Articolo metodologico

Un metodo passo-passo per rilevare gli anticorpi neutralizzanti contro l'AAV utilizzando un test colorimetrico basato su cellule

DOI:

10.3791/63419

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7 dicembre 2021

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1Baker Heart and Diabetes Institute, 2Department of Physiology, Anatomy and Microbiology, La Trobe University, 3Florey Institute of Neuroscience and Mental Health, University of Melbourne, 4Department of Physiology, Centre for Muscle Research (CMR), The University of Melbourne, 5Department of Diabetes, Central Clinical School, Monash University, 6Baker Department of Cardiometabolic Health, The University of Melbourne, 7Department of Physiology and Department of Medicine Alfred Hospital, Monash University

In questo articolo

Sommario

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Un protocollo di laboratorio completo e un flusso di lavoro di analisi sono descritti per un test colorimetrico basato su cellule rapido, economico e semplice per rilevare elementi neutralizzanti rispetto ad AAV6.

Abstract

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I virus adeno-associati ricombinanti (rAAV) hanno dimostrato di essere un vettore sicuro e di successo per il trasferimento di materiale genetico per il trattamento di varie condizioni di salute sia in laboratorio che in clinica. Tuttavia, gli anticorpi neutralizzanti preesistenti (NAbs) contro i capsidi AAV rappresentano una sfida continua per la somministrazione di successo delle terapie geniche sia in modelli sperimentali su grandi animali che in popolazioni umane. Lo screening preliminare per l'immunità dell'ospite contro l'AAV è necessario per garantire l'efficacia delle terapie geniche basate su AAV sia come strumento di ricerca che come agente terapeutico clinicamente valido. Questo protocollo descrive un test colorimetrico in vitro per rilevare fattori neutralizzanti contro il sierotipo 6 AAV (AAV6). Il test utilizza la reazione tra un AAV che codifica per un gene reporter della fosfatasi alcalina (AP) e il suo substrato NBT / BCIP, che genera una macchia viola quantificabile insolubile sulla combinazione.

In questo protocollo, i campioni di siero sono combinati con un AP che esprime AAV e incubati per consentire il verificarsi di una potenziale attività neutralizzante. La miscela di siero virale viene successivamente aggiunta alle cellule per consentire la trasduzione virale di eventuali AAV che non sono stati neutralizzati. Il substrato NBT/BCIP viene aggiunto e subisce una reazione cromogenica, corrispondente alla trasduzione virale e all'attività neutralizzante. La proporzione di area colorata viene quantificata utilizzando uno strumento software libero per generare titoli neutralizzanti. Questo test mostra una forte correlazione positiva tra colorazione e concentrazione virale. La valutazione di campioni di siero di pecora prima e dopo la somministrazione di un AAV6 ricombinante ha portato ad un drammatico aumento dell'attività neutralizzante (da 125 a >10.000 volte). Il test ha mostrato un'adeguata sensibilità per rilevare l'attività neutralizzante in >1:32.000 diluizioni sieriche. Questo test fornisce un metodo semplice, rapido ed economico per rilevare nAbs contro AAV.

Introduzione

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I virus adeno-associati (AAV) sono sempre più utilizzati come vettori per la somministrazione di terapie geniche a trattamenti sperimentali per varie condizioni di salute che hanno un impatto sul sistema cardiovascolare, polmonare, circolatorio, oculare e nervoso centrale1,2,3,4,5. La popolarità dei vettori AAV come piattaforma leader nella terapia genica deriva dal loro profilo di sicurezza positivo, dall'espressione transgenica a lungo termine e dai trofismi tessuto-specifici ad ampio ra....

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Protocollo

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Tutti gli aspetti della cura e della sperimentazione degli animali sono stati condotti seguendo le linee guida del Florey Institute of Neuroscience and Mental Health e il Codice australiano per la cura e l'uso degli animali a fini scientifici seguendo Reference25. Per lo studio sono state utilizzate pecore Merino di 1,5-3 anni. Una panoramica schematica del protocollo di analisi è fornita nella Figura 1.

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Risultati

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Saggio di trasduzione per stabilire il dosaggio virale ottimale per la copertura delle piastre
Le cellule HT1080, una linea di cellule di fibrosarcoma ben consolidata, sono state selezionate per questo test. Una concentrazione di 1 x 104 cellule HT1080 / pozzo ha fornito ~ 50% di confluenza cellulare in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Per determinare la concentrazione virale ottimale per il test, un rAAV che codifica per un gene reporter hPLAP (fosfatasi alcalina placentare u.......

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Discussione

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Questo rapporto descrive un saggio colorimetrico che valuta l'entità della neutralizzazione AAV in un dato campione di siero valutando una reazione cromogenica corrispondente al grado di trasduzione virale in vitro. Lo sviluppo del protocollo si è basato sulla nota reazione cromogenica tra l'enzima fosfatasi alcalina e NBT/BCIP, che è stato ampiamente utilizzato come strumento di colorazione per la rilevazione di bersagli proteici in applicazioni come l'immunoistochimica e come strumento reporter per la valutazi.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo studio è stato finanziato da un National Health and Medical Research Council Project Grant a JRM e CJT (ID 1163732) e in parte dal programma di supporto alle infrastrutture operative del governo vittoriano. SB è supportato da una borsa di studio congiunta Baker Heart and Diabetes Institute-La Trobe University Doctoral. KLW è supportato da The Shine On Foundation e da una Future Leader Fellowship della National Heart Foundation of Australia (ID 102539). JRM è supportato da una borsa di ricerca senior del National Health and Medical Research Council (ID 1078985).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,05% Tripsina/EDTAGibco25300-054
50 mL provetta da centrifuga conicaFalcon14-432-22O equivalente
75 cm2 palloni quadratiFalcon353136O equivalente
96 pozzetti piastra a fondo piattoFalcon353072
AAV6-CMV-hPLAP VectorRicerca muscolare & Laboratorio terapeutico (Università di Melbourne, Australia) AAV6-CMV-hPLAP può essere fornito su richiesta.
Foglio di
Anticorpo monoclonale di topo anti-AAV6 (particella intatta), (ADK6)PROGEN610159Anticorpo monoclonale a controllo positivo
BCIP/NBTSIGMAFASTB5655
Cabina
PipettaInserti
stripette da 5 e 10 mLSiero fetale bovinoGibco10099-141
Emocitometro
Alto glucosio Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Cellule Gibco11965118
HT1080
ImageJDisponibile gratuitamente: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
37 gradi C, 5% CO2
Microscopio con fotocameraIn grado di scattare foto con un obiettivo 4x
FornoPer un 65 ° C incubazione
ParaformaldeideMERCK30525-89-4
Penicillina StreptomicinaGibco15140-122
salina tamponata con fosfato
Pipette e puntali20 μ L, 200 μ L & Pipette singole da 1 mL e puntali & 200 μ Pipetta multicanale L
Filtro a sgancio rapido StericupMilliporeS2GPU10REUtilizzato per combinare i reagenti dei terreni
Soluzione di tripano bluSigma-AldrichT8154
VACUETTE TUBE 8 ml CAT Serum Separator Clot ActivatorGreiner BIO-ONE455071Utilizzato per la raccolta e la lavorazione del siero da pecore
Bagno
alluminiodi sicurezza per colture cellulari e tissutali elettronica Software ATCC Incubatore Soluzione d'acqua

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bass-Stringer, S., et al. Adeno-associated virus gene therapy: Translational progress and future prospects in the treatment of heart failure. Heart, Lung and Circulation. 27 (11), 1285-1300 (2018).
  2. Casey, G. A., Papp, K. M., MacDonald, I. M.

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Rilevazione di anticorpi neutralizzantisaggio colorimetrico AAV6AAV ricombinanteneutralizzazione del sieroreporter della fosfatasi alcalinatrasduzione viraleanalisi con ImageJmolteplicit di infezionesaggio con anticorpi monoclonali

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