi e femmine (o omettere completamente i moscerini della frutta maschi).
   4. Registra il peso di ogni bottiglia di moscerini della frutta usando una bilancia analitica.
      1. Posizionare un flaconcino vuoto (etichettato con un ID casuale, fare riferimento al punto 3.4) con una capsula di Petri come coperchio sulla bilancia e tarare la bilancia.
         NOTA: I flaconcini di vetro sono raccomandati per l'uso con moscerini della frutta in quanto riducono significativamente la statica.
      2. Anestetizzare la bottiglia di moscerini della frutta corrispondente all'ID casuale della fiala utilizzando CO₂ per 7 s.
      3. Versare i moscerini della frutta sulla carta pesata e utilizzare la carta come imbuto per introdurre le mosche nella fiala. Posizionare il coperchio della capsula di Petri sopra la fiala dei moscerini della frutta e posizionarlo sulla bilancia.
      4. Registrare il peso combinato e il numero di campioni sul foglio di punteggio e quindi posizionare immediatamente la fiala di moscerini della frutta in un vassoio di ghiaccio, con il coperchio ancora in cima per evitare che le mosche fuoriescano.
      5. Ripetere i passaggi 4.2.4.1-4.2.4.4 per ogni flacone di moscerini della frutta.
3. Al termine dei passaggi precedenti, passare immediatamente alla sezione successiva.

5. Campioni di dose

1. Caricare la siringa con la giusta concentrazione di insetticida. Inizia con la dose meno concentrata e lavora verso la dose più concentrata con ogni gruppo di organismi. Per evitare sprechi, caricare la siringa solo con il volume necessario di insetticida più un extra raccomandato di 2 μL.
2. Puntare i campioni su carta da pesare posta in cima a un vassoio sul ghiaccio. Separare i campioni che sono vicini tra loro utilizzando un pennello pulito e privo di insetticidi o un batuffolo di cotone per consentire un facile accesso a ciascun campione per il dosaggio. Per le zanzare, utilizzare il pennello anche per assicurarsi che ogni esemplare sia posato sul dorso e che la superficie ventrale sia rivolta verso l'alto.
3. Usando la siringa, applicare una goccia di soluzione di insetticida (o acetone per il controllo) sul torace ventrale e sull'area dell'addome per le zanzare e il dorso per i moscerini della frutta. Applicare una goccia da 0,2 μL (che richiede una siringa da 10 μL) per insetti di dimensioni più piccole come i moscerini della frutta e una goccia da 0,5 μL (che richiede una siringa da 25 μL) per le zanzare.
   NOTA: la sensibilità agli insetticidi non differisce significativamente tra le parti primarie del corpo (come la testa, il torace e l'addome) rispetto alle appendici (come ali, gambe o proboscide)³². Pertanto, il sito di applicazione non deve essere esatto finché la goccia di dose viene applicata al corpo primario. Il torace ventrale e l'area dell'addome sono scelti per le zanzare perché spesso giacciono sul lato dorsale quando vengono abbattuti, mentre il dorso viene scelto per i moscerini della frutta perché spesso giacciono sul lato ventrale quando vengono abbattuti. Questa minore specificità del sito dell'applicazione consente di aumentare la velocità effettiva di questo metodo.
4. Versare immediatamente i campioni nel bicchiere di plastica etichettato e coprire la tazza con una rete e un elastico. Metti la tazza in un vassoio di contenimento e annota sulla tazza tutti gli esemplari che sono stati uccisi, danneggiati o sfuggiti in questo processo (per escluderli nel conteggio finale degli esemplari in quella tazza). Per la prima tazza, registrare il tempo in cui il dosaggio è completato.
5. Sostituire la carta o le carte da pesatura su cui sono posizionati i campioni per evitare la contaminazione da insetticida tra le dosi.
6. Ripetere il dosaggio per ogni tazza fino a quando tutti i campioni sono stati dosati con le concentrazioni di insetticida appropriate e registrare il tempo finale in cui tutti i campioni sono stati dosati.
7. Fornire una soluzione di saccarosio al 10% a ciascuna tazza tramite un batuffolo di cotone imbevuto e mettere da parte le tazze fino a quando la mortalità non viene valutata il giorno seguente. Conservare le zanzare a 27 ± 1 °C con 75 ± 5% di umidità relativa⁵ e i moscerini della frutta a 23 ± 1 °C con 60 ± 5% di umidità relativa.
   NOTA: Fare attenzione mentre si spremano i batuffoli di cotone per evitare sovrasaturazione o sottosaturazione. I batuffoli di cotone dovrebbero essere umidi ma non gocciolanti. Gocciolare acqua zuccherata nella tazza può portare alla mortalità dei campioni e quindi influire sulla valutazione della mortalità dell'insetticida.

6. Valutare la mortalità

1. Registrare la mortalità del campione a 24 ore dopo l'inizio dell'esposizione agli insetticidi. Classificare le zanzare come vive se possono volare e tenersi in posizione verticale; come morti se sono immobili o atassici (incapaci di stare in piedi o decollare per il volo), come descritto dall'OMS⁶. Seguire la stessa valutazione della mortalità per i moscerini della frutta ^8,33.
   NOTA: Per valutare la mortalità ritardata, la mortalità può anche essere valutata dopo 48 e 72 ore con cambi giornalieri di acqua zuccherata.
2. Dopo aver registrato la mortalità, mettere tutte le tazze di campioni in un sacchetto contenuto in un congelatore per almeno 1 ora per assicurarsi che tutti i campioni siano morti prima dello smaltimento o dell'uso successivo (ad esempio, analisi molecolare o chimica).

7. Eseguire repliche

1. Ripetere i passaggi 3-6 su una nuova serie di campioni, avendo cura di eseguire le repliche alla stessa ora ogni giorno, poiché la suscettibilità agli insetticidi può cambiare a seconda dell'ora del giorno³⁴.
2. Garantire un minimo di 3 repliche per ogni concentrazione per una stima accurata della dose letale che uccide il 50% dei campioni (LD₅₀). Includere più repliche se si osserva un alto livello di variabilità.
3. Completare l'analisi dopo aver raccolto tutti i dati.

8. Analizza i risultati

1. Registrare i dati in un programma di fogli di calcolo e utilizzare la chiave ID casuale per smascherare i dati (passaggio di riferimento 3.4). Salvare i dati come file di testo (vedere dati di esempio nel file supplementare 3) per l'analisi nel programma^{statistico R 35} (vedere esempio di codice R nel file supplementare 4) o altro software di scelta³⁶.
2. All'interno del programma software, completare la seguente analisi. Vedere File supplementare 4 per un esempio di codice R.
   1. Calcolare la dose di insetticida (ng) per massa del campione (mg) seguendo Eq (3) di seguito:
      (3)
   2. Calcola la mortalità e applica la formula³⁷ di Abbott per correggere la mortalità rispetto alla mortalità osservata in ciascun controllo³⁷. In alternativa, utilizzare la formula di Schneider-Orelli (1947) per correggere la mortalità³⁸. Con entrambe le formule, applicare la correzione a tutti i dati indipendentemente dalla mortalità in ciascun controllo, come precedentemente descritto³⁷ e implementato³⁹, a meno che i dati di controllo non siano insolitamente elevati (vedi discussione sotto).
      NOTA: la formula di Abbott e le alternative equivalenti, come la formula di Schneider-Orelli, regolano i valori di mortalità proporzionalmente all'entità della mortalità non osservata nei controlli e non causeranno una diminuzione della mortalità per le coppette che avevano una mortalità del 100%. Per ulteriori informazioni, vedere i riferimenti citati per queste formule.
   3. Trasformare i dati di mortalità corretti in valori di probit (unità di probabilità)⁴⁰ ed eseguire la regressione lineare tra la dose di insetticida e i dati di mortalità trasformati. Utilizzare un test chi-quadrato per valutare l'adattamento dei modelli lineari.
      NOTA: i valori di mortalità di 0 (mortalità 0%) o 1 (mortalità al 100%) vengono rimossi dai dati prima di completare la trasformazione del probit. Ciò è necessario a causa della natura della trasformazione probit. Pertanto, i dati rappresentati graficamente non includeranno controlli positivi o negativi o qualsiasi altro dato che abbia provocato una mortalità dello 0% o del 100% (dopo l'applicazione della correzione di Abbott).
   4. Calcolare gli intervalli di confidenza (CI) LD₅₀ e 95% per ceppo, popolazione e/o sesso del campione seguendo i metodi precedentemente pubblicati 39,41,42.
   5. NOTA: se gli IC al 95% di due ceppi non si sovrappongono, i ceppi hanno risposte alla dose significativamente diverse.
   6. Se del caso, calcolare i rapporti di resistenza (RR) dividendo il DL₅₀ della deformazione di interesse per il DL₅₀ della deformazione di riferimento/controllo.

Figura 1: Diagramma del protocollo di analisi dell'applicazione topica. Il protocollo di analisi dell'applicazione topica inizia con (A) la cernita dei campioni sul ghiaccio, seguita da (B) pesare i campioni su una scala analitica, (C) dosare i campioni con soluzioni insetticide e (D) 24 ore di attesa dopo l'esposizione all'insetticida con accesso alla soluzione di saccarosio al 10% ad libitum (tramite un batuffolo di cotone imbevuto), seguito dalla valutazione della mortalità. Le frecce rosse indicano la posizione di applicazione dell'insetticida bersaglio per zanzare (a sinistra) e moscerini della frutta (a destra). Si noti che l'immagine non deve essere ridimensionata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Results

Questi risultati rappresentativi presentano due diversi ceppi di Ae. aegypti, Rockefeller (ROCK), e un ceppo di campo isolato della Florida con mutazioni note di resistenza al knockdown F1534C e V1016I (genotipo IICC). Inoltre, è presente la Drosophila melanogaster (ceppo Canton: S).

La Figura 2 e la Figura 3 illustrano la dose-risposta di ciascun organismo per ceppo e sesso testato seguendo il protocollo di cui sopra. Poiché non sono state osservate differenze tra le curve dose-risposta delle zanzare maschio e femmina all'interno di ciascun ceppo (t = 1,70, p = 0,098 per ROCK e t = 0,64, p = 0,527 per IICC), sono stati raggruppati i dati di entrambi i sessi all'interno di ciascun ceppo di zanzara. La LD₅₀ relativizzata alla massa per ROCK e IICC sono rispettivamente 0,008 ng/mg (IC 95%: 0-0,104) e 0,336 ng/mg (IC 95%: 0,235-0,438). Gli IC al 95% di questi valori non si sovrappongono, indicando risposte alla dose significativamente diverse dei ceppi. Il RR del ceppo IICC (relativo al ceppo ROCK) è 41.7, che secondo l'OMS, è considerato altamente resistente⁵. Per i moscerini della frutta cantonali, la LD₅₀ relativizzata in massa è 0,213 ng/mg (IC 95%: 0-0,490).

Figura 2: Dati rappresentativi delle zanzare che utilizzano il biotest di applicazione topica. Dati rappresentativi dose-risposta da biotest di applicazione topica secondo il protocollo di cui sopra utilizzando deltametrina e zanzare: (A) ceppi femmina Ae. aegypti ROCK (n = 880) e IICC (n = 550), (B) maschio Ae. aegypti ROCK (n = 880) e IICC (n = 569) ceppi. Le concentrazioni di test della deltametrina variavano da 0,00075 ng / μL a 9,68705 ng / μL e la dose di deltametrina applicata (ng) per massa media della zanzara (mg) si riflette sull'asse x. La mortalità è mostrata come proporzione sull'asse y. La linea nera attraverso ciascun cluster di punti dati rappresenta la deformazione e la regressione lineare specifica del sesso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Dati rappresentativi dei moscerini della frutta che utilizzano il biotest di applicazione topica. Dati rappresentativi dose-risposta da biotest di applicazione topica secondo il protocollo di cui sopra utilizzando deltametrina e moscerini della frutta: ceppo D. melanogaster Canton-S (n = 1014). Le concentrazioni dei test della deltametrina variavano da 0,00499 a 5,02876 ng / μL e la dose di deltametrina applicata (ng) per massa media del moscerino della frutta (mg) si riflette sull'asse x. La mortalità è mostrata come proporzione sull'asse y. La linea nera rappresenta la regressione lineare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare S1: Tenda per la gestione degli insetti da banco. La tenda per la manipolazione degli insetti da banco viene utilizzata per una più facile cattura di zanzare o mosche in fuga durante il test di applicazione topica. La struttura è chiusa in A e aperta in B. Questa struttura è stata costruita con tubo in PVC e tessuto a maglie fini. Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S2: Unità applicatore di siringhe e ripetitori. Unità di applicazione della siringa e del ripetitore utilizzata per il dosaggio degli insetti. Le parti principali includono 1) ago, 2) canna della siringa, 3) stantuffo, 4) ripetitore e 5) pulsante del ripetitore. Fare clic qui per scaricare questo file.

File supplementare 1: script di randomizzazione: Script di randomizzazione per creare etichette non distorte per tutte le tazze di ogni esperimento. Fare clic qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: Foglio di punteggio di mortalità: Foglio di punteggio di mortalità per aiutare la valutazione della mortalità. Il foglio include anche luoghi in cui registrare tutte le altre informazioni importanti da registrare, come indicato nel protocollo, come l'inizio e la fine dell'applicazione dell'insetticida. Fare clic qui per scaricare questo file.

File supplementare 3: Esempio di dati sulla mortalità: File di dati di esempio utilizzato per creare la Figura 2. Le descrizioni delle intestazioni di colonna sono le seguenti: "id" = codice identificativo di ciascun punto dati; "specie" = nome della specie (ad esempio, Aedes aegypti); "insetticida" = nome dell'insetticida applicato localmente (ad esempio, Deltametrina); "ceppo" = nome del ceppo di zanzara (ad esempio, ROCK); "date" = data di inizio applicazione topica; "sesso" = sesso delle zanzare; "età" = età delle zanzare (giovani = 3-5 giorni; vecchi = 4 settimane); "total.mosq" = numero totale di zanzare pesate in batch; "peso" = peso (mg) di tutte le zanzare all'interno del lotto; "concentrazione" = concentrazione di insetticida (μg/mL); "siringa" = volume di goccioline (mL) della siringa; "dose" = quantità di principio attivo insetticida applicato a ciascuna zanzara (ng); "totale" = numero di zanzare in ogni tazza; "morto" = numero di zanzare morte in ogni tazza. Fare clic qui per scaricare questo file.

File supplementare 4: Codice di analisi R: Esempio di codice R che può essere utilizzato per completare l'analisi Probit (come descritto nel passaggio 8 del protocollo). I risultati rappresentativi (accessibili tramite il file di dati di esempio supplementare) possono essere utilizzati con questo codice R. Fare clic qui per scaricare questo file.

Discussion

Questo documento presenta un protocollo adattato per il test di applicazione topica per zanzare e moscerini della frutta. Questa procedura potrebbe essere facilmente adattata per essere utilizzata sul campo e con altri organismi in quanto richiede attrezzature specializzate minime. Di seguito sono riportati i passaggi critici di questo protocollo, le potenziali modifiche, i consigli per la risoluzione dei problemi, le limitazioni del metodo e il significato di questo metodo.

Passaggi critici nel protocollo: Ci sono tre passaggi critici nel protocollo che, se completati in modo errato, possono avere un impatto drastico sui risultati del biotest: accuratezza della concentrazione di insetticidi, abbattimento del campione e valutazione della mortalità.

Precisione della concentrazione di insetticida:
È estremamente importante disporre di soluzioni insetticide accurate per ottenere curve dose-risposta replicabili e risultati significativi. L'approccio volumetrico alla preparazione della soluzione insetticida è più comune in letteratura sia per il biodosaggio⁷ del flacone CDC che per le applicazioni topiche 13,14,43. Tuttavia, l'approccio gravimetrico qui descritto è intrinsecamente più accurato a causa della considerazione della temperatura attraverso l'inclusione della densità (specifica della temperatura), portando a una preparazione della formulazione più accurata.

Abbattimento del campione:
Abbattere i campioni è una componente critica di questo metodo e consente la somministrazione accurata dell'insetticida e le misurazioni del peso. Tuttavia, abbattere gli organismi contiene inevitabilmente il rischio di stress fisico e danni, come precedentemente dimostrato³⁰. Pertanto, sii cauto e consapevole quando abbatti i campioni per assicurarti che i) ogni campione venga abbattuto per una durata simile, ii) la durata dell'abbattimento sia ridotta al minimo e iii) il metodo di abbattimento sia mantenuto coerente tra tutti gli esemplari. Inoltre, si consiglia di testare il metodo di abbattimento separatamente, prima dell'applicazione dell'insetticida, per assicurarsi che il metodo abbia successo e non induca una mortalità di controllo superiore al 10%. Il test iniziale potrebbe richiedere più tempo per un utente inesperto, portando a tempi di knockdown più lunghi. Pertanto, sii cauto quando interpreti i risultati dei primi test.

Valutazione della mortalità:
Valutare la mortalità può essere difficile, specialmente quando l'insetticida non uccide completamente ma solo abbatte o mutila la zanzara o la mosca. Pertanto, è importante essere consapevoli di come l'insetticida influisce sull'organismo bersaglio e avere una chiara definizione di organismi "morti" (o abbattuti) prima di iniziare. Inoltre, si raccomanda che la stessa persona valuti la mortalità tra le dosi e si replichi per ridurre la variazione.

Modifiche del protocollo: Diverse modifiche descritte di seguito possono essere applicate a questo protocollo per migliorarne la versatilità e l'accessibilità.

Adattamento del test a insetti di dimensioni più piccole o maggiori:
Quando si utilizzano campioni più piccoli o più grandi, si consiglia di applicare rispettivamente un volume di dose più piccolo o maggiore di insetticida. Ad esempio, abbiamo adattato il protocollo delle zanzare ai moscerini della frutta riducendo la dose di 0,5 μL a una dose di 0,2 μL. Assicurarsi che venga scelta la dimensione corretta della siringa per il volume di dose scelto.

Adattamento del test agli insetti di campo:
Quando si usano gli insetti di campo, potrebbe esserci più variazione nelle dimensioni degli insetti. Pertanto, si raccomanderebbe di pesare gli insetti in gruppi più piccoli (ad esempio, per tazza) invece che come un grande gruppo (ad esempio, tutti gli insetti utilizzati per un esperimento). Questo può aiutare a catturare la potenziale variazione della suscettibilità agli insetticidi associata alle differenze nella massa degli insetti di campo.

Modifiche dell'attrezzatura:
Tenda per la manipolazione degli insetti: il dosaggio del campione può essere completato sotto una tenda per la manipolazione degli insetti che è semplicemente costruita con tubo in PVC e zanzariera. Questa può essere un'alternativa a una stanza chiusa (ad esempio, insetticida) e aiutare a eliminare la potenziale contaminazione da insetticidi nelle aree in cui potrebbe verificarsi l'allevamento di insetti. Questa tenda per la gestione degli insetti è facile da costruire e a basso costo (~ $ 70). In alternativa, è possibile acquistare una gabbia per la gestione degli insetti (~ $ 425).

Tavolo freddo: impacchi di ghiaccio o vassoi di ghiaccio possono essere utilizzati per abbattere il campione e / o mantenere il campione abbattuto.

Incubatore: gli incubatori sono raccomandati per allevare il campione e tenere il campione per 24 ore dopo il trattamento insetticida. Se un incubatore non è disponibile, può essere costruito. Le attrezzature necessarie per costruire l'incubatore includono un contenitore isolato, umidificatore, cavi termici, regolatore di umidità e temperatura e una luce, che dovrebbe ammontare a un costo totale di ~ $ 170, seguendo ed espandendo i metodi precedenti⁴⁴.

Bicchieri di tenuta: Sebbene i bicchieri di plastica siano usati per ordinare e contenere il campione trattato, i bicchieri di carta rivestiti di cera o i contenitori di vetro sarebbero alternative adatte.

Modifica dell'organismo e dello stadio di vita:
Questo metodo è molto adattabile per l'uso con altri vettori, insetti e / o artropodi come le zanzare Culex quinquefasciatus ³², le mosche domestiche³² e gli scarafaggi⁴⁵, così come le fasi della vita non adulta, come le larve di zanzara⁴⁶.

Modifica della posizione dell'applicazione topica:
Questo metodo descrive l'applicazione dell'insetticida al torace ventrale e alla regione dell'addome per le zanzare (e il dorso per i moscerini della frutta). Tuttavia, è possibile utilizzare altre posizioni dell'applicazione purché il sito di esposizione sia coerente. La coerenza è importante perché la sensibilità agli insetticidi può variare in base alla posizione di applicazione³².

Consigli per la risoluzione dei problemi: Questo metodo ha diversi passaggi che sono inizialmente impegnativi. Di seguito sono descritti alcuni dei problemi più comuni che si potrebbero incontrare.

Soluzioni insetticide che perdono/evaporano:
Gli insetticidi sono comunemente disciolti nell'acetone, un composto altamente volatile. Ciò significa che l'acetone evapora rapidamente a temperatura ambiente, aumentando le concentrazioni di insetticida nel tempo. Se le soluzioni insetticide sembrano perdere o evaporare, rifare le soluzioni, assicurarsi che il coperchio del tubo sia ben acceso e ricontrollare che i protocolli di conservazione vengano seguiti correttamente (ad esempio, viene utilizzato il parafilm e i tubi vengono conservati in posizione verticale). Se la perdita persiste, prova a riempire i tubi con un volume inferiore per consentire più spazio per la variazione di volume che l'acetone sperimenta a temperature diverse. Inoltre, se si utilizza l'acetone come solvente, assicurarsi che i tubi siano classificati per lo stoccaggio dell'acetone (ad esempio, plastica FEP, TFE e PFA). Se si utilizzano insetticidi idrofobici, conservare le soluzioni in flaconcini di vetro (poiché gli insetticidi idrofobici aderiscono al vetro meno della plastica). È anche buona norma contrassegnare il menisco della soluzione prima della conservazione per monitorare l'evaporazione.

Peso alla deriva sulla microbilancia durante la pesatura degli organismi:
Se la lettura del peso sulla bilancia è alla deriva (salendo o scendendo lentamente), ciò potrebbe essere dovuto alla statica. La deriva si verifica più spesso quando si pesano organismi in oggetti di plastica, poiché la plastica può facilmente trattenere una carica statica. Per evitare ciò, è possibile posizionare una carta da pesare sotto il contenitore di plastica da pesare o utilizzare un contenitore non di plastica come il vetro.

Risultati anomali della mortalità:
Ci sono molti modi in cui i risultati della mortalità possono sembrare anormali, come osservare un'alta mortalità nei controlli o un'alta / bassa mortalità in tutte le dosi di insetticida. Esaminare i casi seguenti per la risoluzione dei problemi relativi a ogni scenario.

Elevata mortalità per il controllo
Se c'è un'alta mortalità nel gruppo di controllo (10% o superiore), valutare il metodo di abbattimento e il periodo di tempo in cui i campioni vengono abbattuti. Se possibile, abbreviare il periodo di tempo per il quale i campioni vengono abbattuti. Altri potenziali fattori da considerare per un'elevata mortalità nei controlli includono i) verificare se le impostazioni dell'incubatore sono corrette: temperature e / o umidità anormali potrebbero portare ad un aumento della mortalità. La temperatura e l'umidità devono essere controllate con un data logger indipendente. ii) Valutazione della manipolazione degli insetti. Maneggiare gli insetti troppo o troppo approssimativamente potrebbe portare ad un'alta mortalità. iii) Verificare se non vi è contaminazione da insetticida nel 100% acetone utilizzato per trattare il gruppo di controllo o sulla strumentazione. Sostituire l'acetone e pulire tutti gli strumenti con acetone o etanolo. Evitare la contaminazione sostituendo frequentemente i guanti, prevenendo fuoriuscite e pulendo gli strumenti. Si noti che nel file supplementare 3, un massimo di due zanzare sono morte all'interno delle tazze di controllo (solo acetone). Questo livello di mortalità non è considerato elevato (è inferiore al 10%) e quindi non c'era motivo di preoccupazione.

Alta mortalità in tutti i gruppi esposti (ma non nei gruppi di controllo)
Utilizzare concentrazioni di insetticidi più basse o volumi di dose più piccoli per i test. I dosaggi utilizzati potrebbero essere superiori alla dose minima che non indurrà la mortalità. Utilizzare diverse diluizioni 10 volte per identificare l'intervallo di dosaggio corretto ed escludere la contaminazione. Per evitare la contaminazione, iniziare a dosare con la concentrazione più bassa e lavorare verso la massima concentrazione. Inoltre, assicurarsi che tutte le apparecchiature utilizzate siano regolarmente pulite con acetone e / o etanolo, che le dosi applicate al campione siano molto piccole e che anche la minima contaminazione incrociata possa influire sui risultati.

Bassa mortalità in tutti i gruppi esposti
Utilizzare concentrazioni di insetticidi più elevate. I dosaggi utilizzati potrebbero essere tutti troppo bassi per causare mortalità nella popolazione. Per identificare l'intervallo di dosaggio corretto, esporre i campioni a diversi dosaggi concentrati 10 volte. Assicurarsi che le soluzioni insetticide non siano scadute o degradate (potenzialmente a causa di alte temperature o esposizione alla luce). Se le soluzioni sono scadute o si sospetta che si siano degradate, rifare le soluzioni e garantire che vengano seguite le condizioni di conservazione adeguate.

Mortalità incoerente tra repliche/giorni
Il momento della giornata in cui gli insetti sono esposti all'insetticida potrebbe influenzare il livello di resistenza espresso, in particolare per la resistenza metabolica³⁴. Ripeti questo protocollo durante la stessa finestra di tempo ogni giorno per evitare che l'ora del giorno sia una potenziale variabile che contribuisce ai cambiamenti nella mortalità. Altri potenziali fattori che contribuiscono alla mortalità incoerente tra le repliche includono i) campioni allevati in modo differenziale tra gli esperimenti. Assicurarsi che tutti gli esemplari siano della stessa fascia di età, allevati alla stessa temperatura e densità e disponibilità di cibo simili. ii) concentrazioni di insetticidi che si degradano nel tempo o diventano più concentrate a causa dell'evaporazione dell'acetone. Rifare le soluzioni e garantire condizioni di conservazione adeguate. iii) Punteggio di mortalità incoerente. Assicurarsi che la stessa persona segni la mortalità o sviluppare un protocollo chiaro da utilizzare in modo coerente in tutto il team. Usa il punteggio cieco per ridurre i pregiudizi nel punteggio di mortalità.

Insetti che si attaccano alla superficie del vassoio di smistamento:
L'acetone reagisce alle materie plastiche utilizzate in questo protocollo, come le piastre di Petri. Il campione probabilmente aderirà alla superficie se si utilizza acetone su piastre di Petri o superfici di plastica simili. Questa adesione può essere evitata rivestendo il vassoio di selezione con carta da pesatura o utilizzando un vassoio di selezione non in plastica. Inoltre, la condensa sulla superficie della plastica nel vassoio di selezione o nelle tazze di contenimento può portare a insetti che aderiscono alla condensa, oppure il campione può essere troppo freddo e potenzialmente congelare in superficie. Regolare il metodo di abbattimento per ridurre la condensa evitando che i campioni diventino troppo freddi / congelati (ad esempio, posizionare la carta pesata tra i campioni e il vassoio di selezione in plastica).

Errori di analisi R:
Una volta raccolti i dati sulla mortalità, durante l'analisi possono verificarsi una varietà di complicazioni. Il motivo più comune per cui un codice R non può completare le azioni per il file di dati è che il formato dei dati non corrisponde al codice (ad esempio, intestazioni di colonna e/o celle vuote). Se sorgono complicazioni più gravi, fare riferimento alle pagine di aiuto di R integrate in Rstudio³⁵.

Limitazioni del metodo di applicazione topica sopra descritto:
L'assorbimento di insetticidi tramite metodo di applicazione topica non imita l'esposizione naturale:
L'applicazione topica sul corpo primario non è il modo naturale di assorbimento degli insetticidi. Sul campo, gli insetti assorbono principalmente insetticidi attraverso le loro gambe per il periodo di tempo in cui sono in contatto con la superficie trattata con insetticida o sulle loro ali attraverso piccole particelle di aerosol^47,48, piuttosto che una rapida esposizione sulla superficie ventrale. Tuttavia, l'applicazione diretta di una dose nota di insetticida stabilirà con precisione una risposta fenotipica agli insetticidi, necessaria per studi genetici ed evolutivi o confronti della suscettibilità agli insetticidi nello spazio o nel tempo. Pertanto, questo approccio è utile per testare la resistenza tecnica, ma non misurerà direttamente la resistenza pratica (l'efficacia dello strumento di intervento effettivo in un ambiente di campo¹⁵). Tuttavia, è importante notare che gli attuali metodi standard (ad esempio, test su prove su tubo dell'OMS e biosaggi di bottiglie CDC) non possono catturare o imitare l'aerosol (cioè appannando) l'esposizione agli insetticidi sul campo.

I saggi di applicazione topica possono solo valutare gli insetticidi di assorbimento per contatto:
Questo metodo è destinato agli insetticidi che funzionano attraverso il contatto e l'assorbimento dell'insetticida e non per l'uso con insetticidi orali, come l'acido borico comunemente usato nelle attraenti esche da zucchero tossico⁴⁹.

Significato del metodo:
Il metodo di applicazione topica espande gli standard consolidati per i biosaggi insetticidi calcolando la dose letale (non concentrazione) e misurando la resistenza tecnica (non pratica)¹⁵. Di seguito sono riportati i vantaggi e gli svantaggi di questo metodo rispetto ai saggi di suscettibilità agli insetticidi esistenti.

Calcolo della dose letale:
Questo metodo determina la dose letale dell'insetticida, piuttosto che la concentrazione letale che i biosaggi CDC e OMS usano per stabilire la dose discriminante¹¹. La dose letale è più significativa perché è una quantità quantificata di insetticida nota per suscitare mortalità. Al contrario, la concentrazione letale non considera la quantità di insetticida che l'organismo acquisisce effettivamente. Quando si utilizza il calcolo della dose letale, le differenze tra i profili di suscettibilità dipendenti dal sesso o dalle dimensioni possono essere osservate e quantificate in modo più accurato, rendendo questa misurazione ancora più versatile.

Resistenza tecnica:
Questo metodo valuta la resistenza tecnica, che è la resistenza misurata in ambienti standardizzati e controllati. Tali misurazioni sono adatte per la sorveglianza della diffusione della resistenza agli insetticidi e per collegare la resistenza fenotipica con potenziali marcatori¹⁵. A causa della diminuzione della variazione della mortalità derivante dal biotest di applicazione topica, consente una migliore identificazione di nuovi marcatori di resistenza. Tuttavia, a causa dell'esposizione innaturale di insetticidi alla zanzara, questo test non è adatto per la stima dell'efficacia di un intervento specifico in una popolazione specifica. Altri saggi sono necessari per le misurazioni di tale resistenza pratica¹⁵.

Adattabilità del campione:
Questo metodo può essere praticato su altri importanti artropodi come parassiti delle colture (ad esempio, coleottero della patata del Colorado), parassiti domestici (ad esempio, scarafaggi e cimici dei letti) o impollinatori (ad esempio, api) con semplici modifiche all'approccio di abbattimento e / o dose di insetticida, volume e / o concentrazione (come descritto sopra). La facilità di adattabilità può aiutare ad analogizzare la ricerca sulla resistenza agli insetticidi in diversi campi di ricerca. L'uso di un valore LD₅₀ invece di una concentrazione letale che uccide il 50% degli esemplari (LC₅₀) consente un confronto accurato tra le specie.

Costo:
Analogamente ai biosaggi delle bottiglie CDC e ai test su provetta dell'OMS, i costi per eseguire il test di applicazione topica sono minimi (vedere la Tabella dei materiali). I pezzi essenziali dell'attrezzatura sono la siringa (circa $ 70) e il distributore (circa $ 100), che sono riutilizzabili attraverso i test.

Numero di esemplari necessari:
Un minimo di 20-25 campioni devono essere utilizzati per tazza di saggio di applicazione topica. Si raccomanda di testare almeno cinque concentrazioni di insetticida per esperimento, con un minimo di tre repliche raccomandate per la procedura. Nel complesso, ciò si traduce in un minimo di 300-375 campioni necessari per un test completo, paragonabile al numero di campioni necessari per eseguire test di intensità di resistenza utilizzando test su prove su sondiera DELL'OMS o biotest di bottiglie CDC. Tuttavia, se si ottiene una ridotta variabilità con il biotest di applicazione topica, lo stesso numero di campioni può portare a una maggiore potenza statistica per confrontare i dati di suscettibilità nello spazio o nel tempo.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Provette per microcentrifuga da 1,5 mL	Thomas Scientific	20A00L068	Conservazione dell'aliquota di acetone
Provette con tappo a vite da 1,5 mL	Thomas	Scientific 1182K23	Conservazione per diluizione dell'insetticida
Provette coniche da 15 mL	VWR	339651	Conservazione per diluizione dell'insetticida
Fiale a scintillazione in vetro da 20 mL	Fisher Scientific	0334125D	Pesatura del moscerino della frutta
25 μ L siringa	Fisher Scientific	14815288	Applicatore topico
Acetone	Fisher Scientific	AC423240040	ACS 99,6%, 4 L
Aedes aegypti (ceppo IICC)	USDA CMAVE	NA	Insetticida resistente
Aedes aegypti (ceppo Rockefeller)	CDC	NA	Insetticida suscettibile
Scala analitica	Fisher Scientific	14-557-409	Precisione fino a 0,1 mg
Aspiratore	Amazon	6.49986E+11	Dispositivo di raccolta delle zanzare
Carta da banco	VWR	89126-794	Posto sotto l'area di lavoro
Tamponi di cotone	Amazon	B092S8JVQN	Utilizzare per lo smistamento degli insetti
Batuffoli di cotone	Amazon	B0769MKZWT	Utilizzare per la soluzione
Dispenser	Fisher Scientific	1482225	Ripetitore pipettatore
Drosophila melanogaster (ceppo Canton-S)	University of Wisconsin-Madison	NA	Insetticida suscettibile
Pennelli a punta fine	Amazon	B07KT2X1BK	Utilizzare per la selezione degli insetti
Bottiglie di mosca della frutta	Fisher Scientific	AS355	Utilizzare per l'allevamento e la selezione moscerini della frutta
Dispenser portatile di CO2	Fisher Scientific	NC1710679	Utilizzare per abbattere gli insetti
Tazze	di tenuta Amazon	B08DXG7V1S	Plastica trasparente
Impacco di ghiaccio	Amazon	B08QDWMMW5	Utilizzare per abbattere i moscerini della frutta
Vassoi del ghiaccio	Amazon	9301085269	Utilizzare per abbattere gli insetti
Insetto pinze	Amazon	B07B4767WR	Pinze per insetti
Insetticida	Sigma-Aldrich Inc	45423-250MG	Deltametrina
Adesivi per etichettatura	Amazon	B07Q4X9GWX	3/4" Adesivi a punti colorati
Nastro per etichettatura	Amazon	B00X6A1GYK	Nastro bianco
Rete	Amazon	B07F2PHHWV	Utilizzare per coprire tazze e insetti Tenda per movimentazione
Piastre Petri	Fisher Scientific	FB0875712H371	100 mm x 15 mm
Tubo in PVC	Lowe' s	23971	Materiali per tende per la movimentazione degli insetti
Elastici	Amazon	B00006IBRU	Utilizzare per fissare rete/rete su tazze
Saccarosio	Amazon	B01J78INO0	Zucchero bianco granulato
Carta per pesare	VWR	12578-165	4" x 4"