Articolo metodologico

Valutazione del pregiudizio del giudizio del topo attraverso un'attività di scavo olfattivo

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DOI:

10.3791/63426

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4 marzo 2022

 ,  ,  , 
1Department of Integrative Biology, University of Guelph, 2Institute of Cell Biology and Neurosciences, National Scientific and Technical Research Council-University of Buenos Aires, 3Laboratory of Experimental Animals, Faculty of Veterinary Sciences, National University of La Plata, 4Department of Animal Biosciences, University of Guelph

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo articolo fornisce una descrizione dettagliata di un nuovo protocollo di bias di giudizio del topo. Vengono anche dimostrate le prove della sensibilità di questo compito di scavo olfattivo allo stato affettivo e viene discussa la sua utilità in diversi campi di ricerca.

Abstract

I bias di giudizio (JB) sono differenze nel modo in cui gli individui in stati affettivi / emotivi positivi e negativi interpretano informazioni ambigue. Questo fenomeno è stato a lungo osservato negli esseri umani, con gli individui in stati positivi che rispondono all'ambiguità "ottimisticamente" e quelli in stati negativi che mostrano invece "pessimismo". I ricercatori che mirano a valutare l'affetto animale hanno approfittato di queste risposte differenziali, sviluppando compiti per valutare il bias di giudizio come indicatore dello stato affettivo. Questi compiti stanno diventando sempre più popolari in diverse specie e campi di ricerca. Tuttavia, per i topi di laboratorio, i vertebrati più utilizzati nella ricerca e una specie su cui si fa molto affidamento per modellare i disturbi affettivi, solo un compito JB è stato convalidato con successo come sensibile ai cambiamenti nello stato affettivo. Qui, forniamo una descrizione dettagliata di questo nuovo compito murino JB e la prova della sua sensibilità all'influenza del topo. Sebbene i perfezionamenti siano ancora necessari, la valutazione del JB del topo apre la porta per rispondere sia a domande pratiche riguardanti il benessere del topo, sia a domande fondamentali sull'impatto dello stato affettivo nella ricerca traslazionale.

Introduzione

Misurare il bias di giudizio affettivamente modulato (d'ora in poi JB) si è dimostrato uno strumento utile per studiare gli stati emotivi degli animali. Questo approccio innovativo prende in prestito dalla psicologia umana poiché gli esseri umani che sperimentano stati affettivi positivi o negativi (emozioni e stati d'animo a lungo termine) dimostrano in modo affidabile le differenze nel modo in cui elaborano le informazioni 1,2,3. Ad esempio, gli esseri umani che soffrono di ansia o depressione potrebbero interpretare le espressioni facciali neutre come negative o frasi neutre come minacciose 4,5. È probabile che questi pregiudizi abbiano un valore adattativo e siano quindi conservati tra le specie 6,7. I ricercatori che mirano a valutare l'affetto animale hanno abilmente approfittato di questo fenomeno, operando l'ottimismo come l'aumento dell'aspettativa di ricompensa in risposta a segnali neutri o ambigui e il pessimismo come l'aumento dell'aspettativa di punizione o assenza di ricompensa 8,9. Pertanto, in un contesto sperimentale, le risposte ottimistiche e pessimistiche a stimoli ambigui possono essere interpretate come indicatori di affetto positivo e negativo, rispettivamente10,11.

Rispetto ad altri indicatori di influenza animale, i compiti JB hanno il potenziale per essere strumenti particolarmente preziosi poiché sono in grado di rilevare sia la valenza che l'intensità degli stati affettivi10,11. La capacità dei compiti JB di rilevare stati positivi (ad esempio, Rygula et al.12) è particolarmente utile poiché la maggior parte degli indicatori di influenza animale sono limitati al rilevamento di stati negativi13. Durante i compiti JB, gli animali sono tipicamente addestrati a rispondere a un segnale discriminante positivo che predice la ricompensa (ad esempio, il tono ad alta frequenza) e un segnale discriminatorio negativo che predice la punizione (ad esempio, il tono a bassa frequenza), prima di essere presentato con un segnale ambiguo (ad esempio, tono intermedio)8. Se in risposta a segnali ambigui un animale esegue "ottimisticamente" la risposta addestrata per il segnale positivo (come se si aspettasse una ricompensa), ciò indica un pregiudizio di giudizio positivo. In alternativa, se gli animali dimostrano la risposta negativa addestrata per evitare la punizione, ciò è indicativo di "pessimismo" o pregiudizio di giudizio negativo.

Dallo sviluppo del primo compito JB di successo per gli animali da parte di Harding e colleghi8, diversi compiti JB sono stati sviluppati per una vasta gamma di specie in diversi campi di ricerca7. Ma nonostante la loro crescente popolarità, i compiti JB animali sono spesso laboriosi. Inoltre, forse perché sono metodologicamente diversi dai compiti umani che li hanno ispirati, a volte producono risultati nulli o controintuitivi14 e comunemente producono solo piccole dimensioni dell'effetto del trattamento15. Di conseguenza, le attività JB possono essere difficili da sviluppare e implementare. Infatti, per i topi di laboratorio, i vertebrati più utilizzati nella ricerca16,17 e una specie su cui si è fatto molto affidamento per modellare i disturbi affettivi18, solo un compito JB è stato convalidato con successo come sensibile ai cambiamenti nello stato affettivo19 nonostante molti tentativi nell'ultimo decennio (vedi materiale supplementare di Resasco et al.19  per un riassunto). Questo articolo descrive il compito JB murino recentemente convalidato, dettagliando il suo design biologicamente rilevante ed evidenziando i modi in cui questo compito umano può essere applicato per testare ipotesi importanti rilevanti per l'effetto del topo. Nel complesso, il protocollo può essere implementato per studiare gli effetti affettivi di qualsiasi variabile di interesse su JB nei topi. Ciò includerebbe variabili di trattamento categoriali come descritto qui (effetti di farmaci o malattie, condizioni ambientali, background genetico, ecc.), O relazioni con variabili continue (cambiamenti fisiologici, comportamenti in gabbia domestica, ecc.).

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Protocollo

Gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato per la cura degli animali dell'Università di Guelph (AUP #3700), condotti in conformità con le linee guida del Canadian Council on Animal Care e segnalati in conformità con i requisiti ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments)20 .

1. Preparazione dell'esperimento

  1. Progettazione sperimentale (vedi Tabella 1).
    NOTA: questo test comportamentale è un'attività di scavo Go/Go basata sul profumo, in cui i topi devono scavare per ottenere ricompense di alto o basso valore. Utilizza un'arena rettangolare (Figura 1) con due braccia, in cui un braccio è profumato mentre l'altro è non profumato. Come descritto di seguito, i topi sono addestrati a discriminare tra segnali di odore positivi e negativi prima di essere presentati con una miscela di odori ambigui.
    1. Pseudocasualmente assegna le gabbie ai gruppi di stimolo discriminativo positivo alla menta o alla vaniglia (DS+) come segue.
      NOTA: Questo protocollo è stato convalidato solo per i topi assegnati alla miscela di odori di vaniglia DS + (vedere Risultati rappresentativi e Resasco et al.19 per i dettagli). Tuttavia, si raccomanda vivamente di testare i test pilota per confermare che le miscele DS+, DS e ambigue soddisfino i requisiti per una valutazione JB valida (fasi 4.7.3 e 5.3). Pertanto, i metodi qui delineati includono il test sia di una vaniglia che di una menta DS +, per fornire un esempio di un gruppo che soddisfa con successo i requisiti per la valutazione di JB (i topi DS + vaniglia) e un gruppo che non riesce a farlo (i topi DS + menta). I test pilota precedenti identificherebbero questo tipo di problema in anticipo.
    2. Mouse Mint DS+: per questi topi, durante la configurazione dell'arena per l'allenamento (vedi passaggio 1.4 di seguito), contrassegna i distributori di profumi e le pentole contenenti una ricompensa di alto valore con il segnale dell'odore di menta e quelli che non contengono alcuna ricompensa con il segnale dell'odore di vaniglia.
    3. Topi Vanilla DS+: per questi topi, durante la configurazione dell'arena per l'allenamento (vedere il passaggio 1.4 di seguito), contrassegnare i distributori di profumo e le pentole contenenti una ricompensa di alto valore con il segnale dell'odore di vaniglia e quelli che non contengono alcuna ricompensa con il segnale dell'odore di menta.
      NOTA: questo compito consiste in prove di addestramento rinforzate e prove di prova non rinforzate. Durante le prove di test non rinforzate, nessuna ricompensa è accessibile ai topi (vedere il passaggio 1.4.3 di seguito) e il segnale di odore ambiguo per i topi DS + di menta e vaniglia è la stessa miscela di menta / vaniglia 1: 1.
    4. Assegna pseudocasualmente le gabbie ai gruppi di braccia profumate sinistra o destra (controbilanciando i gruppi di odori DS +) come segue.
    5. A sinistra: per questi topi, durante la configurazione dell'arena per l'allenamento e il test (vedere il passaggio 1.4 di seguito), contrassegnare il braccio sinistro con l'apposito segnale di odore DS + o DS- e assicurarsi che il braccio destro sia sempre non profumato (contrassegnato solo con acqua distillata).
    6. A destra: per questi topi, durante la configurazione dell'arena per l'allenamento e il test (vedere il passaggio 1.4 di seguito), contrassegnare il braccio destro con l'appropriato segnale di odore DS + o DS- e assicurarsi che il braccio sinistro sia sempre non profumato (contrassegnato solo con acqua distillata).
    7. Assegna in modo casuale a ciascun animale un "codice cieco" come segue.
      NOTA: l'accecamento consente al ricercatore che gestisce i topi e valuta il loro comportamento di rimanere inconsapevole dell'ID o del trattamento dell'animale, evitando pregiudizi soggettivi indesiderati. Questo è un passaggio obbligatorio per conformarsi alle linee guida ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments) e ad altri documenti di riferimento20.
    8. Aggiungi una colonna per il codice cieco in un foglio di calcolo contenente ogni ID animale e il trattamento corrispondente a cui sono stati assegnati.
    9. Assegna in modo casuale a ciascun animale un codice univoco (ad esempio, una combinazione di lettere e numeri "A2") che non è correlato al numero di gabbia o al trattamento.
      NOTA: Tutta la randomizzazione deve essere condotta utilizzando un generatore di numeri casuali (ad esempio, Random.org). Durante questa fase di randomizzazione, controbilanciare il trattamento, lo sforzo, ecc., Ove applicabile. Fatelo fare da un assistente di ricerca che rimarrà "non cieco" al trattamento durante gli esperimenti. Questo individuo non deve raccogliere dati durante i test, per evitare valutazioni distorte.
    10. Durante tutta la raccolta dei dati, fornisci al ricercatore "cieco" che ha la latenza di punteggio live e video per scavare e scavare la durata solo con il codice cieco dell'animale per mantenere il ricercatore cieco al trattamento.
      NOTA: i fogli di calcolo utilizzati durante la raccolta dei dati includeranno solo il codice cieco dell'animale e la latenza corrispondente per scavare e scavare la durata per ogni prova. Alla fine degli esperimenti, l'ID animale corrispondente e le informazioni sul trattamento possono essere aggiunte al foglio di calcolo, "svelando" così i ricercatori per l'analisi dei dati.
  2. Preparazione del materiale.
    1. Ricompense alimentari di alto valore: rompere a mano le patatine di banana zuccherate essiccate in pezzi di circa 0,5 cm x 0,5 cm.
    2. Ricompense alimentari di basso valore: usando un tagliere e un coltello, taglia il chow dei roditori (dalla dieta regolare degli animali) in circa 0,125 cme 3 pezzi.
      NOTA: i test pilota per identificare i premi di alto e basso valore devono essere condotti prima di iniziare l'attività.
    3. Essenze di menta e vaniglia: utilizzando una siringa o una micropipetta da 1 mL, aggiungere l'estratto di menta e vaniglia in tubi di centrifuga etichettati. Diluire gli estratti 1:4 con acqua distillata e mescolare invertendo più volte. Prepararli quotidianamente e capovolgerli ripetutamente prima dell'uso per garantire che le miscele siano fresche e coerenti.
    4. Miscela di odori ambigui: dopo che le essenze di menta e vaniglia sono state diluite, aggiungere volumi uguali a un tubo di centrifuga (creando una miscela 1:1 delle essenze diluite). Esegui questi il giorno del test delle risposte alla miscela di odori ambigui e inverti ripetutamente prima dell'uso per garantire che la miscela sia fresca e coerente.
      NOTA: i test pilota per identificare diluizioni appropriate e miscele di odori intermedi sono fortemente incoraggiati per garantire l'utilità di sonde ambigue, poiché l'intensità può variare tra produttori, lotti, ecc. Se vengono offerti più segnali ambigui, assegnare casualmente i topi ai segnali di test quasi positivi, intermedi, quasi negativi. Vedi Discussione per ulteriori dettagli.
    5. Tamponi di cotone: tagliare ogni batuffolo di cotone circolare in sei pezzi uguali (consentendo loro di adattarsi alle cassette di tessuto utilizzate come distributori di profumo).
      NOTA: il numero di ricompense alimentari di alto e basso valore, tamponi di cotone e volumi di miscele di odori dipenderà dal numero di soggetti sottoposti a test. Si prega di fare riferimento alla Tabella 1 per il numero di prove per soggetto in ciascuna fase e alla Tabella 2 per i materiali richiesti in ciascun tipo di prova.
    6. Identificare l'area sperimentale: condurre corsi di formazione e test su un banco nella stanza della colonia o altrove. Condurre tutte le prove sotto luce rossa durante la fase buia quando i topi sono attivi.
  3. Pre-allenamento (1 settimana prima degli esperimenti) per scavare nella gabbia domestica.
    1. Per ogni gabbia da testare, versare una piccola quantità di lettiera di pannocchia di mais in due vasi da scavo (quanto basta per coprire il fondo della pentola) per aiutare i dolcetti a rimanere al centro della pentola quando vengono sepolti.
    2. In una pentola, posiziona pezzi di ricompensa di alto valore sopra lo strato di pannocchia di mais in modo che ogni topo nella gabbia possa avere un pezzo (ad esempio, tre pezzi di patatine di banana per una gabbia di tre topi). Nell'altra pentola, posiziona pezzi di ricompensa di basso valore sopra lo strato di pannocchia di mais in modo che ogni topo nella gabbia possa avere un pezzo (ad esempio, tre pezzi di chow per una gabbia di tre topi).
    3. Versare lentamente la biancheria da letto di pannocchia sopra le prelibatezze in ogni pentola, coprendole e riempiendo le pentole ad un'altezza di 3 cm.
    4. Posiziona contemporaneamente un vaso di alto valore e uno di basso valore in ogni gabbia per 10 minuti. Dopo 10 minuti, rimuovere i vasi da tutte le gabbie.
    5. Scartare qualsiasi pannocchia di mais e dolcetti rimanenti nella pentola. Pulire accuratamente tutte le pentole con etanolo al 70% per evitare che gli odori degli animali e delle gabbie influenzino le prove future.
    6. Ripetere i passaggi 1.3.1-1.3.5 una volta al giorno per 5 giorni consecutivi.
      NOTA: L'obiettivo di questa fase è quello di consentire a tutti i compagni di gabbia l'opportunità di scavare e mangiare un trattamento prima dell'inizio dell'allenamento formale. Questo facilita anche l'assuefazione alle ricompense alimentari.
  4. Arena allestita per allenamenti e test.
    1. Posiziona l'arena su un banco da lavoro sotto la luce rossa. Pulire accuratamente tutti i componenti dell'arena, i vasi di scavo e i distributori di profumi con etanolo al 70% per rimuovere la polvere e gli odori delle prove precedenti.
    2. Preparare i vasi da scavo come segue.
    3. Metti le ricompense alimentari appropriate nel "compartimento inaccessibile" (vedi Figura 1).
      NOTA: le ricompense incluse in questo compartimento dipendono da quali prelibatezze (se presenti) sono sepolte in una determinata prova (vedere Tabella 2). Pertanto, ogni pentola conterrà sempre un pezzo di chip di banana e un pezzo di chow attraverso i due scomparti.
      1. Vasi per odori DS+: durante le prove rinforzate, posizionare un pezzo di chow nel compartimento inaccessibile e seppellire un pezzo di chip di banana nell'area accessibile del vaso.
      2. DS- odor pots: durante le prove rinforzate, posizionare un pezzo di chow e un pezzo di banana chip nel compartimento inaccessibile. Nessun premio alimentare sarà disponibile nell'area accessibile del piatto.
      3. Vasi non profumati: durante le prove rinforzate, posizionare un pezzo di chip di banana nel compartimento inaccessibile e seppellire un pezzo di chow nell'area accessibile del vaso.
      4. Durante tutte le prove di prova non rinforzate (positive, negative e ambigue), posizionare un pezzo di chow e un pezzo di chip di banana nel compartimento inaccessibile. Nessun premio alimentare sarà disponibile nell'area accessibile del piatto.
        NOTA: Questo passaggio è quello di evitare che il profumo delle prelibatezze sepolte riveli quale vaso viene premiato. Come tale, la barriera tra i due scomparti è perforata per facilitare la trasmissione degli odori.
    4. Versare una piccola quantità di biancheria da letto di pannocchia di mais in ogni pentola per mantenere le ricompense alimentari centrate quando vengono sepolte. Metti un pezzo della ricompensa alimentare appropriata (vedi Tabella 2) sopra lo strato di pannocchia di mais e versa lentamente la biancheria da letto di pannocchia sopra le prelibatezze, coprendole e riempiendo le pentole fino a un'altezza di 3 cm.
    5. Utilizzando una siringa da 1 mL o una micropipetta, prelevare 0,1 mL della miscela di odori appropriata (cioè menta, vaniglia o miscele ambigue) o acqua distillata (vedere Tabella 2) e iniettarla direttamente sulla pannocchia di mais con un movimento circolare.
    6. Preparare dispenser di profumo.
      1. Posizionare un pezzo di batuffolo di cotone nella base della cassetta di tessuto. Utilizzando una siringa o una micropipetta da 1 mL, prelevare 0,1 mL della miscela di odori appropriata (ad esempio, menta, vaniglia o miscele ambigue) o acqua distillata (vedere Tabella 2) e iniettarla sul pezzo di cotone. Coprire la cassetta di tessuto con il coperchio per racchiudere il cotone profumato creando un distributore di profumo.
    7. Posiziona i vasi da scavo alle estremità delle braccia e i distributori di profumo all'inizio di ogni braccio. Inserire la "porta" rimovibile immediatamente prima degli slot della cassetta per bloccare l'ingresso ai bracci dell'arena e creare il compartimento di partenza (vedere la Figura 1).
      NOTA: pentole da scavo, distributori di profumi e siringhe devono essere chiaramente etichettati e utilizzati solo per un profumo durante gli esperimenti per evitare la miscelazione involontaria di segnali di odore (ad esempio, utilizzare un diverso set di materiali per menta, vaniglia, miscele non profumate e ambigue in tutto).

2. Allenamento di scavo: 5 giorni, due prove positive al giorno (Tabella 2)

  1. Topi veloci per 1 ora prima di allenarsi nella loro gabbia domestica rimuovendo il cibo dalla tramoggia.
  2. Prepara l'arena per una prova positiva rinforzata seguendo le istruzioni di configurazione dell'arena sopra (passaggio 1.4).
  3. Il giorno 1 dell'allenamento di scavo, posiziona le ricompense alimentari sopra la biancheria da letto di pannocchia di mais di 3 cm invece di seppellirle.
  4. Seppellire progressivamente le ricompense più in profondità sotto la pannocchia di mais nei successivi 4 giorni, fino a quando non si trovano nella parte inferiore della lettiera di 3 cm entro il giorno 5 (cioè, Giorno 1: sopra la pannocchia di mais, Giorno 2: sepolto da uno strato molto sottile di pannocchia di mais, Giorno 3: sepolto a metà strada verso il fondo del vaso, Giorno 4: sepolto tre quarti della strada verso il fondo della pentola, e giorno 5: sepolto sul fondo della pentola).
  5. Sposta i topi dalla loro gabbia di casa a una gabbia di trasporto vuota. Posiziona una scheda di spunto con il codice cieco dell'animale sopra la gabbia di trasporto in modo che il ricercatore che conduce esperimenti rimanga cieco all'ID e al trattamento degli animali. Porta i topi nell'area sperimentale.
    NOTA: i passaggi 2.1 e 2.5 devono essere completati da un assistente di ricerca che abbia familiarità con i topi. Le fasi successive durante le prove saranno condotte da un ricercatore cieco all'ID animale (e al trattamento, se applicabile). Maneggiare sempre i topi utilizzando la manipolazione della tazza (a mano aperta) o la gestione del tunnel (con un bicchiere di carta o un tunnel di plastica) per evitare gli effetti avversi della tradizionale manipolazione della coda21.
  6. Sposta i topi dalla gabbia di trasporto al compartimento di partenza dell'arena. Rimuovere la "porta" di avvio, abbassare immediatamente il coperchio in plexiglass sull'arena e avviare il timer di prova di 5 minuti.
    NOTA: se vengono testati più topi della stessa gabbia, questo dovrebbe essere fatto contemporaneamente. Tuttavia, il numero di animali sottoposti a test contemporaneamente dipenderà dal numero di osservatori ciechi disponibili; idealmente, un ricercatore osserverà e gestirà un animale alla volta, ma un individuo può osservare e gestire due animali contemporaneamente, se necessario.
  7. Latenza del punteggio in tempo reale per scavare e latenza per mangiare la ricompensa in entrambe le braccia.
    1. Registra la latenza da scavare come il momento in cui viene osservata la prima occorrenza di scavo. Lo scavo è descritto come un topo che spinge attivamente o manipola la lettiera di pannocchia con le zampe anteriori e / o il muso.
    2. Registra la latenza da mangiare come il momento in cui si osserva la prima occorrenza di mangiare. Mangiare è descritto come un topo che consuma una ricompensa mentre lo tiene nelle zampe anteriori e si siede sulle cosce.
  8. Al termine della prova, sollevare il coperchio in plexiglass e riportare il mouse nella sua gabbia di trasporto.
  9. Scartare tutte le lenzuola di pannocchia e le prelibatezze lasciate nei vasi. Aprire cassette di tessuto e scartare pezzi di cotone. Pulire tutti i componenti dell'arena e le pentole da scavo e profumare accuratamente i dispenser con il 70% di etanolo.
  10. Prepara l'arena per una seconda prova positiva (passaggio 1.4). Ripetere i passaggi 2.6-2.9 per uno studio positivo rinforzato.
  11. Restituire la gabbia di trasporto all'assistente di ricerca in modo che i topi possano essere ricollocati nella loro gabbia di casa.
  12. Ripetere i passaggi 2.1-2.11 per 5 giorni consecutivi.

3. Formazione sulla discriminazione: 10 giorni, quattro prove al giorno

  1. Impostare l'arena per una prova positiva o negativa (vedere Tabella 2) seguendo le istruzioni al punto 1.4.
  2. Condurre due studi positivi e due negativi al giorno seguendo l'ordine delineato nella Tabella 2 (cioè, alternando studi positivi e negativi nei giorni 1-5 e ordine pseudocasuale nei giorni 6-10).
  3. Seguire le istruzioni nel passaggio 2.1 all'inizio di ogni giornata di allenamento, quindi seguire i passaggi da 2.5 a 2.10. Ripetere fino a quando i topi hanno subito quattro prove in totale.
  4. Restituire la gabbia di trasporto all'assistente di ricerca in modo che i topi possano essere ricollocati nella loro gabbia di casa.
  5. Ripeti i passaggi 3.1-3.4 una volta al giorno per 10 giorni in totale (cioè due settimane lavorative consecutive di 5 giorni, separate da un fine settimana di 2 giorni).

4. Test

NOTA: la durata del test è di 3-5 giorni (a seconda del tempo impiegato da ciascun topo per soddisfare i criteri di apprendimento), cinque prove al giorno per le sessioni in cui vengono condotti studi positivi e negativi e tre prove al giorno quando viene condotto il test ambiguo.

  1. Topi veloci per 1 ora prima dell'allenamento / test nella loro gabbia di casa rimuovendo il cibo dalla tramoggia.
  2. Eseguire uno studio positivo e uno studio negativo in ordine randomizzato (vedere Tabella 1) seguendo le istruzioni di configurazione dell'arena nel passaggio 1.4 e le istruzioni di prova rinforzate nei passaggi 2.5-2.10.
  3. Eseguire una prova di prova non rinforzata videoregistrata.
    NOTA: le prove non rinforzate sono identiche alle prove rinforzate, ad eccezione del luogo in cui sono collocate le ricompense. Pertanto, nella prova non rinforzata, un pezzo di ogni ricompensa di alto e basso valore viene collocato nel compartimento inaccessibile sia per i vasi profumati che per quelli non profumati.
    1. Condurre uno studio di test positivo o negativo per ogni topo al giorno fino a quando i criteri di apprendimento non sono soddisfatti (massimo 4 giorni; i criteri di apprendimento sono descritti nel passaggio 4.7.3). Assicurarsi che le prove positive e negative siano condotte in ordine alternato tra giorni (ad esempio, Giorno 1: test positivo, Giorno 2: test negativo, Giorno 3: test positivo, ecc.).
    2. Seguire le istruzioni di configurazione dell'arena nel passaggio 1.4.
    3. Sposta i topi dalla gabbia di trasporto al compartimento di partenza dell'arena. Installa una videocamera su un treppiede in modo che entrambi i vasi alle estremità delle braccia siano in vista e inizia a registrare. Assicurarsi che la scheda di cue con il codice cieco dell'animale e il tipo di prova (test positivo o test negativo) sia registrato nel video (per riferimento durante il punteggio video).
    4. Rimuovere la "porta" di avvio, abbassare immediatamente il coperchio in plexiglass sopra l'arena e avviare il timer di prova di 2 minuti.
    5. Al termine della prova, interrompere la registrazione, spostare la telecamera di lato, sollevare il coperchio in plexiglass, riportare il mouse nella gabbia di trasporto.
    6. Scartare tutte le lenzuola di pannocchia e le prelibatezze lasciate nei vasi. Aprire cassette di tessuto e scartare pezzi di cotone. Pulire accuratamente tutti i componenti dell'arena, i vasi da scavo e i distributori di profumi con etanolo al 70%.
  4. Eseguire uno studio positivo e uno studio negativo in ordine randomizzato (vedere Tabella 1) seguendo le istruzioni di configurazione dell'arena nel passaggio 1.4 e le istruzioni di prova rinforzate nei passaggi 2.5-2.10.
  5. Restituire la gabbia di trasporto all'assistente di ricerca in modo che i topi possano essere ricollocati nella loro gabbia di casa.
  6. Una volta che tutti i mouse hanno completato le loro cinque prove giornaliere, trasferisci i video dalla scheda di memoria della fotocamera a un computer per il punteggio video.
  7. Segna video di prova positivi e negativi il giorno del test per valutare se i topi hanno soddisfatto i criteri di apprendimento. Assicurati il punteggio video dello stesso giorno poiché gli animali che soddisfano i criteri di apprendimento saranno sottoposti a test ambigui il giorno seguente.
    1. Utilizzando un software di registrazione degli eventi o un cronometro, chiedi al ricercatore che è cieco al trattamento di registrare la latenza di ciascun topo per scavare e scavare la durata in ogni pentola durante il primo minuto di prove positive e negative.
    2. Registra la latenza da scavare come il momento in cui viene osservata la prima occorrenza di scavo. Lo scavo è descritto come un topo che spinge attivamente o manipola la lettiera di pannocchia con le zampe anteriori e / o il muso. Registrare la durata dello scavo come il tempo totale che un mouse trascorre a scavare.
    3. Confronta la durata dello scavo nel braccio profumato tra studi positivi (DS +) e negativi (DS-) per ciascun topo per determinare se gli animali possono discriminare il compito. Considerare il criterio di apprendimento da soddisfare se la durata dello scavo nel braccio profumato DS+ è almeno il doppio di quella del braccio profumato DS durante il primo minuto di test (con una durata minima di scavo DS+ di 3 s).
  8. Ripeti i passaggi 4.1-4.7 al giorno fino a quando i topi non hanno soddisfatto il criterio di apprendimento.
    1. Escludere gli individui che non hanno soddisfatto il criterio entro il giorno 4 da processi ambigui (e quindi, valutazione del pregiudizio del giudizio).
  9. Per i topi che hanno soddisfatto i criteri di apprendimento, testare le risposte alla miscela di odori ambigui.
    1. Topi veloci per 1 ora prima dell'allenamento / test nella loro gabbia di casa rimuovendo il cibo dalla tramoggia.
    2. Eseguire uno studio rinforzato positivo e uno negativo in ordine randomizzato seguendo le istruzioni di configurazione dell'arena nei passaggi 1.4 e le istruzioni di prova rinforzate nei passaggi 2.5-2.10.
    3. Eseguire una prova videoregistrata non rinforzata come descritto nel passaggio 4.3 utilizzando la miscela di odori ambigui (vedere Tabella 2).
  10. Segna video di prova ambigui per valutare i pregiudizi del giudizio.
    1. Utilizzando un software di registrazione degli eventi o un cronometro, chiedi a un ricercatore cieco all'ID animale e al trattamento di registrare la latenza di ciascun topo per scavare (vedi passo 4.7.2) in ogni pentola durante i primi 1 minuto e 2 minuti di prove di prova.

5. Analisi dei dati

NOTA: le analisi esatte richieste dipenderanno dai dettagli del progetto sperimentale. Una panoramica generale è delineata qui, ma i ricercatori sono fortemente incoraggiati a fare riferimento a Gygax22 quando si pianificano analisi per esperimenti JB su animali e a Gaskill e Garner23 quando si seleziona la dimensione del campione (poiché le analisi richieste sono spesso troppo complesse per le analisi di potenza a priori ).

  1. "Unblind" il ricercatore aggiungendo l'ID animale corrispondente e le informazioni sul trattamento (ad esempio, alloggiamento arricchito o convenzionale; farmaco o placebo ecc.) per ogni codice cieco al foglio di calcolo. Assicurati che il foglio di calcolo risultante includa tre righe per ogni animale che ha soddisfatto i criteri di apprendimento (ad esempio, per gli studi di test positivi, negativi e ambigui) che indicano latenze da scavare nel braccio profumato.
  2. Eseguire un modello misto lineare generalizzato a misure ripetute, utilizzando il software statistico preferito. Qui, la variabile di risultato sarà la latenza da scavare. Assicurarsi che il modello includa il trattamento (o la variabile continua di interesse), il tipo di prova e l'interazione trattamento x tipo di prova come effetti fissi. Includi l'ID del mouse (nidificato all'interno del trattamento) come effetto casuale. I termini aggiuntivi inclusi nel modello dipenderanno dal progetto sperimentale applicato.
    NOTA: se i topi sono alloggiati in gruppo (come è appropriato per questa specie sociale24) e i compagni di gabbia vengono testati, allora la gabbia nidificata durante il trattamento (se presente) deve essere inclusa nel modello come effetto casuale (e l'ID del topo deve essere successivamente nidificato all'interno della gabbia).
  3. Tracciare i mezzi di latenza al minimo quadrato in ciascun tipo di prova per confermare che il segnale ambiguo presentato è stato interpretato come intermedio (ad esempio, la latenza al minimo quadrato significa che la stima per lo studio ambiguo dovrebbe cadere a un punto intermedio tra le latenze positive e negative). Valutare JB del mouse solo se questo requisito è soddisfatto.
  4. Valutare il semplice effetto del trattamento (o la variabile continua di interesse) sulla latenza per scavare nello studio ambiguo studiando l'interazione Trattamento x Tipo di prova per determinare se i topi mostrano JB modulato dall'effetto.

figure-protocol-1
Figura 1: Schema dell'apparato sperimentale. L'apparato JB comprende un'arena rettangolare con due bracci. Ogni braccio contiene un distributore di profumo situato all'inizio e una pentola di scavo posta alla fine. Ristampato da Resasco et al.19 con il permesso di Elsevier. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Fase:Progettazione Sperimentale
TuttoRicompensa di alto valoreChip di banana
Ricompensa di basso valoreChow di roditore
DS+Menta o Vaniglia (controbilanciato)
DS-Menta o Vaniglia (controbilanciato)
Formazione di scavoProgramma di allenamento di scavo5 giorni: 2 prove Pos/giorno
Durata della prova di scavo5 minuti
Formazione sulla discriminazioneProgramma di formazione sulla discriminazione10 giorni: 4 prove al giorno
Ordine di prova di scavoGiorni 1-5: 4 prove al giorno
Prova 1: Pos
Prova 2: Neg
Prova 3: Pos
Prova 4: Neg
Giorni 6-10: 4 prove al giorno*
Durata del processo sulla discriminazione5 minuti
CollaudoProgramma di test3-5 giorni (a seconda del tempo per soddisfare i criteri di apprendimento)
5 prove/giorno
Ordine della fase di testProve 1 e 2: Pos o Neg**
Prova 3: prova di prova
Prove 4 e 5: Pos o Neg**
Durata della prova del test2 minuti
* Le prove sono state pseudocasualizzate, quindi i topi hanno sempre avuto due Prove Pos e due Neg al giorno
** Le prove sono state pseudocasualizzate, quindi i topi hanno sempre avuto un Pos e uno studio Neg prima e dopo il test trial

Tabella 1: Riepilogo della progettazione sperimentale e programma per la formazione e le prove. Numero e ordine di prove al giorno per le fasi di addestramento allo scavo, formazione sulla discriminazione e test, oltre ai dettagli di progettazione sperimentale. Ristampato da Resasco et al.19 con il permesso di Elsevier.

Dettagli della versione di prova
FaseTipo di provaBraccio profumatoBraccio non profumato
Odore CueRicompensa sepoltaRicompensa inaccessibileOdore CueRicompensa sepoltaRicompensa inaccessibile
Formazione su scavi e discriminazioniFormazione PosDS+BananaPappaAcquaPappaBanana
Formazione NegDS-Nessuna ricompensaBanana + chowAcquaPappaBanana
CollaudoPos TestDS+Nessuna ricompensaBanana + chowAcquaNessuna ricompensaBanana + chow
Neg TestDS-Nessuna ricompensaBanana + chowAcquaNessuna ricompensaBanana + chow
Test ambiguoMenta/
miscela di vaniglia		Nessuna ricompensaBanana + chowAcquaNessuna ricompensaBanana + chow
Criterio di apprendimentoI topi devono scavare il doppio del tempo nel vaso DS + (test Pos) rispetto al DS-pot (test Neg) e scavare per un minimo di 3 s

Tabella 2. Riepilogo dei dettagli della prova. Segnali di odore e ricompense presentati in ogni tipo di prova durante le fasi di addestramento allo scavo, formazione sulla discriminazione e test. DS(+): stimolo discriminatorio positivo, DS(-): stimolo discriminatorio negativo, Pos: positivo, Neg: negativo. Ristampato da Resasco et al.19 con il permesso di Elsevier. Vedere la tabella supplementare S2 nell'articolo originale per la tabella espansa.

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Risultati

I risultati qui presentati riflettono i risultati rilevanti dell'esperimento 1 di Resasco et al.19. I soggetti in questo esperimento erano 18 femmine C57BL/6NCrl ('C57') e 18 topi Balb/cAnNCrl ('Balb'). Gli animali sono arrivati alla struttura a 3-4 settimane di età e sono stati assegnati in modo casuale a trattamenti abitativi arricchiti per l'ambiente o convenzionali (EH o CH, rispettivamente) in quartetti di ceppi misti25. Ogni gabbia conteneva un C57 e un Balb, oltre a ...

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Discussione

Il protocollo di scavo basato sul profumo e i risultati qui delineati dimostrano la capacità di questo nuovo compito JB di rilevare i cambiamenti nello stato affettivo del topo. Il compito rappresenta quindi uno strumento prezioso per diversi campi di ricerca. Analogamente a qualsiasi compito JB, per valutare l'influenza animale è fondamentale che gli animali imparino prima a discriminare tra i segnali (passo 4.7.3) e che lo stimolo ambiguo sia interpretato come intermedio (passo 5.3). Sebbene semplice, soddisfare questi...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Ringraziamenti

Gli autori sono grati a Miguel Ayala, Lindsey Kitchenham, Dr. Michelle Edwards, Sylvia Lam e Stephanie Dejardin per i loro contributi al lavoro di convalida Reseasco et al.19 su cui si basa questo protocollo. Vorremmo anche ringraziare i topi e i nostri meravigliosi tecnici di cura degli animali, Michaela Randall e Michelle Cieplak.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Etanolo assolutoAlcool commercialeP016EAANDiluire al 70% con acqua distillata, per la pulizia
Provette da centrifugaFischer55395Provette da 15 ml utilizzate per diluire le essenze qui. Tuttavia, la dimensione può essere selezionata in base al volume totale richiesto per la dimensione del campione
Cheerios (originale)CheeriosN/ADisponibile in commercio. Utilizzato come ricompensa per addestrare gli animali a entrare nella gabbia annessa per la manipolazione
Lettiera di pannocchia di maisEnvigo7092Teklad 1/8 lettiera di pannocchia di mais utilizzata per scavare pentole e gabbie per animali
Dischetti di cotoneEquiparaN/ADisponibile in commercio. Modificato in laboratorio per adattarsi alle cassette dei tessuti per l'erogazione di profumo
Vasi da scavoRubbermaidN/ADisponibile in commercio. I contenitori sono stati modificati per adattarsi all'apparato in laboratorio
Patatine di banana essiccate e zuccherateStock e barileN/ADisponibile in commercio. Ricompensa di alto valore nel compito JB Apparecchio
JB N/AL'apparecchio è stato realizzato in laboratorio Software di
registrazione degli eventi JWatcherAnimal Behavior Laboratory, Macquarie UniversityVersione 1.0Disponibile gratuitamente per il download online. Utilizzato per segnare il comportamento di scavo durante l'attività JB
Estratto di mentaFleiborN/Acommercialmente "Menta (Solució n)". Stimolo discriminante odore
Roditore DietaEnvigo2914Teklad globale 14% proteine roditori diete di mantenimento. Ricompensa di basso valore nel compito JB e dieta regolare nella gabbia domestica
Software statistico SASSASVersione 9.4programmi software comparabili (ad es. R) sono anche appropriati
Estratto di vanigliaFleiborDisponibile in commercio "Vainilla (Solució n)". Odore di stimolo discriminante
VideocameraSonyDCR-SX22Sony handycam.
Altri

Riferimenti

  1. Mathews, A., MacLeod, C. Cognitive vulnerability to emotional disorders. Annual Review of Clinical Psychology. 1, 167-195 (2005).
  2. Mathews, A., MacLeod, C. Cognitive approaches to emotions. Anual Review of Psychology. 45 (1), 25-50 (1994).
  3. Blanchette, I., Richards, A. The influence of affect on higher level cognition: A review of research on interpretation, judgement, decision making and reasoning. Cognition and Emotion. 24 (4), 561-595 (2010).
  4. MacLeod, C., Cohen, I. L. Anxiety and the interpretation of ambiguity: A text comprehension study. Journal of Abnormal Psychology. 102 (2), 238-247 (1993).
  5. Everaert, J., Podina, I. R., Koster, E. H. W. A comprehensive meta-analysis of interpretation biases in depression. Clinical Psychology Review. 58, 33-48 (2017).
  6. Haselton, M. G., Nettle, D. The paranoid optimist: An integrative evolutionary model of cognitive biases. Personality and Social Psychology Review. 10 (1), 47-66 (2006).
  7. Mendl, M., Paul, E. Getting to the heart of animal welfare. The study of animal emotion. Stichting Animales. , Netherlands. (2017).
  8. Harding, E. J., Paul, E. S., Mendl, M. Cognitive bias and affective state. Nature. 427 (6972), 312(2004).
  9. Douglas, C., Bateson, M., Walsh, C., Bédué, A., Edwards, S. A. Environmental enrichment induces optimistic cognitive biases in pigs. Applied Animal Behaviour Science. 139 (1-2), 65-73 (2012).
  10. Paul, E. S., Harding, E. J., Mendl, M. Measuring emotional processes in animals: The utility of a cognitive approach. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 29 (3), 469-491 (2005).
  11. Mendl, M., Burman, O. H. P., Parker, R. M. A., Paul, E. S. Cognitive bias as an indicator of animal emotion and welfare: Emerging evidence and underlying mechanisms. Applied Animal Behaviour Science. 118 (3-4), 161-181 (2009).
  12. Rygula, R., Pluta, H., Popik, P. Laughing rats are optimistic. PLoS ONE. 7 (12), 51959(2012).
  13. Boissy, A., et al. Assessment of positive emotions in animals to improve their welfare. Physiology and Behavior. 92 (3), 375-397 (2007).
  14. Ross, M., Garland, A., Harlander-Matauschek, A., Kitchenham, L., Mason, G. Welfare-improving enrichments greatly reduce hens' startle responses, despite little change in judgment bias. Scientific Reports. 9 (1), 1-14 (2019).
  15. Lagisz, M., et al. Optimism, pessimism and judgement bias in animals: A systematic review and meta-analysis. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 118, 3-17 (2020).
  16. Canadian Council on Animal Care CCAC Animal Data Report 2019. , Available from: https://ccac.ca/Documents/AUD/2019-Animal-Data-Report.pdf (2019).
  17. Report From the Commission to the European Parlaiment and the Council. European Commission. , Available from: https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/TXT/HTML/?uri=CELEX:52020DC0016&from=EN (2020).
  18. Cryan, J. F., Holmes, A. Model organisms: The ascent of mouse: Advances in modelling human depression and anxiety. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (9), 775-790 (2005).
  19. Resasco, A., et al. Cancer blues? A promising judgment bias task indicates pessimism in nude mice with tumors. Physiology and Behavior. 238, 113465(2021).
  20. Percie du Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 40 (9), 1769-1777 (2020).
  21. Gouveia, K., Hurst, J. L. Optimising reliability of mouse performance in behavioural testing: The major role of non-aversive handling. Scientific Reports. 7, 44999(2017).
  22. Gygax, L. The A to Z of statistics for testing cognitive judgement bias. Animal Behaviour. 95, 59-69 (2014).
  23. Gaskill, B. N., Garner, J. P. Power to the people: Power, negative results and sample size. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 59 (1), 9-16 (2020).
  24. MacLellan, A., Adcock, A., Mason, G. Behavioral biology of mice. Behavioral Biology of Lab Animals. , 89-111 (2021).
  25. Walker, M., et al. Mixed-strain housing for female C57BL/6, DBA/2, and BALB/c mice: Validating a split-plot design that promotes refinement and reduction. BMC Medical Research Methodology. 16 (11), (2016).
  26. Weber, E. M., Dallaire, J. A., Gaskill, B. N., Pritchett-Corning, K. R., Garner, J. P. Aggression in group-housed laboratory mice: Why can't we solve the problem. Lab Animal. 46 (4), 157-161 (2017).
  27. Nip, E., et al. Why are enriched mice nice Investigating how environmental enrichment reduces agonism in female C57BL / 6, DBA / 2, and BALB / c mice. Applied Animal Behaviour Science. 217, 73-82 (2019).
  28. Tilly, S. C., Dallaire, J., Mason, G. J. Middle-aged mice with enrichment-resistant stereotypic behaviour show reduced motivation for enrichment. Animal Behaviour. 80 (3), 363-373 (2010).
  29. Fureix, C., et al. Stereotypic behaviour in standard non-enriched cages is an alternative to depression-like responses in C57BL/6 mice. Behavioural Brain Research. 305, 186-190 (2016).
  30. Nip, E. The long-term effects of environmental enrichment on agonism in female C57BL/6, BALB/c, and DBA/2 mice. Thesis Dissertation. , University of Guelph. (2018).
  31. Wei, J., Carroll, R. J., Harden, K. K., Wu, G. Comparisons of treatment means when factors do not interact in two-factorial studies. Amino Acids. 42 (5), 2031-2035 (2012).
  32. Ruxton, G. D., Neuhäuser, M. When should we use one-tailed hypothesis testing. Methods in Ecology and Evolution. 1 (2), 114-117 (2010).
  33. Young, J. W., et al. The odour span task: A novel paradigm for assessing working memory in mice. Neuropharmacology. 52 (2), 634-645 (2007).
  34. Latham, N., Mason, G. From house mouse to mouse house: The behavioural biology of free-living Mus musculus and its implications in the laboratory. Applied Animal Behaviour Science. 86 (3-4), 261-289 (2004).
  35. Jones, S., et al. Assessing animal affect: an automated and self-initiated judgement bias task based on natural investigative behaviour. Scientific Reports. 8 (1), 12400(2018).
  36. Novak, J., et al. Effects of stereotypic behaviour and chronic mild stress on judgement bias in laboratory mice. Applied Animal Behaviour Science. 174, 162-172 (2016).
  37. Krakenberg, V., von Kortzfleisch, V. T., Kaiser, S., Sachser, N., Richter, S. H. Differential effects of serotonin transporter genotype on anxiety-like behavior and cognitive judgment bias in mice. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13, 263(2019).
  38. Krakenberg, V., et al. Technology or ecology? New tools to assess cognitive judgement bias in mice. Behavioural Brain Research. 362, 279-287 (2019).
  39. Krakenberg, V., et al. Effects of different social experiences on emotional state in mice. Scientific Reports. 10, 15255(2020).
  40. Bračić, M., Bohn, L., Krakenberg, V., Schielzeth, H., Kaiser, S. Once an optimist, always an optimist? Studying cognitive judgment bias in mice. EcoEvoRxiv. , (2021).
  41. Jones, S., Paul, E. S., Dayan, P., Robinson, E. S. J., Mendl, M. Pavlovian influences on learning differ between rats and mice in a counter-balanced Go/NoGo judgement bias task. Behavioural Brain Research. 331, 214-224 (2017).
  42. Roelofs, S., Boleij, H., Nordquist, R. E., vander Staay, F. J. Making decisions under ambiguity: Judgment bias tasks for assessing emotional state in animals. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 10 (119), 1-16 (2016).
  43. Sherwin, C. M., Haug, E., Terkelsen, N., Vadgama, M. Studies on the motivation for burrowing by laboratory mice. Applied Animal Behaviour Science. 88 (3-4), 343-358 (2004).
  44. Deacon, R. M. J. Burrowing: A sensitive behavioural assay, tested in five species of laboratory rodents. Behavioural Brain Research. 200 (1), 128-133 (2009).
  45. MacDougall-Shackleton, S. A., Bonier, F., Romero, L. M., Moore, I. T. Glucocorticoids and "stress" are not synonymous. Integrative Organismal Biology. 1 (1), 1-8 (2019).

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