Articolo metodologico

Un approccio in vitro per studiare la disfunzione mitocondriale: un modello di cibridi

DOI:

10.3791/63452

⸱

9 marzo 2022

 ,  ,  , 
1Unit of Medical Genetics and Neurogenetics, Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Carlo Besta

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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I cibridi transmitocondriali sono cellule ibride ottenute fondendo cellule impoverite di DNA mitocondriale (mtDNA) (cellule rho0 ) con citoplasti (cellule enucleate) derivati da pazienti affetti da disturbi mitocondriali. Consentono la determinazione dell'origine nucleare o mitocondriale della malattia, la valutazione dell'attività biochimica e la conferma del ruolo patogenetico delle varianti correlate al mtDNA.

Abstract

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La carenza dei complessi della catena respiratoria mitocondriale che effettuano la fosforilazione ossidativa (OXPHOS) è il marcatore biochimico dei disturbi mitocondriali umani. Da un punto di vista genetico, l'OXPHOS rappresenta un esempio unico perché deriva dalla complementazione di due sistemi genetici distinti: il DNA nucleare (nDNA) e il DNA mitocondriale (mtDNA). Pertanto, i difetti di OXPHOS possono essere dovuti a mutazioni che colpiscono i geni codificati nucleari e mitocondriali.

Il lavoro pionieristico di King e Attardi, pubblicato nel 1989, ha dimostrato che le linee cellulari umane impoverite di mtDNA (chiamato rho0) potrebbero essere ripopolate dai mitocondri esogeni per ottenere i cosiddetti "cibridi transmitocondriali". Grazie a questi cibridi contenenti mitocondri derivati da pazienti con disturbi mitocondriali (MD) e nuclei da cellule rho0 , è possibile verificare se un difetto è correlato al mtDNA o all'nDNA. Questi cibridi sono anche un potente strumento per convalidare la patogenicità di una mutazione e studiarne l'impatto a livello biochimico. Questo documento presenta un protocollo dettagliato che descrive la generazione, la selezione e la caratterizzazione dei cibridi.

Introduzione

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I disturbi mitocondriali (MD) sono un gruppo di sindromi multisistemiche causate da una compromissione delle funzioni mitocondriali a causa di mutazioni nel DNA1 nucleare (nDNA) o mitocondriale (mtDNA). Sono tra le malattie metaboliche ereditarie più comuni, con una prevalenza di 1:5.000. Le malattie associate al mtDNA seguono le regole della genetica mitocondriale: ereditarietà materna, eteroplasmia ed effetto soglia e segregazione mitotica2. Il mtDNA umano è un cerchio di DNA a doppio filamento di 16,6 kb, che contiene una breve regione di controllo con sequenze necessarie per la replicazione e la trascrizione, 13 geni codificanti proteine (tutte le subunità della catena respiratoria), 22 tRNA e 2 geni rRNA3.

Negli individui sani, esiste un singolo genotipo di mtDNA (omoplasmia), mentre più di un genotipo coesiste (eteroplasmia) in condizioni patologiche. Le mutazioni eteroplasmatiche deleterie devono superare una soglia critica per interrompere OXPHOS e causare malattie che possono colpire qualsiasi organo a qualsiasi etàdi 4 anni. La duplice genetica di OXPHOS determina la trasmissione: autosomica recessiva o dominante e legata all'X per le mutazioni del nDNA, materna per le mutazioni del mtDNA, più casi sporadici sia per nDNA che per mtDNA.

All'inizio dell'era della medicina mitocondriale, un esperimento storico di King e Attardi5 ha stabilito le basi per comprendere l'origine di una mutazione responsabile di una MD creando cellule ibride contenenti nuclei da linee cellulari tumorali in cui il mtDNA era completamente impoverito (cellule rho0) e mitocondri da pazienti con MD. Tecniche di sequenziamento di nuova generazione (NGS) non erano disponibili in quel momento, e non è stato facile determinare se una mutazione fosse presente nel genoma nucleare o mitocondriale. Il metodo, descritto nel 1989, è stato poi utilizzato da diversi ricercatori che lavorano nel campo della medicina mitocondriale 6,7,8,9; un protocollo dettagliato è stato recentemente pubblicato10, ma nessun video è stato ancora realizzato. Perché un tale protocollo dovrebbe essere rilevante al giorno d'oggi quando NGS potrebbe identificare in modo preciso e rapido dove si trova una mutazione? La risposta è che la generazione di cibridi è ancora il protocollo all'avanguardia per comprendere il ruolo patogenetico di qualsiasi nuova mutazione del mtDNA, correlare la percentuale di eteroplasmia con la gravità della malattia ed eseguire un'indagine biochimica in un sistema nucleare omogeneo in cui il contributo del background nucleare autoctono del paziente è assente11, 12,13.

Questo protocollo descrive come ottenere citoplasti da fibroblasti confluenti derivati dal paziente coltivati in piastre di Petri da 35 mm. La centrifugazione delle piastre in presenza di citocalasina B consente l'isolamento di citoplasti enucleati, che vengono poi fusi con cellule rho0 in presenza di polietilenglicole (PEG). I cibridi risultanti vengono quindi coltivati in mezzo selettivo fino a quando non sorgono cloni. La sezione dei risultati rappresentativi mostra un esempio di caratterizzazione molecolare dei cibridi risultanti per dimostrare che il mtDNA è identico a quello dei fibroblasti dei pazienti donatori e che l'nDNA è identico al DNA nucleare della linea cellulare tumorale rho0 .

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Protocollo

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NOTA: L'uso di fibroblasti umani può richiedere l'approvazione etica. I fibroblasti utilizzati in questo studio sono stati derivati da pazienti con MD e conservati nella biobanca istituzionale in conformità con i requisiti etici. È stato fornito il consenso informato per l'uso delle cellule. Eseguire tutte le procedure di coltura cellulare in un armadio a flusso laminare sterile a temperatura ambiente (RT, 22-25 °C). Utilizzare soluzioni filtrate sterili adatte per colture cellulari e apparecchiature sterili. Far crescere tutte le linee cellulari in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO2. I test del micoplasma dovrebbero essere condotti settimanalmente per garantire colture prive di micoplasma. 143BTK- rho0 celle possono essere generate come descritto in precedenza5.

1. Coltura delle cellule

  1. Prima di iniziare qualsiasi procedura, verificare la presenza della mutazione nei fibroblasti derivati da pazienti MD e quantificare la percentuale di eteroplasmia o omoplasmia mediante restriction fragment length polymorphism (RFLP) e/o analisi di sequenziamento dell'intero mtDNA14.
  2. Fibroblasti di semi in quattro piastre di Petri da 35 mm, ciascuna contenente 2 ml di terreno di coltura completo (Tabella 1). Lasciare che le cellule crescano fino all'80% confluenti (48 h).
  3. Coltivare 143 celluleBTK- rho0 in 8 mL di terreno di coltura integrato (Tabella 1) in una capsula di Petri da 100 mm.
  4. Mantenere le cellule in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO2.
  5. Controllare l'assenza di mtDNA nelle cellule rho0 mediante tecniche di sequenziamento14.

2. Enucleazione dei fibroblasti

  1. Sterilizzare quattro flaconi da 250 mL adatti alla centrifuga mediante sterilizzazione in autoclave a 121 °C per un ciclo di 20 minuti. Asciugali in un forno da laboratorio o a RT.
  2. Preriscaldare la centrifuga a 37 °C.
  3. Lavare due volte i piatti da 35 mm contenenti i fibroblasti, utilizzando 2 ml di 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) senza (senza) calcio e magnesio.
  4. Pulire la superficie esterna dei piatti con etanolo al 70% e attendere che l'alcol evapori.
  5. Rimuovere i coperchi dai piatti e i tappi a vite dalle bottiglie. Posizionare ogni piatto, senza coperchio, a testa in giù sul fondo di ogni flacone da 250 ml di centrifuga.
  6. Aggiungere lentamente 32 ml di Enucleation Medium a ciascun flacone (Tabella 1), permettendo al mezzo di entrare nel piatto e di entrare in contatto con le cellule. Rimuovere eventuali bolle dai piatti utilizzando una lunga pipetta Pasteur di vetro, curvando la punta in una fiamma Bunsen.
    NOTA: È importante rimuovere le bolle per consentire al mezzo di entrare nel piatto e venire a contatto con le cellule.
  7. Chiudere ogni flacone con il tappo a vite e trasferirle nella centrifuga.
  8. Centrifuga per 20 min a 37 °C e 8.000 × g, accelerazione max, decelerazione lenta. Attenzione al bilanciamento della centrifuga: contrappeso ogni bottiglia. Se necessario, regolare il peso aggiungendo un volume adeguato di Enucleation Medium.
  9. Durante la centrifugazione, utilizzare sottovuoto o una pipetta sierologica da 10 mL per aspirare e scartare il mezzo dalle piastre di coltura 143BTK- rho0 e lavarle due volte utilizzando 4 mL di 1x PBS senza calcio e magnesio.
  10. Aggiungere 2 ml di tripsina per coprire completamente il monostrato cellulare.
  11. Mettere i piatti in un'incubatrice a 37 °C per ~ 2 min.
  12. Rimuovere le piastre dall'incubatrice, osservare il distacco cellulare utilizzando un microscopio invertito per cellule vive (obiettivi 4x o 10x) e inibire l'attività enzimatica aggiungendo 2 ml di terreno di coltura integrato.
  13. Aspirare i 4 mL della sospensione cellulare nel piatto con una pipetta da 10 mL e trasferirla in un tubo conico da 15 mL.
  14. Contare le cellule utilizzando una camera emocitometrica Burker o un contatore automatico.
  15. Al termine della centrifugazione (fase 2.8), aspirare il mezzo dalle bottiglie ed eliminarlo.
  16. Rimuovere i piatti invertendo le bottiglie su una garza sterile precedentemente spruzzata con etanolo al 70%. Pulire la superficie esterna dei piatti e i loro coperchi con il 70% di etanolo. Attendere che l'alcol evapori, quindi chiudere i piatti.
  17. Prima di procedere, verificare la formazione di citoplasti (fantasma) utilizzando un microscopio invertito per cellule vive (obiettivo 4x o 10x). Cerca fibroblasti estremamente allungati a causa dell'estrusione dei loro nuclei indotta dalla citocalasina B.
  18. Ad ogni piatto da 35 mm, aggiungere 1 × 106 di 143BTK- rho0 cellule risospese in 2 mL di terreno di coltura 143BTK- rho0 integrato con siero bovino fetale al 5% (FBS).
  19. Lasciare le piastre per 3 ore in un incubatore umidificato a 37 °C e 5% co2 e lasciare che le cellule 143BTK- rho0 si depositino sui fantasmi. Non disturbare i piatti.

3. Fusione dei fibroblasti enucleati con cellule rho 0

  1. Dopo 3 ore di incubazione, aspirare e scartare il mezzo dai piatti.
  2. Lavare le cellule aderenti due volte con 2 mL di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ad alto contenuto di glucosio senza siero o con Minimum Essential Medium (MEM).
  3. Aspirare e scartare il mezzo.
  4. Aggiungere 500 μL di soluzione PEG (vedere la tabella dei materiali) alle cellule e incubare per esattamente 1 minuto.
  5. Aspirare ed eliminare la soluzione PEG.
  6. Lavare le cellule tre volte utilizzando 2 ml di DMEM ad alto contenuto di glucosio senza siero o con MEM.
  7. Aggiungere 2 ml di Fusion Medium (Tabella 1) e incubare durante la notte nell'incubatore a 37 °C con il 5% di CO2.

4. Selezione ed espansione di Cybrid

  1. Dopo l'incubazione notturna, rimuovere le piastre dall'incubatrice, tripsinizzare le cellule come descritto sopra (passaggi 2.9-2.13) e trasferire il contenuto di ciascun piatto da 35 mm in un piatto da 100 mm.
  2. Aggiungere 8 mL di Selection Medium (Tabella 1) e posizionare le piastre nell'incubatore a 37 °C con il 5% di CO2.
  3. Cambia il mezzo ogni 2-3 giorni.
  4. Attendere ~ 10-15 giorni di selezione fino a quando non compaiono colonie di cellule.
  5. Congela una delle quattro piastre di Petri raccogliendo tutti i cloni e generando una cultura "massiccia" come backup dei cibridi, che può essere eventualmente ricollocata e utilizzata per ulteriori indagini.
  6. Tripsinizzare le cellule nei restanti piatti di coltura, contare e seminare in una o più piastre di Petri a 50-100 cellule / piatto nel terreno di coltura integrato (Tabella 1) fino a quando non compaiono cloni. Lasciateli crescere per alcuni giorni.
  7. Pellet le celle rimanenti per centrifugazione a 1.200 × g per 3 min a RT ed scartare il surnatante.
  8. Estrarre il DNA dal pellet (vedi tabella dei materiali).
  9. Eseguire la genotipizzazione mediante un numero variabile di analisi a ripetizione tandem (VNTR) come precedentemente riportato15.
  10. Prelevare i cloni dalla capsula di Petri con cilindri di clonazione o una punta di pipetta, utilizzando uno stereomicroscopio per evitare il raggruppamento di diversi cloni e trasferirli in una piastra a 96 pozzetti, ciascuno contenente 200 μL di terreno di coltura integrato (Tabella 1).
  11. Espandi ogni clone fino a quando non ci sono abbastanza cellule per congelare ed estrarre il DNA.
  12. Verificare la percentuale di mutazione di ciascun clone mediante RFLP o altri metodi di sequenziamento. Idealmente, cerca di ottenere sia cloni con mtDNA wild-type (mutazione 0%) che cloni con diverse percentuali di mutazione, entrambi sommati al mtDNA mutante omoplasmatico (mutazione 100%). Vedere la Figura 1 per un diagramma schematico del protocollo di generazione cybrid.

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Risultati

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La generazione di cybrid richiede 3 giorni di lavoro di laboratorio più un periodo di selezione (~ 2 settimane) e ulteriori 1-2 settimane per la crescita dei cloni. I passaggi critici sono la qualità dei citoplasti e il periodo di selezione. La morfologia dei cibridi assomiglia a quella delle cellule donatrici rho0. L'assegnazione del mtDNA e dell'nDNA corretti nei cibridi è obbligatoria per confermare l'identità delle cellule. Un esempio è riportato nella Figura 2. In questo caso...

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Discussione

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Il mtDNA ha un tasso di mutazione molto elevato rispetto all'nDNA a causa della mancanza di istoni protettivi e della sua posizione vicino alla catena respiratoria, che espone la molecola a dannosi effetti ossidativi non efficacemente contrastati dai sistemi di riparazione16. Le prime mutazioni patogenetiche del mtDNA sono state identificate nel 198817,18 e da allora è stato descritto un gran numero di mutazioni. La tecnologia NGS è un app...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Ringraziamenti

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Questo studio è stato condotto nel Centro per lo Studio delle Malattie Mitocondriali Pediatriche (http://www.mitopedia.org), finanziato dalla Fondazione Mariani. VT è membro dell'European Reference Network for Rare Neuromuscular Diseases (ERN EURO-NMD).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
5-Bromo-2'-DeossiuridinaSigma-Aldrich (Merck)B5002-500MG
Piastre a 6 pozzettiCorning3516
Piastre a 96 pozzettiCorning3596
Kit di estrazione del DNA per colture di sangue e celluleQIAGEN13323
CentrifugaBeckman CoulterAvanti J-257.200 rcf, 37 gradi C
Flaconi da centrifuga, 250 mLBeckman Coulter356011
Citocalasina B da Drechslera dematioideaSigma-Aldrich (Merck)C2743-200UL
FBS dializzatoGibco26400-036 100mL
DMEM Alto glucosio (senza L-glutammina con piruvato di sodio)EuroCloneECB7501L
soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco - PBS (con o Calcio senza Magnesio)EuroCloneECB4004L
Etanolo Anidro AssolutoCarlo Erba414601
FetalClone III (Prodotto a base di siero bovino)Cytiva - HyClone LaboratoriesSH30109.03
Pipette in vetro pasteurVWRM4150NO250SP4
Microscopio da ricerca invertito per microscopia su cellule viveNikonECLIPSE TE200
JA-14 Rotore in alluminio ad angolo fissoBeckman Coltro339247
Autoclave da laboratorio Vapormatic 770Labotech29960014
L-Glutammina 200 mM (100x)EuroCloneECB 3000D
Minimo Essenziale Medio MEMEurocloneECB2071L
MycoAlert Kit di rilevamento del micoplasmaLonzaLT07-318
PEG (soluzione di polietilene glicole)Sigma-Aldrich (Merck)P7181-5X5ML
Penicillina-streptomicina (soluzione 100x)EuroCloneECB3001D
Primo TC Piastre 100 mmEuroCloneET2100
Primo TC Piastre 35 mmEuroCloneET2035
Piruvato di sodio 100 mMEuroCloneECM0542D
StereomicroscopioNikonSMZ1000
tripsina 2,5% in HBSSEuroCloneECB3051D
UridinaSigma-Aldrich (Merck)U3003-5G

Riferimenti

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