Articolo metodologico

Rimozione di un sito di partenza traslazionale interno dall'mRNA pur mantenendo l'espressione della proteina a lunghezza intera

DOI:

10.3791/63405

⸱

16 marzo 2022

 ,  ,  , 
1Nora Eccles Harrison Cardiovascular Research and Training Institute, University of Utah, 2Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il presente protocollo descrive una singola mutazione M213L in Gja1 che mantiene la generazione di Connexin43 a lunghezza intera ma impedisce la traduzione della più piccola isoforma GJA1-20k tradotta internamente.

Abstract

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Il sistema di modifica genetica CRISPR-Cas9, basato su meccanismi di riparazione del genoma, consente la generazione di modelli murini modificati geneticamente più rapidamente e facilmente rispetto alla tradizionale ricombinazione omologa. Il sistema CRISPR-Cas9 è particolarmente interessante quando si desidera una mutazione a punto singolo. La proteina gap junction, Connexin 43 (Cx43), è codificata dal gene Gja1, che ha un singolo esone codificante e non può essere spliced. Tuttavia, Gja1 produce non solo la proteina Cx43 a lunghezza intera, ma fino a sei isoforme troncate N-terminus mediante un processo noto come traduzione interna, il risultato dell'inizio della traduzione ribosomiale nei siti interni di inizio AUG (Metionina). GJA1-20k è l'isoforma troncata più comunemente generata di Cx43 iniziata al codone AUG in posizione 213 dell'mRNA Gja1. Poiché il residuo 213 si verifica alla fine dell'ultimo dominio transmembrana di Cx43, GJA1-20k è effettivamente la coda C-terminus di 20 kDa di Cx43 come proteina indipendente. Precedenti ricercatori hanno identificato, nelle cellule, che un ruolo critico di GJA1-20k è quello di facilitare il traffico di emicanali di giunzione gap Cx43 a tutta lunghezza alla membrana plasmatica. Per esaminare questo fenomeno in vivo, è stato generato un topo mutante con una mutazione puntiforme Gja1 che sostituisce l'ATG (Metionina) al residuo 213 con TTA (Leucina, mutazione M213L). Il risultato di M213L è che l'mRNA Gja1 e il Cx43 a lunghezza intera sono ancora generati, ma la traduzione di Gja1-20k è significativamente ridotta. Questo rapporto si concentra sulla scelta del sito dell'enzima di restrizione per sviluppare un modello murino mutato di un amminoacido (Gja1 M213L / M213L). Questo protocollo descrive topi geneticamente modificati dal sistema CRISPR-Cas9 e la genotipizzazione rapida combinando PCR e trattamenti enzimatici di restrizione.

Introduzione

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Il Connexin 43 (Cx43) a lunghezza intera e l'isoforma troncata N-terminus, GJA1-20k, codificati dallo stesso mRNA GJA1 ma utilizzano codoni di avvio diversi1 per avviare la traduzione. La traduzione Cx43 avviene al primo codone di avvio AUG, mentre la traduzione GJA1-20k inizia all'AUG al residuo 213. In precedenza è stato scoperto che GJA1-20k ha ruoli essenziali per il traffico di Cx43 a figura intera, la stabilizzazione dell'actina e la regolazione della morfologia mitocondriale in vitro 1,2,3.

Per comprendere il ruolo di GJA1-20k in vivo, è stato generato un modello murino "knock-out" GJA1-20k che ha mantenuto la capacità di creare Cx43 a figura intera. L'approccio è stato quello di utilizzare il sistema CRISPR-Cas9 per sostituire il singolo residuo a 213 da una metionina (M) a una leucina (L) (Gja1M213L/M213L)4. Una mutazione interna da M a L riduce drasticamente la probabilità che si verifichi una traduzione interna, ma mantiene la traduzione e la funzione della proteina4 a lunghezza intera. Poiché il tipo selvatico (WT) e l'allele mutato hanno dimensioni identiche e prodotti a mRNA quasi identici, vi è una notevole difficoltà nel confermare il genotipo nei topi. Il sequenziamento del DNA può identificare la mutazione, ma è troppo costoso e richiede tempo per l'uso di routine. In generale, sono stati stabiliti diversi metodi di genotipizzazione più rapida, come la reazione a catena della polimerasi in tempo reale (RT-PCR), la legatura minisequenziale, l'analisi della fusione ad alta risoluzione e il sistema di mutazione refrattaria amplificazione tetra-primer PCR (ARMS-PCR)5,6,7,8. Tuttavia, questi metodi alternativi richiedono più passaggi, risorse uniche e / o diversi set di primer specifici che possono indurre prodotti PCR non specifici.

Questo protocollo introduce un approccio dettagliato di targeting ed editing genico da parte di CRISPR-Cas9 per creare una singola mutazione di amminoacidi e viene presentata una rapida genotipizzazione per confermare la mutazione. L'identificazione del genotipo comporta l'uso creativo di enzimi di restrizione che utilizzano solo un singolo set di primer per identificare il gene bersaglio. I lettori sono indirizzati al riferimento4 per osservare il profondo effetto elettrofisiologico della morte cardiaca improvvisa causata da una mutazione di sostituzioneGja1 M213L / M213L di un residuo che genera ancora una proteina a lunghezza intera ma non riesce a generare un'isoforma di troncamento tradotta internamente più piccola. Questo protocollo aiuterà altri modelli murini a utilizzare una mutazione puntiforme per ridurre la traduzione interna di un'isoforma di interesse pur mantenendo l'espressione della proteina endogena a lunghezza intera.

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Protocollo

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"Tutti i protocolli di cura e studio degli animali sono stati approvati dai comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali del Cedars-Sinai Medical Center e dell'Università dello Utah. Per gli esperimenti sono stati utilizzati topi femmina C57BL/6J ottenuti da fonti commerciali a 8-9 settimane di età (vedi Tabella dei materiali).

1. Preparazione per il targeting genico

  1. Selezionare la sequenza bersaglio guida attorno al sito di mutazione bersaglio che codifica M213 utilizzando l'algoritmo web CRISPOR 4,9,10 (vedere Tabella dei materiali).
    NOTA: È stata selezionata una sequenza guida a 20 basi (ATTCAGAGCGAGAGACACCA), nel filamento opposto rispetto alla sequenza codificante GJA1, con un punteggio MIT11 di 62 in cui il potenziale sito di scissione si trova dopo 16 basi a valle del codone da mutare (ATG) (Figura 1; l'intera sequenza di crRNA è mostrata nella Tabella 1).
  2. Sintetizzare il crRNA e il tracrRNA che interagiscono con Cas9 come RNA guida12.
    NOTA: Sebbene il punteggio MIT dell'RNA guida sia 62, c'è solo una potenziale mutazione off-target con quattro disallineamenti a più di 12 basi di distanza dal PAM. Pertanto, questo RNA guida è considerato sicuro.
  3. Progettare un oligo donatore complementare alla sequenza guida per introdurre una singola sostituzione aminoacidica (da ATG a TTA; M213L) con bracci di omologia a 60 e 48 basi rispettivamente nei lati da 5' e 3'.
    NOTA: Questo oligo donatore include una mutazione puntiforme per l'interruzione del PAM (da AGG ad ACG) introducendo una mutazione silenziosa (TCC a TCG; S217S) per evitare il re-editing dopo la riparazione diretta all'omologia CRISPR (HDR)13 per l'introduzione delle mutazioni previste (Figura 1 e Tabella 1).
  4. Utilizzare NaCl (concentrazione finale di 200 mM) per precipitare 10 μg di oligos per ridurre al minimo il riporto di sale nel tampone di microiniezione pronucleare (10 mM di Tris-HCl, pH 7,5; 0,1 mM di EDTA e 100 mM di NaCl senza spermina e spermidina14).
    NOTA: Non lavare il pellet di DNA con etanolo al 70% poiché il pellet può essere sciolto nella soluzione.
  5. Mescolare 50 ng/μL di oligo donatore, 60 ng/μL di miscela crRNA/tracrRNA (rapporto molare 1:1) (dallo stadio 1.2) e 50 ng/μL della proteina eSpCas9 (vedere Tabella dei materiali) per produrre la miscela CRISPR nel volume finale 20 μL (Tabella 2). Diminuire la concentrazione dell'oligo donatore se si osserva un'elevata tossicità (ad esempio, 25 ng/μL).

2. Induzione della superovulazione, raccolta delle uova, microiniezione pronucleare della miscela CRISPR e screening della blastocisti

NOTA: questa procedura segue un protocollo generale14 pubblicato in precedenza.

  1. Iniettare 5 UI di PMSG (gonadotropina sierica della cavalla gravida) (vedere Tabella dei materiali) in 100 μL di acqua sterile a 5-10 topi a 8 settimane di età mediante un approccio intraperitoneale a circa 3:00 p.m. (giorno 1).
  2. Iniettare 5 UI di hCG (gonadotropina corionica umana) (vedere Tabella dei materiali) in 100 μL di acqua sterile alle donatrici di ovociti mediante un approccio intraperitoneale 46-48 ore dopo l'iniezione di PMSG (giorno 3). Imposta l'allevamento 1: 1 con i maschi stud.
  3. Raccogliere le uova fecondate in M2 medium con ialuronidasi, lavare tre volte in 100 μL di M2 medium intorno alle 10:00 a.m., quindi conservare in mWM15 o KSOM16 medium (giorno 4) (vedi Tabella dei materiali).
  4. Introdurre la miscela CRISPR (fase 1.3) in embrioni allo stadio 1-cellula raccolti dai topi mediante microiniezione pronucleare14 su 100 μL di M2 ricoperti di olio di paraffina in un piatto di plastica su un microscopio invertito con un'ottica che migliora il contrasto nel primo e tardo pomeriggio (Video 1).
    NOTA: La microiniezione pronucleare della miscela CRISPR è stata eseguita su embrioni in stadio a 1 cellula a 14-16 ore postcoito (p.c.). Gli embrioni iniettati sono stati coltivati in un incubatore co2 al 5% per alcune ore e trasferiti chirurgicamente a 18-20 h p.c. in topi ICR riceventi che avevano un tappo di copulazione nella stessa mattina.
  5. Trasferire 20-30 embrioni a 2 cellule in ciascun ricevente per produrre animali ricombinanti.
    NOTA: Seguire il protocollo generale14 o coltivare quegli embrioni in mWM o KSOM per 4 giorni per convalidare l'efficienza ed esaminare la tossicità. La tossicità della miscela CRISPR è accettabile quando almeno un terzo degli embrioni iniettati raggiunge precocemente lo stadio di blastocisti completamente espanso con più ricombinanti tra di loro. Allo stesso tempo, oltre il 90% degli embrioni non manipolati raggiunge lo stesso stadio di blastocisti in una coltura parallela. Seguire il passaggio 2.6-2.9 per lo screening della blastcyst che non è essenziale ma può essere fatto se si preferisce quantificare il tasso di successo dell'HDR.
  6. Prelevare individualmente blastocisti da precoci a completamente espanse con 2 μL di terreno di coltura utilizzando una punta di pipetta fine tappata con un micropipettero in singoli tubi PCR (giorno 8; Video 2).
  7. Lisare le blastocisti in 8 μL di miscela di digestione (come nella fase 3.2; vedere Tabella dei materiali) e lavorare a 75 °C per 10 min, 95 °C per 5 min, quindi raffreddare a 4 °C per la conservazione. Utilizzare 2 μL del lisato come modello per la PCR in una miscela PCR totale di 15 μL (fase 3).
  8. Esaminare l'efficacia dell'HDR mediante elettroforesi su gel di agarosio17 dei campioni PCR a seguito di digestione di restrizione con NlaIII (fase 3-5).
  9. Confermare lo stato di ricombinazione mirata sequenziando l'amplicon17 a 668 bp nei fondatori e nella successiva progenie per confermare l'integrità della mutazione.

3. Estrazione del DNA

NOTA: I topi al giorno 10 postnatale sono stati utilizzati per questo esperimento a causa della morte improvvisa del topo knock-out GJA1-20k circa 2-4 settimane dopo la nascita4. Un protocollo più generale può anche essere applicato a seguito della relazione18 precedentemente pubblicata.

  1. Tagliare 1-3 mm della punta o della punta della coda con forbici pulite e trasferirlo in un tubo PCR a 8 strisce da 0,2 ml. Per evitare la contaminazione tra i campioni di punta o di coda, utilizzare forbici pre-pulite o una lama per mouse o pulire prima di ogni campione utilizzando il 70% di etanolo o il 10% di candeggina. Se la coda sanguina dopo il campionamento, applicare una breve pressione con una garza per fermare il sanguinamento. Conservare i campioni di coda a -20 °C fino all'estrazione per un massimo di circa una settimana.
  2. Aggiungere la soluzione di lisi tissutale (vedere Tabella dei materiali) in un tubo da 100 μL e mescolare bene, seguita da spin-down con una minicentrifiva da tavolo (2.200 x g per 10 s a temperatura ambiente). Assicurarsi che i campioni di coda siano immersi nella soluzione.
  3. Impostare i tubi su un ciclo termico impostato dal seguente programma; 75 °C per 10 min (lisi tissutale), 95 °C per 5 min (inattivazione) e 4 °C (mantenimento). Conservare il lisato tissutale a 4 °C per un massimo di una settimana se le PCR non possono essere eseguite immediatamente.

4. Amplificazione del DNA mediante PCR

  1. Preparare una soluzione PCR contenente 5 μL di H2O senza nucleasi, 0,75 μL di Primer avanti e indietro da 10 μM e 7,5 μL di miscela master PCR (vedere Tabella dei materiali) per campione in nuovo tubo PCR (vedere Tabella 1 per le sequenze di primer). Se ci sono più campioni, scalare il contenuto ad aliquota 14 μL per tubo.
  2. Aggiungere 1 μL di lisato tissutale alla soluzione PCR preparata al punto 3.1. Fai attenzione a non toccare la coda.
  3. Mescolare bene e girare verso il basso con una mini-centrifuga da tavolo (2.200 x g per 10 s a temperatura ambiente).
  4. Impostare i tubi su un ciclo termico impostato dal programma di seguito menzionato. Conservare i prodotti PCR a 4 °C per 1-2 mesi o ~1 anno a -20 °C.
    NOTA: 95 °C per 3 min (step 1, Initial Denaturation), 95 °C per 15 s (step 2, Denaturation), 60 °C per 15 s (step 2, Annealing), 72 °C per 45 s (step 2, Extension), ripetere il step 2 per 35 cicli, 72 °C per 10 min (step 3, Final Extension) e 4 °C (step 4, Holding).

5. Incubazione con enzima di restrizione

  1. Preparare la soluzione enzimatica contenente 7 μL di H2O privo di nucleasi, 2 μL di tampone CutSmart 10x e 1 μL di enzima di restrizione NlaIII (vedere Tabella dei materiali). Se ci sono più campioni, moltiplicare ogni contenuto per ottenere la miscela e l'aliquota 10 μL per tubo.
  2. Aggiungere 10 μL di prodotto PCR ottenuto nella fase 3 alla soluzione enzimatica per tubo.
  3. Mescolare bene e girare verso il basso con una mini-centrifuga da tavolo (2.200 x g per 10 s a temperatura ambiente).
  4. Impostare i tubi su un ciclo termico o un blocco termico impostato dal programma di seguito menzionato. Conservare il prodotto dopo l'incubazione a 4 °C per 1-2 mesi o ~1 anno a -20 °C.
    NOTA: 37 °C per 16 ore (almeno 2 ore; un breve tempo di incubazione può comportare una scissione insufficiente) e 4 °C per l'attesa.

6. Rilevamento della banda del DNA

  1. Preparare un gel di agarosio all'1,5% contenente una macchia di gel di DNA per l'elettroforesi.
    1. Aggiungere 0,75 g di agarosio in 50 mL di 1x tampone TAE seguito da mescolare e riscaldare nel microonde fino a quando l'agarosio si dissolve completamente. Dopo il raffreddamento, aggiungere 5 μL di macchia di DNA e mescolare delicatamente.
    2. Versare nello stampo gel (25 ml per stampo) e lasciare che il gel si solidifichi. Per ottenere una migliore risoluzione e separazione, aumentare la concentrazione di agarosio al 2,5%-4% secondo necessità.
  2. Caricare 10 μL di prodotto PCR digerito sul pozzo. Mescolare 6x buffer di caricamento, se necessario.
  3. Eseguire il gel con 100 V per 35 min.
    NOTA: potrebbe essere necessario ottimizzare questi parametri.
  4. Immagine sotto luce UV (lunghezza d'onda 302 nm).

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Risultati

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Il sistema di modifica genetica CRISPR/Cas9 produce una mutazione da ATG a TTA e una mutazione silenziosa da TCC a TCG a 56.264.279 a 56.264.281 e a 56.264.291 a 56.264.293 sul cromosoma 10 del topo, o da 869 a 871 e da 881 a 883 sull'mRNA Gja1, rispettivamente. Questa mutazione si traduce in una mutazione da metionina 213 a leucina (M213L) sulla proteina GJA1 e la mutazione da TTC a TTG interrompe una sequenza PAM vicina per evitare l'edizione indesiderata del gene (Figura 1). I dettagli de...

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Discussione

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Un modello murino geneticamente modificato è un approccio comune per comprendere la funzione genica. Tuttavia, poiché l'isoforma tradotta internamente GJA1-20k viene tradotta dallo stesso mRNA Gja1 del Cx43 a lunghezza intera, è stata ideata una strategia creativa per mantenere l'espressione Cx43 a lunghezza intera ma sopprimere l'espressione GJA1-20k. L'approccio si basa su una mutazione del codone di partenza interno di GJA1-20k. Con una singola mutazione puntiforme, M213 è stato commutato in L sull'mRNA G...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Il progetto è stato sostenuto da sovvenzioni del National Institutes of Health (R01HL152691, R01HL138577 e R01HL159983) a RMS.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provetta PCR a 8 strisce da 0,2 mLThomasScientific 1148A28
0,5 M EDTA pH 8,0Invitrogen15575-038Per tampone per micoriniezione pronucleare
10x tampone CutSmartNew England BiolabsB7204S Tamponeper digestione per NlaIII
1 M Tris-HCl pH 7,5Invitrogen15567-027Per tampone per micoriniezione pronucleare
50x TAE BufferInvitrogen24710-030
Termociclatore a 96 pozzettiBiosistemi applicatiModello # 9902
AgarosioSigma-AldrichA9539
C57BL/6JThe Jackson Laboratory664ceppo di topo
Chemidoc MP sistema di imagingBio-radPer scattare un'immagine su gel con la proteina
eSpCas9 a luce UV a 302 nmMilliporeSigmaESPCAS9PRO-50UG
Gel Lading Dye Purple (6x)New England BiolabsB7024S Tamponedi caricamento per elettroforesi
Guanti
hCG (gonadotropina corionica umana)MilliporeSigma23-073-425G
IaluronidasiMilliporeSigmaH3884-100MG
Image Lab softwareBio-radPer analizzare l'immagine del gel
Stereomicroscopio invertito con plasDICZeissAxiovert A1
KAPA Kit di genotipizzazione del topoRoche DiagnosticsKK7352Per la lisi di tessuti o cellule, l'estrazione del DNA e la master mix PCR
KSOMLifeGlobalZEKS-050Terreno di coltura embrionale
Lab coart
M2MilliporeSigmaMR015D
NlaIIINew England BiolabsR0125SPer digerire il prodotto PCR
Acqua senza nucleasiAmbionAM9937Per diluire i reagenti
Olio di paraffinaNacalai USA2613785
Plugged 20 μ L puntale per pipetta fineFisherScientific02-707-171Per prelevare blastociti
PMSG (cavalla gravida' s gonadotropina sierica)ProSpec-TanyHOR-272
Cloruro di sodioInvitrogenAM9760GPer tampone di micoriniezione pronucleare
SYBR sicuro DNA Gel StainInvitrogenS33102Per rilevare bande in gel
tracrRNADharmaconU-002000-120Guid RNA

Riferimenti

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Editing genetico CRISPR Cas9Traduzione internaConnessina 43Mutazione puntiforme di Gja1Generazione di modelli muriniGenotipizzazione PCRDigestione con enzimi di restrizioneElettroforesi su gel di agarosioPurificazione del donatore oligoEfficienza dell editing genomico

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