Articolo metodologico

Motilità di singole molecole e cluster di Kinesin-5 Cin8 bidirezionale purificata da cellule S. cerevisiae

2.3K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/63425

⸱

2 febbraio 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Ben-Gurion University of the Negev, Israel, 2Department of Biotechnology Engineering, Ben-Gurion University of the Negev, Israel

In questo articolo

Avviso di errata corrige

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Sommario

La cinesina mitotica bidirezionale-5 Cin8 si accumula in ammassi che si dividono e si fondono durante la loro motilità. L'accumulo negli ammassi cambia anche la velocità e la direzionalità di Cin8. Qui viene descritto un protocollo per saggi di motilità con Cin8-GFP purificato e analisi delle proprietà mobili di singole molecole e cluster di Cin8.

Abstract

I motori mitotici bipolari kinesin-5 svolgono funzioni essenziali nella dinamica del mandrino. Questi motori presentano una struttura omo-tetramerica con due coppie di domini motori catalitici, situati alle estremità opposte del complesso attivo. Questa architettura unica consente ai motori kinesin-5 di reticolare e far scorrere i microtubuli antiparallelo del mandrino (MT), fornendo così la forza diretta verso l'esterno che separa i poli del mandrino. In precedenza, si riteneva che i motori kinesin-5 fossero esclusivamente diretti verso il plus-end. Tuttavia, studi recenti hanno rivelato che diversi motori fungini kinesin-5 sono meno diretti a livello di singola molecola e possono cambiare direzionalità in varie condizioni sperimentali. Il Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 è un esempio di tale proteina motoria bidirezionale: in condizioni di elevata forza ionica singole molecole di Cin8 si muovono nella direzione meno-estremità delle MT. È stato anche dimostrato che Cin8 forma ammassi mobili, prevalentemente all'estremità negativa delle MT, e tale clustering consente a Cin8 di cambiare direzionalità e subire una motilità lenta e diretta plus-end. Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato per tutte le fasi di lavoro con kinesin-5 Cin8 con tag GFP, dalla sovraespressione proteica nelle cellule di S. cerevisiae e la sua purificazione al saggio di motilità a singola molecola in vitro . Un metodo di nuova concezione qui descritto aiuta a distinguere tra singole molecole e cluster di Cin8, in base alla loro intensità di fluorescenza. Questo metodo consente un'analisi separata della motilità di singole molecole e cluster di Cin8, fornendo così la caratterizzazione della dipendenza della motilità di Cin8 dalla sua dimensione del cluster.

Introduzione

Un gran numero di eventi di motilità all'interno delle cellule eucariotiche sono mediati dalla funzione delle proteine motorie molecolari. Questi motori si muovono lungo i filamenti citoscheletrici, i filamenti di actina e i microtubuli (MT) e convertono l'energia chimica dell'idrolisi dell'ATP in forze cinetiche e meccaniche necessarie per guidare la motilità biologica all'interno delle cellule. La S. cerevisiae Cin8 basata su MT è una proteina motoria bipolare omotetramerica kinesin-5 che reticola e fa scorrere le MT a parte1. Cin8 svolge funzioni essenziali durante la mitosi, nell'assemblaggio del mandrino 2,3,4 e nell'allungamento del mandrino durante l'anafase 5,6,7. In precedenza, era stato dimostrato che Cin8 è un motore bidirezionale, che commuta la direzionalità in diverse condizioni sperimentali. Ad esempio, in condizioni di elevata resistenza ionica, i singoli motori Cin8 si muovono verso l'estremità negativa degli MT, mentre nei cluster, nei saggi di scorrimento MT multimotore e tra GLI MT antiparallelo, i motori Cin8 si muovono principalmente verso le estremità più degli MT 8,9,10,11,12 . Questi risultati sono stati altamente inaspettati a causa di diversi motivi. In primo luogo, Cin8 porta il suo dominio motorio catalitico all'ammino-terminale e tali motori erano precedentemente ritenuti esclusivamente diretti verso il plus-end, mentre Cin8 ha dimostrato di essere minus-end diretto a livello di singola molecola. In secondo luogo, si credeva che i motori kinesin fossero unidirezionali, diretti meno-end o plus-end, mentre Cin8 si è dimostrato bidirezionale, a seconda delle condizioni sperimentali. Infine, a causa dell'orientamento MT al mandrino mitotico, il ruolo classico dei motori kinesin-5 nella separazione dei poli del mandrino durante l'assemblaggio del mandrino e l'anafase B potrebbe essere spiegato solo dalla loro motilità diretta plus-end sugli MT che reticolano 1,13. A seguito dei primi rapporti sulla bidirezionalità di Cin8, alcuni altri motori kinesin sono stati dimostrati bidirezionali 14,15,16, indicando che la motilità bidirezionale dei motori kinesin potrebbe essere più comune di quanto si credesse in precedenza.

È stato precedentemente riportato che nelle cellule, Cin8 si muove anche in modo bidirezionale8, sostenendo l'idea che la motilità bidirezionale di alcuni motori kinesin-5 sia importante per le loro funzioni intracellulari. Inoltre, poiché i tre motori kinesin-5 che sono stati segnalati come bidirezionali provengono da cellule fungine, un possibile ruolo per la bidirezionalità dei motori kinesin-5 è stato recentemente proposto in tali cellule10. Secondo questo modello, nella mitosi chiusa delle cellule fungine, dove l'involucro nucleare non si rompe durante la mitosi, i motori kinesin-5 forniscono la forza iniziale che separa i poli del mandrino prima dell'assemblaggio del mandrino. Per eseguire questo compito, prima della separazione dei poli del mandrino, i motori kinesin-5 si localizzano vicino ai poli del mandrino, per la loro motilità diretta all'estremità inferiore su singoli MT nucleari. Una volta in questa posizione, i motori kinesin-5 si raggruppano, commutano la direzionalità, catturano e collegano incrociato i NET dai poli del mandrino vicini. Successivamente, i motori kinesin-5 forniscono la separazione iniziale dei poli mediante motilità diretta plus-end sugli MT che reticolano. Con questo modello, sia la motilità diretta minus-end su singoli MT che la motilità diretta plus-end su MT reticolati durante lo scorrimento antiparallelo sono necessarie affinché i motori fungini kinesin-5 svolgano i loro ruoli nell'assemblaggio mandrino 1,13.

L'obiettivo generale del metodo descritto è quello di ottenere kinesin-5 Cin8 fungina di elevata purezza marcata con GFP e di eseguire saggi di motilità a singola molecola (Figura 1) analizzando separatamente la motilità di singole molecole e cluster di Cin8. La separazione tra singole molecole e cluster è importante poiché uno dei fattori che ha dimostrato di influenzare la direzionalità di Cin8 è il suo accumulo in cluster sulle MT10,12. Saggi di motilità alternativi, come i saggi di scorrimento superficiale MT e MT sliding non forniscono informazioni sull'attività delle proteine monomotore17,18. I robusti metodi di analisi e analisi della motilità a singola molecola qui descritti sono stati applicati con successo per caratterizzare diversi aspetti dei motori kinesin-5, Cin8 e Kip1 10,11,12,14,19,20.

Qui viene presentato un protocollo dettagliato per la sovraespressione e la purificazione di Cin8, la polimerizzazione delle MT e il test di motilità a singola molecola. Inoltre, vengono descritte anche le analisi per differenziare tra singole molecole e cluster di Cin8 e per determinare le velocità di singolo motore e cluster mediante l'analisi dello spostamento medio (MD) e dello spostamento quadrato medio (MSD). Questo protocollo ha lo scopo di aiutare i ricercatori a visualizzare tutte le fasi delle procedure e assistere nella risoluzione dei problemi di questo tipo di test.

figure-introduction-1
Figura 1: Rappresentazione schematica del saggio di motilità a singola molecola. Le MT fluorescenti biotinilate sono attaccate alla superficie del vetro, rivestite con Avidin che interagisce con il BSA biotinilato attaccato alla superficie. La freccia verde rappresenta la direzione del movimento di singole molecole Cin8 in condizioni di elevata forza ionica. +/- rappresenta la polarità della MT. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

1. Preparazione di tamponi e reagenti

  1. Buffer
    1. -Leu aa dropout mix: mescolare 2 g ciascuno di adenina, uracile, triptofano, istidina, lisina e metionina e conservare a temperatura ambiente.
    2. Mezzo selettivo di lievito con raffinosio (1 L): Mescolare 6,7 g di base di azoto lievitato (con solfato di ammonio), 2 g di miscela di -Leu aa dropout e 20 g di raffinosio in acqua a doppia distillazione mescolando (senza riscaldamento) fino a completa dissoluzione. Utilizzando un filtro da 0,22 μm, filtrare la soluzione in un flacone sterile.
    3. Tampone di lisi: Preparare 25 mL di soluzione in acqua triplo distillata (TDW) composta da 50 mM Tris, 30 mM Pipes, 500 mM KCl, 10% glicerolo, 1,5 mM β-mercaptoetanolo, 1 mM MgCl2, 0,1 mM ATP e 0,1% Triton X-100. Regolare il pH a 8 utilizzando 6 M HCl.
    4. Tampone di eluizione: Preparare 10 mL di soluzione in TDW composta da 50 mM Tris, 30 mM Tubi, 500 mM KCl, 350 mM imidazolo, 10% glicerolo, 1,5 mM β-mercaptoetanolo, 1 mM MgCl2, 0,1 mM ATP e 0,1% Triton X-100. Regolare il pH a 7,2 utilizzando 6 M HCl.
    5. Tampone P12: preparare 10 mL di una soluzione in TDW composta da 12 mM di tubi, 1 mM EGTA e 2 mM di MgCl2. Regolare il pH a 6,9 utilizzando 10 M NaOH.
    6. Tampone BRB80: preparare 50 mL di una soluzione composta da 80 mM di tubi, 1 mM di EGTA e 2 mM di MgCl2 in acqua ultrapura. Regolare il pH a 6,9 utilizzando 10 M NaOH.
    7. Tampone generale di tubulina (GTB): preparare 50 mL di una soluzione composta da 80 mM di tubi, 0,5 mM di EGTA e 2 mM di MgCl2 in acqua ultrapura. Regolare il pH a 6,9 utilizzando 10 M NaOH.
    8. Soluzione Tris-Pipes: Preparare 40 mL di soluzione 1M Tris-0,6 M Pipes mescolando 6,055 g di Tris e 9,07 g di Tubi in TDW e regolare il pH a 7,2 utilizzando 6 M HCl. Portare il volume finale a 50 mL con TDW.
      NOTA: i tamponi P12, BRB80 e Tris-Pipes vengono utilizzati per la preparazione di soluzioni di riserva per il saggio di motilità. Questi tamponi possono essere preparati in grandi quantità, aliquotati in tubi da 1,5 ml, congelati a scatto e conservati a -20 °C.
  2. Soluzioni stock per il saggio di motilità
    1. Tubulina (10 mg mL-1): Sciogliere 1 mg di tubulina liofilizzata in 100 μL di tampone di tubulina generale (GTB) freddo (4 °C). Congelare a scatto aliquote da 1 μL e conservarle a -80 °C.
    2. Tubulina biotinilata (1 mg mL-1): Sciogliere 20 μg di tubulina liofilizzata in 20 μL di GTB fredda. Congelare a scatto aliquote da 1 μL e conservarle a -80 °C.
    3. Tubulina marcata con rodamina (1 mg mL-1): Sciogliere 20 μg di tubulina liofilizzata in 20 μL di GTB fredda. Congelare a scatto aliquote da 0,5 μL e conservarle a -80 °C.
    4. GMPCPP (10 μM): GMPCPP è ottenuto dal fornitore come soluzione acquosa da 100 μL e conservato a -80 °C. Scongelare il flaconcino con GMPCPP sul ghiaccio. Preparare aliquote da 1 μL, congelarle a scatto e conservarle a -80 °C.
    5. ATP: Preparare una soluzione da 500 μL di ATP da 100 mM in tampone Tris da 0,5 M (pH 8). Congelare a scatto aliquote da 2 μL e conservarle a -20 °C.
    6. MgCl2: Preparare 1 mL di soluzione da 200 mM MgCl2 in tampone P12. Conservare aliquote da 5 μL a -20 °C.
    7. Caseina: Preparare una soluzione da 1 mL di 5 mg di mL-1 caseina in tampone BRB 80. Congelare a scatto aliquote da 10 μL e conservarle a -20 °C.
    8. D-glucosio: preparare una soluzione da 1 mL di 1 M di D-glucosio in tampone P12. Conservare aliquote da 10 μL a -20 °C.
    9. Glucosio ossidasi: Preparare una soluzione da 1 mL di 10 mg di mL-1 glucosio ossidasi in tampone P12. Congelare a scatto aliquote da 2 μL e conservarle a -20 °C.
    10. Catalasi: Preparare una soluzione da 1 mL di 0,8 mg di mL-1 catalasi in tampone P12. Surgelare a scatto aliquote da 2 μL e conservare a -20 °C.
    11. Ditiotreitolo (DTT): Preparare una soluzione da 1 mL di 1 M DTT in tampone P12 in una cappa aspirante. Congelare a scatto aliquote da 10 μL e conservarle a -20 °C.
    12. Creatina fosfato: Preparare una soluzione da 1 mL di 1 M di creatina fosfato in tampone P12. Congelare a scatto aliquote da 2 μL e conservarle a -20 °C.
    13. Creatina fosfochinasi: Preparare una soluzione da 1 mL di 5 mg di creatinfosfochinasi mL-1 in glicilglicina da 0,25 M, pH 7,4. Congelare a scatto aliquote da 2 μL e conservarle a -20 °C.
    14. EGTA: Preparare una soluzione EGTA da 100 mM in acqua ultrapura e conservarla a temperatura ambiente.
    15. KCl: Preparare una soluzione di KCl da 1 M in acqua ultrapura e conservarla a temperatura ambiente.
  3. Tampone di motilità e miscela di reazione
    1. Tampone di motilità (MB) con 145 mM KCl, 2x stock: Preparare 1 mL di 2x stock del tampone di motilità mescolando 100 μL di soluzione Tris-Pipes prefabbricata, 20 μL di 100 mM EGTA, 290 μL di KCl e 590 μL di TDW. Tenere il tampone sul ghiaccio.
    2. Miscela di reazione di motilità: preparare la miscela di reazione di motilità secondo la Tabella 1 e conservarla sul ghiaccio.
VolumeCeppoNome del reagente
50 μL2 volteMB (dal passaggio 1.3.1)
40 μL-TDW ·
1 μL100 metriATP
1 μL200 metri quadratiMgCl2
2 μL5 mg/mlCaseina
1 μL1 MGlucosio
1 μL1 MDTT ·
1 μL10 mg/mlGlucosio ossidasi
1 μL8 mg/mLCatalasi
1 μL1 MCreatinfosfato
1 μL5 mg/mlCreatina fosfochinasi
100 μLTotale

Tabella 1.

2. Sovraespressione e purificazione di Cin8 da cellule di S. cerevisiae

  1. Coltivare cellule di S. cerevisiae contenenti il plasmide per sovraespressione di Cin8-GFP-6His alla fase di crescita esponenziale (OD600 = 0,6-0,8) in 1 L di mezzo selettivo di lievito integrato con raffinosio al 2% (vedi passo 1.1.2) a 28 °C12.
  2. Indurre Cin8-GFP-6La sua sovraespressione con l'aggiunta del 2% di galattosio. Monitorare la crescita della coltura del lievito misurando l'assorbanza a 600 nm.
  3. Cinque ore dopo l'aggiunta di galattosio, raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 4.000 x g per 15 minuti a 4 °C, sospendere le cellule nel tampone di lisi e congelare nel liquido N2.
    NOTA: le celle congelate possono essere conservate a -80 °C per un ulteriore utilizzo o immediatamente macinate nel liquido N2.
  4. Macinare le celle congelate nel liquido N2 usando mortaio refrigerato e pestello. Aggiungere il liquido N2 durante la macinazione per mantenere gli estratti congelati. In genere richiede 4-5 volte l'aggiunta di N2 liquido.
  5. Monitorare la lisi cellulare mediante osservazione al microscopio a contrasto di fase o DIC.
  6. Scongelare le celle di terra e centrifugare a 21.000 x g per 30 minuti a 4 °C. Caricare il surnatante su una colonna di flusso gravitazionale riempita con 2 ml di Ni-NTA e pre-bilanciata con tampone di lisi. Lascia che il surnatante fluisca attraverso la colonna.
  7. Lavare la colonna con cinque volumi di colonne di tampone di lisi e quindi con cinque volumi di colonna di tampone di lisi integrati con 25 mM di imidazolo.
  8. Elute Cin8-GFP-6His con tampone di eluizione (vedere punto 1.1.4).
  9. Analizzare i campioni eluiti mediante frazionamento SDS-PAGE, seguito dalla colorazione blu Coomassie e dall'analisi western blot sondata con α-GFP19.
  10. Raggruppare le frazioni contenenti Cin8-GFP-6His (passaggi 2.8 e 2.9). Inoltre, purificarli mediante cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) ad una portata di 0,5 mL min-1 e limite di pressione in colonna di 1,5 MPa, con monitoraggio simultaneo dell'assorbanza a 280 nm e dell'emissione di florescenza GFP con eccitazione a 488 nm (Figura 2A).
  11. Raccogliere le frazioni corrispondenti al tetramero Cin8-GFP e analizzarle mediante SDS-PAGE e western blotting (vedere passo 2.9) (Figura 2B).
  12. Stimare la concentrazione di proteine utilizzando la spettrofotometria o saggi biochimici come il saggio di Bradford, il saggio BCA ecc.
  13. Aliquotare le frazioni selezionate, congelare a scatto nel liquido N2 e conservare fino all'uso a -80 °C. Questi campioni di proteine purificate possono essere utilizzati per 6 mesi.
    NOTA: Cin8-GFP è sovraespresso e purificato da un ceppo di S. cerevisiae carente di proteasi contenente un plasmide di 2 μm per Cin8-GFP-6La sua sovraespressione dal promotore inducibile del galattosio, LGY 4093: MATα, leu2-3,112, reg-1-501, ura3-52, pep4-3, prb1-1122, gal1, pOS7 (2μ, LEU2, P GAL1-CIN8-GFP-6HIS). Il ceppo di lievito e il plasmide sono disponibili su richiesta.

figure-protocol-1
Figura 2: Purificazione di Cin8-GFP. (A) Il cromatogramma di esclusione dimensionale di Cin8-GFP purificato da Ni-NTA, con rilevamento continuo della fluorescenza GFP attraverso l'eccitazione e l'emissione di 488 nm a ~ 510 nm. Il tetramero Cin8-GFP eluisce a ~10 mL dalla colonna SEC (contrassegnata da una freccia). (B) Gel SDS-PAGE colorato con coomassie (in alto) e western blot α-GFP (in basso) di frazioni Cin8-GFP eluite da SEC. I campioni nelle corsie sono i seguenti: M - Molecular weight marker, Ni2+- Ni-NTA purificato Cin8-GFP campione caricato nella colonna SEC, frazioni GF: frazione corrispondente all'eluizione Cin8-GFP SEC come indicato nel pannello A. La freccia a destra indica la dimensione del monomero Cin8-GFP (previsto sulla SDS-PAGE). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Saggio di motilità a singola molecola con il Cin8 purificato

  1. Polimerizzazione di BIOTINA e RODAMINA marcati MT, stabilizzati con GMPCPP.
    1. Iniziare la polimerizzazione MT mescolando i seguenti componenti in un tubo da 1,5 mL: 1 μL di proteina tubulina da 10 mg/mL, 1 μL di tubulina biotinilata da 1 mg/mL, 0,5 μL di tubulina marcata con rodamina da 1 mg/mL, 1 μL di 10 mM GMPCPP e 6,5 μL di tampone tubulinico generale (GTB). Incubare la miscela per 1 ora a 37 °C.
    2. Dopo la polimerizzazione MT, aggiungere 80 μL di GTB caldo (37 °C), mescolare accuratamente e centrifugare a 16.500 x g per 20 min.
    3. Scartare il surnatante e sospendere nuovamente il pellet con attenzione pipettando su e giù con 50 μL di GTB caldo. Conservare la sospensione a 28 °C.
    4. Esaminare le MT con un microscopio a fluorescenza utilizzando il canale della rodamina da 647 nm (Figura 3A).
      NOTA: Per ottenere MT marcati fluorescenti biotinilati, la reazione di polimerizzazione contiene tubulina non etichettata, nonché tubulina biotinilata ed etichettata fluorescentemente. In questo protocollo, viene utilizzata tubulina marcata con rodamina, ma possono essere utilizzati anche altri coniugati fluorescenti.
  2. Assemblaggio della camera di flusso
    1. Assemblare una camera di flusso posizionando quattro strisce di nastro biadesivo (~ 4 cm x ~ 3 mm) su una slitta di vetro adesiva avanzata (parallela al bordo più lungo e ~ 3-4 mm di distanza) per creare tre "corsie" tra le strisce di nastro. Rimuovere la carta protettiva dalle strisce di nastro e posizionare una coverslip10 silanizzata sulle strisce di nastro per creare tre camere di flusso di ~ 10 μL di volume.
  3. Immobilizzazione MT sulla superficie rivestita di avidina (Figura 1)
    1. Rivestire il coverslip silanizzato perfondendo con 15 μL di 1 mg/mL di albumina sierica bovina biotinilata (b-BSA, disciolta in GTB) nella camera di flusso utilizzando una micropipetta. Dopo 5 minuti, lavare la camera con 80 μL di GTB.
    2. Successivamente, come nel passaggio 3.3.1, inserire nella camera di flusso 15 μL di 1 mg/mL di Avidina (disciolta in GTB) che si lega alla b-BSA. Dopo 5 minuti, lavare la camera con 80 μL di GTB.
    3. Passivare la superficie silanizzata del coverslip utilizzando 20 μL di poloxamer all'1%. Dopo 3 min, lavare con 80 μL di GTB.
    4. Attaccare le MT biotinilate (fase 3.1) al coperchio rivestito con b-BSA-avidina inserendo 20 μL di MT tipicamente diluite a 1:20 in GTB. Incubare i vetrini in posizione invertita, cioè con il coperchio rivolto verso il basso in una camera di umidità scura (ad esempio, una capsula di Petri contenente carta velina bagnata) per 5 minuti a temperatura ambiente. Quindi, lavare con 200 μL di GTB.
    5. Applicare 30 μL di miscela di reazione di motilità (vedere punto 1.3.2) nella camera di flusso.
    6. Diluire i motori Cin8-GFP (fase 2.13) in 20 μL di miscela di reazione di motilità (vedere Tabella 1) (tipicamente ad una concentrazione finale di 5-10 μM). Applicarli alla camera di flusso e visualizzare immediatamente il movimento dei motori lungo le MT.
  4. Imaging della motilità motoria
    NOTA: il legame MT e la motilità dei motori sono stati monitorati utilizzando un microscopio invertito a epifluorescenza dotato di una lampada ad arco di mercurio, un obiettivo ad apertura numerica 100x/1,4 e due set di filtri passa-banda a fluorescenza, uno con una lunghezza d'onda di 647 nm (per la rodamina) e un altro con una lunghezza d'onda di 488 nm (per GFP).
    1. Posizionare una goccia di olio per immersione sull'obiettivo del microscopio. Posizionare la camera di flusso sullo stadio del microscopio fluorescente con il coperchio rivolto verso il basso rivolto verso l'obiettivo.
    2. Attivare il canale della rodamina per mettere a fuoco le MT attaccate alla superficie del coverslip e acquisire l'immagine con un'esposizione di 20 ms utilizzando il software Micro-Manager ImageJ-Fiji21.
    3. Accendi il canale GFP e acquisisci 90 immagini time-lapse con intervallo di 1 s e esposizione di 800 ms, per analizzare la motilità Cin8-GFP.

figure-protocol-2
Figura 3: MT e MT bound Cin8-GFP. (A) Immagini da due campi (sinistro e destro) per MT polimerizzate seguendo il protocollo descritto nel passaggio 3.1 e immagini con obiettivo 100x come descritto nel passaggio 3.4. (B) Immagini da due campi (sinistra e destra) per il Cin8-GFP (pannelli inferiori, contrassegnati con frecce) attaccati alla MT mostrata nei pannelli superiori. Barra della scala: 4 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Analisi della motilità

NOTA: Eseguire tutte le analisi delle immagini e generare kymographs utilizzando il software ImageJ-Fiji.

  1. Generazione kymograph
    1. Apri il filmato time lapse e l'immagine del campo MT corrispondente. Sincronizzare queste due finestre scegliendo l'opzione seguente: Analizza > Strumenti > Sincronizza finestre.
    2. Evidenziare una MT utilizzando l'opzione Linea segmentata e utilizzare la scheda Analizza > Multi Kymograph per ottenere un kymograph.
  2. Determinazione della dimensione del cluster di Cin8-GFP (cioè il numero di molecole cin8 in un cluster)
    1. Eseguire la sottrazione dello sfondo e la correzione per l'illuminazione irregolare utilizzando l'opzione Elabora > Sottrai sfondo . Impostate il raggio della sfera mobile su 100 pixel e selezionate l'opzione Paraboloide scorrevole .
    2. Seguire l'intensità media di fluorescenza di uno specifico motore Cin8-GFP non mobile (Figura 3B) in funzione del tempo all'interno di un raggio di 4 pixel utilizzando il plug-in TrackMate del software ImageJ-Fiji scegliendo la seguente opzione: Plugin > Tracking > TrackMate > LoG Detector > Simple Lap Tracker.
    3. Ripetere il passaggio 4.2.2 per diversi motori Cin8-GFP. Traccia l'intensità di fluorescenza dei diversi motori Cin8-GFP in funzione del tempo.
      NOTA: Una strategia sperimentale per misurare la dimensione del cluster, cioè il numero di molecole Cin8 in un cluster, stabilisce una base per l'analisi della motilità correlata al clustering cin8. La fotosbiancamento della GFP collegata a Cin8 viene utilizzata per determinare il contributo delle singole molecole GFP all'intensità totale dei cluster Cin8. Ad esempio, le intensità di fluorescenza diminuiscono in passi di ~ 50 unità arbitrarie (a.u.), con ogni singolo passo che probabilmente rappresenta il fotosbiancamento di una molecola GFP (Figura 4A). Poiché Cin8 è una proteina motoria omo-tetramerica, contiene quattro molecole GFP. Pertanto, tutti i motori Cin8 con un'intensità ≤ 200 u.a. sono probabilmente singole molecole tetrameriche Cin8. Seguendo questo metodo, gli intervalli di intensità della fluorescenza del motore Cin8 vengono assegnati come <200, 200-400 e >400 per singole molecole Cin8, coppie di molecole Cin8 (dimero del tetramero Cin8) e oligomeri Cin8, rispettivamente12.
  3. Analisi della distribuzione dell'intensità per motori Cin8-GFP
    1. Misurare l'intensità media di fioritura di tutti i motori fluorescenti Cin8-GFP nel primo fotogramma della sequenza time-lapse utilizzando il plug-in TrackMate in ImageJ-Fiji come descritto nel passaggio 4.2.2.
    2. Traccia un istogramma delle intensità medie di Cin8-GFP con una dimensione del contenitore di 20 u.a. e adatta il picco maggiore dell'istogramma a una curva gaussiana (Figura 4B).
      NOTA: l'analisi della distribuzione dell'intensità integra la determinazione della dimensione del cluster per i motori Cin8-GFP degli esperimenti di fotosbiancamento. La curva gaussiana si adatta all'istogramma di distribuzione dell'intensità per i picchi di popolazione Cin8-GFP a ~ 125 a.u., che è coerente con l'intensità media di singole molecole tetrameriche Cin8 contenenti una, due, tre o quattro molecole GFP fluorescenti (non sbiancate), con ogni molecola GFP fluorescente che contribuisce ~ 50 a.u. Pertanto, utilizzando questo metodo di distribuzione dell'intensità, è possibile calcolare anche il contributo di una molecola GFP, che può essere ulteriormente utilizzato per assegnare la dimensione del cluster delle molecole Cin8-GFP.

figure-protocol-3
Figura 4: Profilo di sbiancamento Cin8-GFP e distribuzione dell'intensità. (A) Fotosbiancamento della GFP in quattro diversi motori Cin8-GFP. Singoli passaggi di fotosbiancamento, ciascuno dei quali probabilmente rappresenta il fotosbiancamento di una GFP, portano a un calo dell'intensità di fluorescenza di ~ 50 a.u. (B) La distribuzione dell'intensità dei motori Cin8-GFP nel primo fotogramma di una sequenza time-lapse (inserto). Il picco gaussiano (blu) centrato a ~125 a.u rappresenta singole molecole Cin8-GFP. Questo picco mostra l'intensità media dei singoli tetrameri Cin8 con una, due, tre o quattro molecole fluorescenti GFP, con ogni molecola GFP che contribuisce ~ 50 a.u. all'intensità totale (cioè (50 + 100 + 150 + 200) / 4 = 125). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Tracciamento della motilità delle molecole Cin8-GFP lungo le tracce MT
    1. Ritagliate la MT da analizzare nella sequenza time-lapse dei fotogrammi registrati evidenziandola con lo strumento Rettangolo e quindi scegliendo Immagine > Ritaglia.
    2. Scegli una particella fluorescente Cin8-GFP per l'analisi. Registrate le coordinate delle particelle in ogni fotogramma (punto temporale) della sequenza time lapse utilizzando le opzioni Strumento punto (Point Tool) e Misura (Measure). Eseguire una registrazione simile delle coordinate per altre particelle fluorescenti nella sequenza time-lapse.
    3. Assegnare la dimensione del cluster a tutte le particelle Cin8-GFP esaminate nel primo fotogramma del loro aspetto, come descritto nel passaggio 4.2.
  2. Analisi dello spostamento medio (MD) e dello spostamento quadrato medio (MSD)
    1. Dalle coordinate dei movimenti Cin8-GFP determinate nel passaggio 4.4, calcolare gli spostamenti di Cin8-GFP in ogni punto temporale rispetto alle coordinate iniziali, utilizzando l'equazione per il calcolo della distanza tra due punti con coordinate date:
      figure-protocol-4
      dove, dt è gli spostamenti di Cin8-GFP al momento t, xt e yt sono le rispettive coordinate al tempo t. x0 e y0 sono le rispettive coordinate di Cin8-GFP a t = 0.
    2. Calcola da questi valori di spostamento lo spostamento per tutti i possibili intervalli di tempo per una specifica particella Cin8-GFP. Ripetere la procedura per tutte le particelle Cin8-GFP esaminate.
    3. Tracciare lo spostamento medio (MD) di tutte le particelle Cin8-GFP esaminate rispetto all'intervallo di tempo e soggette a un adattamento lineare, MD = v x t + c. La pendenza di questo fit (v) rappresenta la velocità media delle particelle mobili Cin8-GFP.
      NOTA: In questo modo, la velocità media di tutte le molecole Cin8-GFP appartenenti a ciascuna dimensione di cluster può essere calcolata separatamente caratterizzando la motilità di diverse dimensioni di cluster. Oltre all'analisi MD, l'analisi dello spostamento quadrato medio (MSD) può essere eseguita anche quadrando i valori di spostamento calcolati nei passaggi 4.5.1 e 4.5.2. I valori MSD sono tracciati rispetto all'intervallo di tempo e adattati alla curva polinomiale MSD = v2 x t2 + 2D x t + c, dando il parametro aggiuntivo D, che è il coefficiente di diffusione del movimento Cin8-GFP. L'analisi MD deve essere eseguita su MT 8,10 marcati con polarità, mentre per l'analisi MSD non è necessaria la conoscenza della polarità MT.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

L'esperimento mira a studiare le caratteristiche di motilità della proteina motoria bidirezionale Cin8 di diverse dimensioni di cluster su singoli MT. La motilità rappresentativa di Cin8-GFP è evidente anche dai chimografi in Figura 5A, dove viene mostrata la posizione spaziale del motore nel tempo.

Per l'analisi delle proprietà mobili di Cin8-GFP, in primo luogo, la dimensione del cluster viene assegnata (passo 4.3) a ciascuna particella cin8-GFP mobile attaccata...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

In questo lavoro, viene presentato un protocollo per il saggio di motilità a singola molecola con la kinesin-5 bidirezionale Cin8 e l'analisi della motilità. Il Cin818 a lunghezza intera, incluso il segnale di localizzazione nucleare nativo (NLS) al C-terminale, è stato purificato dall'ospite nativo S. cerevisiae. Poiché il Cin8 è una proteina del motore nucleare, la macinazione delle cellule S. cerevisiae sotto azoto liquido è il metodo più efficiente per la lisi cellulare. Dopo...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata sostenuta in parte dalla sovvenzione della Israel Science Foundation (ISF-386/18) e dalla sovvenzione della Israel Binational Science Foundation (BSF-2019008), assegnata a L.G.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AdeninaFORMEDIUMDOC0230
ATPSigmaA7699
Biotinilato-BSA,SigmaA8549
CaseinaSigmaC7078
Catalasi (C40)SigmaC40
Creatina-chinasiSigmaC3755
Ditiotreitolo (DTT)SigmaD0632
EDTASigmaE5134
EGTASigmaE4378
Set di filtri a fluorescenza per GFPChroma49002: ET-EGFP (FITC/Cy2)
Set di filtri a fluorescenza per rodaminaChroma49004: ET-CY3/TRITC
Microscopio invertito a fluorescenzaZeissAxiovert 200M
GalattosioTivan BiotechGAL02
GlucosioSigmaG8270
Glucosio ossidasiSigmaG7141
GliceroloSigmaG5516
GlicilglicinaMerckG0674
GMPCPPJana BioscienceNu-405L
GTBCitoscheletroBST01-010
GTPSigmaG8877
IstidinaDuchefa BiochemieH0710.0100
ImageJ-FIJI softwarehttps://imagej.net/plugins/trackmate/versione 2.1.0/1.53c; Java 1.8.0_172 [64-bit] per Windows 10
ImidazoleSigmaI0125
InstantBlue Coomassie Protein Stain Abcamab119211
LenteZeiss100x / 1.4 olio Obiettivo
LisinaFORMEDIUMDOC0161
Cloruro di magnesioSigmaM8266
MetioninaDuchefa BiochemieM0715.0100
NeoAndor TechnologiessCMOS camera
NeutraAvidinLifeA2666
Ni-NTA AgaroseInvitrogenR901-15
Fosfo-CreatinaSigmaP1937
TubiSigmaP1851
Acido pluronico F-127 (poloxamer)SigmaP2443
Cloruro di potassioSigmaP9541
RaffinosioTivan BiotechRAF01
Strumento per cromatografia ad esclusione dimensionaleGE HealthcareAKTA Spettrofotometro puro
ThermoFisher ScientificNanoDrop
Superose-6 10/300 GLGE Healthcare17-5172-01
TrisRoshe10708976001
Triton X-100SigmaT8787
TriptofanoDuchefa BiochemieT0720.0100
Proteina della tubulinaCitoscheletroT240
Tubulina,citoscheletroT333P
Tubulina, TRITCCitoscheletroTL530M
UracilSigmaU0750-100G
Lievito base azotataFORMEDIUMCYN0401S
&alfa;-GFP anticorpoSanta Cruz BiotechnologySC8036
β-mercaptoetanoloSigmaM3148
, , , , , , , , DIC biotinilato di rodamina

Riferimenti

  1. Singh, S. K., Pandey, H., Al-Bassam, J., Gheber, L. Bidirectional motility of kinesin-5 motor proteins: structural determinants, cumulative functions and physiological roles. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (10), 1757-1771 (2018).
  2. Hoyt, M. A., He, L., Totis, L., Saunders, W. S. Loss of function of Saccharomyces cerevisiae kinesin-related CIN8 and KIP1 is suppressed by KAR3 motor domain mutations. Genetics. 135 (1), 35-44 (1993).
  3. Saunders, W. S., Hoyt, M. A. Kinesin-related proteins required for structural integrity of the mitotic spindle. Cell. 70 (3), 451-458 (1992).
  4. Hoyt, M. A., He, L., Loo, K. K., Saunders, W. S. Two Saccharomyces cerevisiae kinesin-related gene products required for mitotic spindle assembly. Journal of Cell Biology. 118 (1), 109-120 (1992).
  5. Gerson-Gurwitz, A., et al. Mid-anaphase arrest in S. cerevisiae cells eliminated for the function of Cin8 and dynein. Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (2), 301-313 (2009).
  6. Fridman, V., Gerson-Gurwitz, A., Movshovich, N., Kupiec, M., Gheber, L. Midzone organization restricts interpolar microtubule plus-end dynamics during spindle elongation. EMBO Reports. 10 (4), 387-393 (2009).
  7. Movshovich, N., et al. Slk19-dependent mid-anaphase pause in kinesin-5-mutated cells. Journal of Cell Science. 121 (15), 2529-2539 (2008).
  8. Gerson-Gurwitz, A., et al. Directionality of individual kinesin-5 Cin8 motors is modulated by loop 8, ionic strength and microtubule geometry. Embo Journal. 30 (24), 4942-4954 (2011).
  9. Roostalu, J., et al. Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling. Science. 332 (6025), 94-99 (2011).
  10. Shapira, O., Goldstein, A., Al-Bassam, J., Gheber, L. A potential physiological role for bi-directional motility and motor clustering of mitotic kinesin-5 Cin8 in yeast mitosis. Journal of Cell Science. 130 (4), 725-734 (2017).
  11. Goldstein-Levitin, A., Pandey, H., Allhuzaeel, K., Kass, I., Gheber, L. Intracellular functions and motile properties of bi-directional kinesin-5 Cin8 are regulated by neck linker docking. eLife. 10, 71036(2021).
  12. Pandey, H., et al. Drag-induced directionality switching of kinesin-5 Cin8 revealed by cluster-motility analysis. Science Advances. 7 (6), 1687(2021).
  13. Pandey, H., Popov, M., Goldstein-Levitin, A., Gheber, L. Mechanisms by which kinesin-5 motors perform their multiple intracellular functions. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6420(2021).
  14. Fridman, V., et al. Kinesin-5 Kip1 is a bi-directional motor that stabilizes microtubules and tracks their plus-ends in vivo. Journal of Cell Science. 126, 4147-4159 (2013).
  15. Edamatsu, M. Bidirectional motility of the fission yeast kinesin-5, Cut7. Biochemical and Biophysical Research Communications. 446 (1), 231-234 (2014).
  16. Popchock, A. R., et al. The mitotic kinesin-14 KlpA contains a context-dependent directionality switch. Nature Communications. 8, 13999(2017).
  17. Bodrug, T., et al. The kinesin-5 tail domain directly modulates the mechanochemical cycle of the motor domain for anti-parallel microtubule sliding. eLife. 9 (9), 51131(2020).
  18. Gheber, L., Kuo, S. C., Hoyt, M. A. Motile properties of the kinesin-related Cin8p spindle motor extracted from Saccharomyces cerevisiae cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (14), 9564-9572 (1999).
  19. Pandey, H., et al. Flexible microtubule anchoring modulates the bi-directional motility of the kinesin-5 Cin8. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 6051-6068 (2021).
  20. Shapira, O., Gheber, L. Motile properties of the bi-directional kinesin-5 Cin8 are affected by phosphorylation in its motor domain. Scientific Reports. 6, 25597(2016).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Britto, M., et al. Schizosaccharomyces pombe kinesin-5 switches direction using a steric blocking mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), 7483-7489 (2016).
  23. Kapitein, L. C., et al. Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5. Journal of Cell Biology. 182 (3), 421-428 (2008).
  24. Furuta, K., Edamatsu, M., Maeda, Y., Toyoshima, Y. Y. Diffusion and directed movement in vitro motile properties of fission yeast kinesin-14 Pkl1. Journal of Biological Chemistry. 283 (52), 36465-36473 (2008).
  25. Katrukha, E. A., et al. Probing cytoskeletal modulation of passive and active intracellular dynamics using nanobody-functionalized quantum dots. Nature Communications. 8, 14772(2017).
  26. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  27. Jakobs, M. A. H., Dimitracopoulos, A., Franze, K. KymoBulter, a deep learning software for automated kymograph analysis. eLife. 8, 42288(2019).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Errata corrige


Formal Correction: Erratum: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells
Posted by JoVE Editors on 6/09/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells. The Authors section was updated.

One of the author names was updated from:

Roy Abraham

to:

Roy Avraham

Tag

Motilit della chinesina 5Proteina motrice Cin8Motilit di singola molecolaClustering di proteine motorieDinamica dei microtubuliProteina motrice bidirezionaleCromatografia a esclusione dimensionaleMicroscopia a fluorescenzaSaccharomyces cerevisiaeMarcatura con GFP

Articoli correlati