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Articolo metodologico

Förster Resonance Energy Transfer Mapping: una nuova metodologia per chiarire le caratteristiche strutturali globali

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⸱

DOI:

10.3791/63433

⸱

16 marzo 2022

 ,  , 
1Molecular Biology and Biochemistry Department, Wesleyan University, 2Molecular Biophysics Program, Wesleyan University

In questo articolo

Sommario

Lo studio descrive in dettaglio la metodologia della mappatura FRET, compresa la selezione dei siti di etichettatura, la scelta dei coloranti, l'acquisizione e l'analisi dei dati. Questa metodologia è efficace nel determinare i siti di legame, i cambiamenti conformazionali e i movimenti dinamici nei sistemi proteici ed è più utile se eseguita in combinazione con le informazioni strutturali 3D esistenti.

Abstract

Il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) è un metodo consolidato basato sulla fluorescenza utilizzato per misurare con successo le distanze all'interno e tra le biomolecole in vitro e all'interno delle cellule. In FRET, l'efficienza del trasferimento di energia, misurata dalle variazioni dell'intensità di fluorescenza o della durata, si riferisce alla distanza tra due molecole o etichette fluorescenti. Determinazione della dinamica e cambiamenti conformazionali dalle distanze sono solo alcuni esempi di applicazioni di questo metodo ai sistemi biologici. In determinate condizioni, questa metodologia può aggiungere e migliorare le strutture cristalline a raggi X esistenti fornendo informazioni riguardanti la dinamica, la flessibilità e l'adattamento alle superfici di legame. Descriviamo l'uso di FRET e le determinazioni della distanza associate per chiarire le proprietà strutturali, attraverso l'identificazione di un sito di legame o gli orientamenti delle subunità dimeri. Attraverso una scelta giudiziosa dei siti di etichettatura e spesso l'impiego di più strategie di etichettatura, abbiamo applicato con successo questi metodi di mappatura per determinare le proprietà strutturali globali in un complesso proteina-DNA e il sistema di traslocazione proteica SecA-SecYEG. Nel sistema SecA-SecYEG, abbiamo utilizzato metodi di mappatura FRET per identificare il sito di legame preproteico e determinare la conformazione locale della regione della sequenza del segnale legato. Questo studio delinea i passaggi per l'esecuzione di studi di mappatura FRET, tra cui l'identificazione di siti di etichettatura appropriati, la discussione di possibili etichette tra cui residui di amminoacidi non nativi, procedure di etichettatura, come eseguire misurazioni e interpretare i dati.

Introduzione

Per le proteine, la delucidazione della dinamica insieme alla conoscenza strutturale tridimensionale (3-D) porta a una migliore comprensione delle relazioni struttura-funzione dei sistemi biomolecolari. I metodi strutturali, come la cristallografia a raggi X e la microscopia elettronica criogenica, catturano una struttura statica e spesso richiedono la determinazione di più strutture per chiarire gli aspetti del legame e della dinamica delle biomolecole1. In questo articolo viene descritto un metodo basato su soluzione per la mappatura di elementi strutturali globali, ad esempio siti di associazione o interazioni di associazione, potenzialmente più transitori e meno facilmente acquisibili con metodi statici. I sistemi candidati forti per questa metodologia sono quelli in cui una struttura 3D è stata precedentemente determinata mediante cristallografia a raggi X, spettroscopia NMR o altri metodi strutturali. In questo caso, sfruttiamo la struttura cristallina a raggi X del complesso SecA-SecYEG, un attore centrale nella via secretoria generale della proteina, per mappare la posizione di un sito di legame peptidico del segnale utilizzando il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) prima del trasporto della preproteina attraverso la membrana2. La manipolazione del sistema biologico attraverso modificazioni genetiche unita alla nostra conoscenza della struttura 3D ha permesso la determinazione della conformazione della sequenza del segnale e della regione precoce matura immediatamente prima dell'inserimento nel canale 3.

FRET comporta il trasferimento di energia senza radiazioni da una molecola (donatore) a un'altra (accettore) in modo dipendente dalla distanza che è attraverso lo spazio 4,5. L'efficienza di questo trasferimento viene monitorata attraverso una diminuzione del donatore o un aumento dell'intensità di fluorescenza dell'accettore. L'efficienza del trasferimento di energia può essere descritta come

E = R06/(R06 + R6)

in cui il valore R0 è la distanza alla quale il trasferimento è efficiente al 50%6. La tecnica è stata precedentemente descritta come un righello molecolare ed è efficace nel determinare distanze nell'intervallo 2,5-12 nm, a seconda dell'identità dei coloranti donatore-accettore 4,7,8,9. Le intensità di fluorescenza del donatore e la durata di vita con o senza accettore consentono di determinare le efficienze di trasferimento e, di conseguenza, le distanze 5,8. A causa della disponibilità della tecnologia, della sensibilità del metodo e della facilità d'uso, FRET ha anche trovato ampia applicazione in settori come la spettroscopia di fluorescenza a singola molecola e la microscopia confocale6. L'avvento di proteine fluorescenti come la proteina fluorescente verde ha reso l'osservazione della dinamica intracellulare e l'imaging delle cellule vive relativamente facile10,11. Molte applicazioni FRET come queste sono discusse in dettaglio in questo numero virtuale.

In questo studio, ci concentriamo in particolare sull'uso delle misurazioni FRET per produrre valori di distanza per determinare i dettagli strutturali. In precedenza, le misurazioni FRET sono state efficacemente utilizzate per determinare la conformazione delle molecole di DNA quando legate alla proteina 12,13,14, la dinamica interna delle proteine e le interazioni di legame proteico 15,16,17. I vantaggi di questo metodo risiedono nella capacità di determinare elementi strutturali flessibili e dinamici in una soluzione con quantità relativamente basse di materiale. Significativamente, questo metodo è particolarmente efficace se utilizzato in combinazione con le informazioni strutturali esistenti e non può essere utilizzato come mezzo di determinazione della struttura 3D. Il metodo fornisce la migliore comprensione e perfezionamento della struttura se il lavoro si basa su informazioni strutturali esistenti spesso accoppiate con la simulazione computazionale18,19. Qui, l'uso di distanze ottenute da misure FRET allo stato stazionario e risolte nel tempo è descritto per mappare un sito di legame, la cui posizione non era nota, su una struttura cristallografica esistente del complesso SecA-SecYEG, le principali proteine nella via secretoria generale3.

La via secretoria generale, un sistema altamente conservato dai procarioti agli eucarioti agli archaea, media il trasporto delle proteine attraverso o nella membrana fino alla loro posizione funzionale nella cellula. Per i batteri Gram-negativi, come E. coli, l'organismo utilizzato nel nostro studio, le proteine vengono inserite o traslocate attraverso la membrana interna al periplasma. Il complesso di canali SecY batterici (chiamato translocon) si coordina con altre proteine per traslocare la proteina appena sintetizzata, che viene diretta alla sua posizione corretta nella cellula attraverso una sequenza di segnali tipicamente situata al N-terminus20,21. Per le proteine legate al periplasma, la proteina ATPasi SecA si associa al tunnel di uscita del ribosoma e alla preproteina dopo che circa 100 residui sono stati tradotti22. Insieme alla proteina chaperone SecB, mantiene la preproteina in uno stato spiegato. SecA si lega al translocon SecYEG e, attraverso molti cicli di idrolisi dell'ATP, facilita il trasporto delle proteine attraverso la membrana23,24.

SecA è una proteina multi-dominio che esiste in forme citosoliche e legate alla membrana. Una proteina omodimerica nel citosol, SecA è costituita da un dominio di legame preproteico o cross-linking25, due domini leganti nucleotidi, un dominio alare elicoidale, un dominio elicoidale scaffold e il dito a due eliche (THF) 26,27,28,29 (Figura 1). In precedenti studi cristallografici del complesso SecA-SecYEG, la posizione del THF suggeriva che fosse attivamente coinvolto nella traslocazione delle proteine e nei successivi esperimenti di cross-linking con il peptide segnale ha ulteriormente stabilito il significato di questa regione nella traslocazione proteica30,31. Studi precedenti, utilizzando la metodologia di mappatura FRET, hanno dimostrato che i peptidi di segnale esogeni si legano a questa regione di SecA 2,32. Per comprendere appieno la conformazione e la posizione della sequenza del segnale e della regione precoce matura della preproteina prima dell'inserimento nel canale SecYEG, è stata creata una chimera proteica in cui la sequenza del segnale e i residui della regione della prima maturità sono stati attaccati alla SecA attraverso un linker Ser-Gly (Figura 1). Usando questo costrutto biologicamente vitale, è stato ulteriormente dimostrato che la sequenza del segnale e la regione precoce matura della preproteina si legano al THF in modo parallelo2. Successivamente, la metodologia di mappatura FRET è stata utilizzata per chiarire la conformazione e la posizione della sequenza del segnale e della regione di maturazione precoce in presenza di SecYEG come descritto di seguito3.

La conoscenza della struttura 3D del complesso SecA-SecYEG 33,34,35 e la possibile posizione del sito di legame ci hanno permesso di posizionare giudiziosamente le etichette donatore-accettore in luoghi in cui l'intersezione delle singole distanze FRET identifica la posizione del sito di legame. Queste misurazioni della mappatura FRET hanno rivelato che la sequenza del segnale e la regione precoce matura della preproteina formano una forcina con la punta situata alla bocca del canale SecYEG, dimostrando che la struttura della forcina è modellata prima dell'inserimento del canale.

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Protocollo

1. Selezione dei siti di etichettatura

  1. Identificare almeno tre potenziali siti di etichettatura per triangolare il presunto sito di legame sulle strutture proteiche esistenti. In questo caso, SecA, SecYEG e preproteina attaccate alla SecA attraverso la fusione genetica sono state identificate2.
    1. Scegliere i siti di etichettatura entro 25-75 Å dal sito di legame putativo e nelle regioni relativamente statiche della proteina, la distanza determinerà la coppia di coloranti FRET specifica da utilizzare36. Individuare i siti di etichettatura in regioni proteiche che sono relativamente distinte l'una dall'altra, in modo che i siti descrivano i vertici di un triangolo con il sito di legame putativo situato al centro (Figura 1A-D).
    2. Introdurre o identificare residui di cisteina (Cys) nei siti di etichettatura di interesse in una proteina che non ha altri residui di Cys, per migliorare l'efficienza di etichettatura del sito specifico37,38.
    3. Introdurre aminoacidi innaturali, ad esempio p-azidofenilalanina per l'etichettatura con chimica click, al fine di etichettare efficacemente una proteina in due posizioni distinte con coloranti diversi39,40.
    4. Testare i mutanti Cys per la perdita di funzione. Verificare l'attività del mutante senza Cys e del mutante inalterante dell'amminoacido utilizzando un test di attività appropriato. In questo caso, l'attività è stata verificata con un test di crescita seguito da un saggio in vitro di ATPasi verde malachite 32,41,42

2. Etichettatura della proteina

  1. Purificare la proteina o le proteine di interesse ad almeno il 95% di purezza per un'etichettatura accurata. Purificare le proteine SecA e SecYEG seguendo i protocolli descritti nel riferimento3. Assicurati di avere almeno 5 μg di proteine purificate per questo passaggio, poiché alcune proteine andranno perse durante il processo di etichettatura.
  2. Scegli due coloranti per le misurazioni FRET in base al loro valore R0 e alle distanze previste tra i siti etichettati. Stimare i valori di R0 e osservare la sovrapposizione dell'emissione del donatore e dell'assorbanza dell'accettore utilizzando le informazioni del database delle proteine fluorescenti, che fornisce anche spettri per coloranti comunemente usati (https://www.fpbase.org/spectra/)36.
    NOTA: R0 è definito come la distanza alla quale l'efficienza di trasferimento è del 50% per una data coppia di coloranti. Per gli esperimenti di mappatura, le distanze previste dovrebbero essere vicine al valore R0 della coppia di coloranti per garantire che le distanze possano essere misurate con precisione.
  3. Etichettare le posizioni identificate al punto 1.1.1. con la coppia colorante donatore-accettore.
    1. Etichettare la proteina secondo le istruzioni del produttore con particolare attenzione a parametri quali concentrazione ottimale di proteine, temperatura, pH, durata e tampone per i coloranti specifici utilizzati 43,44.
    2. Preparare la proteina ad una concentrazione di 1-2 mg/mL o circa 10 μM in un tampone Tris-HCl (pH 7,5), 25 mM KCl, 1 mM EDTA (TKE). Sciogliere il colorante in dimetilformammide (DMF) o dimetilsolfossido (DMSO) ad una concentrazione finale di 1 mM. Aggiungere il colorante a goccia alla soluzione mescolando per raggiungere un rapporto molare colorante: proteina di 5:1 (colorante 50 μM: proteina 10 μM).
    3. Lasciare che la reazione proceda per 4 ore a temperatura ambiente (RT) in un flaconcino di vetro con oscillazione delicata o durante la notte a 4 °C. Interrompere la reazione aggiungendo β-mercaptoetanolo.
      NOTA: Se la proteina non è compatibile con il tampone Tris, è possibile utilizzare tamponi fosfato o HEPES. Mantenere il pH nell'intervallo 7,0-7,5. Se la proteina ha legami disolfuro, aggiungere un agente riducente come DTT o TCEP prima dell'etichettatura. Rimuovere il DTT mediante dialisi o filtrazione su gel prima di aggiungere colorante.
  4. Per misurazioni FRET accurate rimuovere il colorante libero con un concentratore centrifugo con un appropriato cut-off a peso molecolare (MWCO) per far fluire il colorante libero mantenendo la proteina etichettata.
    1. Preparare la membrana del concentratore posizionando ~ 1 mL di acqua nella parte superiore di un concentratore da 3 mL e quindi centrifugare l'acqua attraverso la membrana (almeno 10 minuti a 4.300 x g).
    2. Rimuovere il colorante libero centrifugando il campione etichettato nel concentratore (20 min a 4.300 x g). Ripeti 3-4 volte e smaltisci il flusso attraverso.
    3. Controllare l'efficienza di marcatura della proteina etichettata utilizzando la spettroscopia di assorbimento UV-Vis.
      NOTA: le misurazioni FRET richiedono efficienze di etichettatura pari o superiori al 50%. Minori efficienze di etichettatura riducono il segnale FRET e possono portare a imprecisioni nella misurazione.
    4. Ottenere uno spettro UV-Vis della proteina marcata con un intervallo da 250-700 nm per osservare sia la banda di assorbimento proteico che la banda di massimo assorbimento del colorante. Misurare l'assorbanza al picco di assorbimento del colorante e a 280 nm per le proteine.
    5. Determinare la concentrazione di proteine e correggere eventuali contributi del colorante utilizzando il fattore di correzione, CF, e le seguenti equazioni45,46:
      figure-protocol-1
      dove C è la concentrazione della proteina (M), A280 è l'assorbanza del campione a 280 nm, Amax è l'assorbanza al massimo di assorbimento del colorante, ε proteina è il coefficiente di estinzione per la proteina a 280 nm e CF è il fattore di correzione, A'280/A'max, dove A'280 è l'assorbanza a 280 nm e A'max è l'assorbanza al massimo picco solo per il colorante.
    6. Determinare l'efficienza dell'etichettatura utilizzando la seguente equazione:
      figure-protocol-2
      dove εcolorante è il coefficiente di estinzione molare del colorante, C è la concentrazione della proteina determinata nello stadio 2.4.5 ed E è l'efficienza di etichettatura. Ripetere il passaggio 2.4.2 fino a quando il valore di efficienza dell'etichettatura non si è stabilizzato ed è inferiore al 100%.

3. Determinare i valori R 0

  1. Misurare i valori R0 in situ. Preparare due campioni proteici alla stessa concentrazione di proteine totali, 4 μM, uno con la proteina etichettata solo con il colorante donatore e uno con la proteina etichettata solo con il colorante accettore. Per SecA, una concentrazione proteica di 4 μM SecA monomero funziona bene per queste misurazioni.
    1. Preparare volumi campione di 2,5 mL per una cuvetta da 1 cm x 1 cm, 600 μL per una cuvetta da 5 mm x 5 mm o 200 μL per una cuvetta da 3 mm x 3 mm.
  2. Accendere il fluorometro e aprire il programma di acquisizione e analisi spettrale nel software di fluorescenza se si utilizza uno spettrofluorometro. Fare clic sulla M rossa per collegare il computer allo strumento (Figura 2A) e scegliere Spettri di emissione.
    1. Immettere i parametri di scansione come la lunghezza d'onda di eccitazione, l'intervallo per la scansione delle emissioni, la temperatura e la posizione del cambia campione utilizzando la voce di menu Raccogli esperimento (Figura 2B).
    2. Fare clic su RTC e ottimizzare le impostazioni dello strumento (ad esempio, fessure spettrali) monitorando l'emissione di fluorescenza al picco utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione impostata al massimo assorbimento del colorante. Per SecA, impostare le seguenti impostazioni: passaggio di banda come 1 nm; fessure di eccitazione ed emissione rispettivamente di 1 e 1,5 mm, con la temperatura a 25 °C e la velocità di agitazione a 250 giri/min.
      NOTA: non superare la capacità di conteggio al secondo (cps) dello strumento (in genere 2 x 106 cps).
  3. Posizionare il campione proteico etichettato dal donatore nel supporto del campione e fare clic su Esegui per generare una scansione delle emissioni della proteina etichettata solo con il colorante del donatore (solo proteina del donatore) emozionando il campione al massimo di assorbimento del colorante (ad esempio, 488 nm per AF488) e scansionando sul picco di emissione (505-750 nm per la proteina SecA solo del donatore etichettata con AF488).
  4. Stabilire una linea di base per la scansione estendendo la scansione di 25-50 nm oltre la fine del picco. Misurare la resa quantistica della proteina solo donatrice, eseguendo misurazioni di assorbimento e fluorescenza su campioni di diverse concentrazioni come descritto47. Mantenere le stesse impostazioni della fessura per queste misurazioni.
    1. Utilizzare il colorante donatore libero come riferimento per la resa quantistica. Ottenere almeno quattro misurazioni della proteina solo donatore e del colorante libero a diverse concentrazioni per una determinazione accurata.
    2. Tracciare l'intensità di fluorescenza o l'area integrata rispetto all'assorbanza per la proteina solo donatore e il colorante libero o il riferimento. Determinare le pendenze per la proteina solo donatore (SlopeD) e il riferimento (SlopeR).
    3. La resa quantistica (Φ) è calcolata usando la seguente equazione:
      figure-protocol-3
      qui ΦD è la resa quantistica della sola proteina donatrice, ΦR è la resa quantistica del colorante libero (questo di solito può essere ottenuto dal produttore), SlopeD e SlopeR sono le pendenze determinate nel passaggio 3.4.2 per il donatore solo proteina e riferimento, rispettivamente e ηD e ηR rappresentano l'indice di rifrazione della proteina solo donatore e delle soluzioni coloranti prive di riferimento, rispettivamente 47.
  5. Ottieni uno spettro di assorbimento della tua proteina solo accettore usando una cellula di lunghezza di percorso di 1 cm. Genera uno spettro di coefficiente di estinzione della tua proteina solo accettore dividendo lo spettro di assorbimento per la concentrazione del colorante.
  6. Generare l'integrale di sovrapposizione spettrale, J (λ) utilizzando un programma di analisi grafica. Per questo processo è possibile utilizzare anche un programma di fogli di lavoro standard (ad esempio, fogli di calcolo).
    1. Moltiplicare lo spettro di emissione di fluorescenza della proteina solo donatore (fase 3.4) per lo spettro del coefficiente di estinzione della proteina solo accettore per generare lo spettro di sovrapposizione.
    2. Moltiplicare lo spettro di sovrapposizione risultante per λ4.
    3. Determinare l'area sotto la curva mediante l'integrazione dell'area di sovrapposizione. La regione di sovrapposizione è definita come l'area in cui lo spettro di emissione del donatore moltiplicato per lo spettro del coefficiente di estinzione dell'accettore produce valori positivi. L'integrale di sovrapposizione spettrale è definito come:
      figure-protocol-4
      dove FD (λ) è lo spettro di emissione della proteina solo donatore (ottenuta nella fase 3.4) e εA(λ) è lo spettro del coefficiente di estinzione della proteina solo accettore e ha unità di M-1 cm-1 (ottenute nella fase 3.5). L'integrale di sovrapposizione spettrale risultante dovrebbe avere unità di M-1 cm-1nm4.
    4. Normalizzare l'integrale di sovrapposizione spettrale. Dividere l'integrale di sovrapposizione per l'area integrata dello spettro proteico solo donatore sullo stesso intervallo spettrale:
      figure-protocol-5
    5. Calcolare il valore R0 in Å utilizzando la seguente equazione:
      figure-protocol-6
      dove κ2 è il fattore di orientamento, tipicamente preso come 2/3 per i coloranti a rotazione libera, η è l'indice di rifrazione e può essere approssimato come 1,33 per le soluzioni acquose diluite, QD è la resa quantistica del donatore (passo 3.4) e J(λ) è l'integrale di sovrapposizione spettrale come determinato nel passo 3.6.35. NOTA: Se i coloranti non ruotano liberamente, le correzioni possono essere introdotte come descritto da Ivanov 48 e implementato da Auclair49 e Zhang 2,3.

4. Eseguire misurazioni spettrali FRET

  1. Preparare campioni di proteine solo donatore, proteine solo accettore e campioni proteici donatore-accettore alla stessa concentrazione; si raccomanda una concentrazione di 4 μM. Utilizzare 200 μL di soluzione, se si utilizza una cuvetta da 3 mm x 3 mm, 600 μL se si utilizza una cuvetta da 5 mm x 5 mm o 2,5 mL se si utilizza una cuvetta da 1 cm x 1 cm.
    1. Preparare il campione di proteina donatore-accettore utilizzando quantità molari uguali del solo donatore e solo proteine accettore.
    2. Mantenere la stessa quantità di campione etichettato solo nel donatore di controllo e accettare solo campioni proteici attraverso l'introduzione di proteine non etichettate in quantità molare uguale ai campioni solo donatore o accettante. Ad esempio, per soluzioni della stessa concentrazione, ogni campione FRET solo donatore conterrebbe 100 μL di proteine solo donatrici e 100 μL di proteina non etichettata per un volume di 200 μL.
  2. Genera spettri di emissione di fluorescenza del solo donatore, solo accettore e campioni donatore-accettore. Ottimizzare il segnale come descritto nel passaggio 3.2. Una volta ottimizzato, mantenere le stesse impostazioni per tutti i campioni.
    1. Ottenere la scansione solo donatore come descritto nel passaggio 3.3. Eccitare la soluzione al massimo assorbimento del colorante del donatore e scansionare i picchi di emissione del donatore e dell'accettore (previsto).
    2. Sostituire il campione con la proteina solo accettore o modificare la posizione del cambia campione nella cuvetta contenente la proteina solo accettore.
    3. Ottenere una scansione delle emissioni della proteina etichettata solo con colorante accettore (solo proteina accettore) utilizzando le stesse impostazioni del passaggio 4.2.1. Eccitare il campione alla lunghezza d'onda di eccitazione del donatore.
      NOTA: questo spettro fornisce una correzione per la quantità di accettore eccitato alla lunghezza d'onda del donatore (FA nel passaggio 5.1.2)
    4. Scambiare il campione con il campione di proteina donatore-accettore o modificare la posizione del cambiafiltro nella cuvetta contenente la proteina marcata donatore-accettore.
    5. Ottenere una scansione delle emissioni del campione proteico donatore-accettore utilizzando le stesse impostazioni di cui ai passaggi 4.2.1 e 4.2.3.
    6. Per tutti gli spettri, correggere la fluorescenza di fondo sottraendo i conteggi di sfondo misurati alla fine della scansione.
  3. Misurare la durata di vita del donatore solo del donatore e i campioni donatore-accettore preparati come descritto al punto 4.1.2. Utilizzare uno strumento di fluorescenza per il conteggio dei singoli fotoni correlato al tempo in grado di misurare e risolvere i decadimenti fluorescenti nell'intervallo di tempo dei nanosecondi (10-9 s).
    NOTA: per le coppie di coloranti FRET, abbinare la sorgente luminosa di eccitazione al massimo di assorbimento del colorante donatore.
    1. Accendere lo strumento. Aprire il software di acquisizione, utilizzare il software di controllo dello strumento per l'acquisizione dei dati con lo spettrometro a fluorescenza.
    2. Per l'acquisizione, selezionare TCSPC Decay, con un intervallo di tempo di 55 ns, un guadagno di 1 e 4096 canali.
    3. Ottenere una funzione di risposta dello strumento (IRF) utilizzando una soluzione di crema non casearia o soluzione di scattering commerciale e monitorare lo scattering a 490 nm. Regolare l'impostazione della fessura e utilizzare filtri a densità neutra secondo necessità per mantenere una frequenza di conteggio sufficientemente bassa da evitare l'accumulo di impulsi5. Fare clic su Accetta e quindi su Avvia. Questo avvierà l'acquisizione.
      NOTA: per una frequenza di ripetizione di 180 kHz viene utilizzata una frequenza di conteggio massima di 4000 kHz.
    4. Raccogliere l'IRF a 490 nm fino a quando il canale di picco ha un massimo di 20.000 conteggi. Raccogliere un IRF prima e dopo aver misurato ogni decadimento di fluorescenza.
    5. Ottenere i decadimenti di fluorescenza del solo donatore e dei campioni donatore-accettore monitorando l'emissione di fluorescenza alla lunghezza d'onda di emissione del donatore, 520 nm.
    6. Regolare le impostazioni della fessura per una velocità di conteggio massima di 4000 cps o inferiore. Le impostazioni della fessura sono in genere 15-20 nm bandpass per i campioni proteici. Raccogli il decadimento fino a ottenere 20.000 conteggi nel canale di picco.
  4. Analizzare il decadimento o l'intensità di fluorescenza (I) in funzione del tempo (t) per la durata di fluorescenza (τ). Adatta il decadimento a una somma di esponenziali con la seguente equazione:
    figure-protocol-7
    dove αI è il fattore premisponenziale dell'i-esima componente e τI è la durata. L'adattamento viene riconvolto con l'IRF per abbinare il decadimento della fluorescenza. Giudicare la qualità della vestibilità in base ai parametri Χ2 ridotti.

5. Analisi dei dati FRET

  1. Calcola l'efficienza FRET dalla diminuzione dell'intensità del donatore del campione donatore-accettore rispetto al donatore solo con la seguente equazione.
    figure-protocol-8
    dove FDA è l'intensità di fluorescenza del campione donatore-accettore e FD è l'intensità di fluorescenza del campione solo donatore al picco della fluorescenza del donatore. Utilizzare le aree integrate dei picchi se i dati sono rumorosi.
    1. Correggere eventuali differenze nell'etichettatura tra i campioni solo donatore e donatore-accettore. Calcola le correzioni in base al grado di etichettatura del donatore come segue.
      figure-protocol-9
      dove fDA è l'efficienza di etichettatura del donatore nel campione donatore-accettore e fD è l'efficienza di etichettatura nel campione solo donatore.
    2. Correggere eventuali contributi della fluorescenza dell'accettore allo spettro eccitato dal donatore attraverso la sottrazione dello spettro proteico solo accettore (fase 4.2) dallo spettro proteico donatore-accettore.
      figure-protocol-10
    3. Correggere le differenze nell'efficienza di etichettatura della sola proteina accettore rispetto al campione proteico donatore-accettore producendo la seguente equazione per il calcolo dell'efficienza:
      figure-protocol-11
      dove fA indica la quantità frazionaria dell'etichettatura dell'accettore. Questa equazione include tutte le correzioni dovute all'etichettatura del colorante e alla fluorescenza dell'accettore.
    4. Calcola le distanze FRET dalle efficienze usando la seguente equazione:
      figure-protocol-12
      utilizzando il valore R0 ottenuto al punto 3.6.5.
    5. Calcolare l'efficienza FRET utilizzando la durata di fluorescenza del solo donatore e i campioni donatore-accettore misurati nei passaggi 4.3.3-4.3.5:
      figure-protocol-13
    6. Utilizzare la durata ponderata in ampiezza per calcolare le efficienze FRET e confrontarle con i risultati dello statostazionario 5.
      figure-protocol-14
    7. Calcolare la distanza come nel passaggio 5.1.4 dalle efficienze determinate dalla durata di fluorescenza. Confronta i valori di stato stazionario e di risoluzione temporale per le efficienze e le distanze FRET e assicurati che siano in errore l'uno dall'altro.

6. Mappatura delle distanze

  1. Utilizzare le distanze calcolate per mappare il sito di associazione sulla struttura tridimensionale. Calcolare le distanze e gli errori per tutte le coppie di coloranti e le posizioni esaminate utilizzando l'equazione fornita nei valori del punto 5.1.4 e R0 ottenuti nel passaggio 3.6.5 per ciascuna coppia FRET.
    1. Utilizzare un programma di visualizzazione grafica 3D come PyMOL50 per mappare le distanze sulla struttura (script fornito in File supplementare). I comandi dello script possono essere inseriti direttamente nella finestra di comando con le informazioni sulla distanza appropriate.
    2. Generare un guscio per ogni distanza misurata e l'errore associato (Figura 3, Figura 4, Figure supplementari 1-3).
    3. Mappare la posizione attraverso l'intersezione dei diversi gusci (Figure supplementari 1-3). Il sito di legame peptidico del segnale è stato mappato attraverso le tre diverse posizioni su SecA e SecYEG e quattro diverse posizioni sul peptide del segnale (Figura 1).

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Risultati

Questo studio si è concentrato sulla determinazione della posizione del sito di legame preproteico su SecA prima dell'inserimento della preproteina nel canale SecYEG. Per mappare il sito di legame, sono stati eseguiti esperimenti FRET tra diverse regioni della preproteina e tre posizioni distinte sulle proteine SecA e SecYEG (Figura 1A-D). Dalle distanze ottenute e dalle strutture tridimensionali di SecA, SecYEG e della preproteina, è stata prevista la posiz...

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Discussione

Attraverso l'uso della metodologia di mappatura FRET, abbiamo identificato il sito di legame della sequenza di segnale sulla proteina SecA. È importante sottolineare che la presenza di una struttura cristallina 3D del complesso ha notevolmente facilitato il nostro studio. La forza di questa metodologia di mappatura risiede nella capacità di utilizzare una struttura esistente per identificare le posizioni per l'etichettatura. Questa metodologia non può essere utilizzata per determinare una struttura 3D; tuttavia, la deter...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione R15GM135904 del National Institutes of Health (assegnata all'IM) e dalla sovvenzione GM110552 del National Institutes of Health (assegnata al DBO).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
490 nm LED laserHoriba1684-LED
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO AlkyneLife TechnologiesA20347
AgarDifcoDF0812
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO AlkyneLife TechnologiesA10254
Alexa Fluor 488 DIBO AlkyneLife TechnologiesS10904
Alexa Fluor 647 DIBO AlkyneLife TechnologiesS10906
Amicon Ultra­ 4 Filtro centrifugo (50kDa MWCO)SigmaUFC805008
Dodecilmaltoside (DDM)AnatraceD310
E. coli peptide del segnale della fosfatasi alcalina SP22Biomolecole MidwestN/ASintetizzato oggetto personalizzato
peptide del segnale esteso SP41Biomolecole MidwestN/ASintetizzato oggetto personalizzato
FluorEssenceHoribaversione 2.4per spettrofluorimetro Fluoromax4
Spettrofluorimetro Fluoromax 4HoribaN/A
GlobalsWELaboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvineprogramma di analisi spettrale per decadimenti risolti nel tempo
H­ 4&timido; Azido&timido; Phe­ OHBACHEM4020250.0001
LB (Miller) BrodoFisher ScientificBP9723
Ludox HS-40 silice colloidale (40% in peso di sospensione in H2O)Sigma-Aldrich420816diluizione è necessaria per creare una soluzione di diffusione adeguata
PTI Felix GXHoribaversione 4.1.0.4096programma di acquisizione spettrale per PTI Time Master Instrument
PTI Time Master StrumentoHoribaNA
Pymol Programma di Grafica MolecolareSchrödingerversione 2.4
Bagno d'acquaThermo ScientificNESLAB RTE 10
Programma di acquisizione spettrale

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