Articolo metodologico

Isolamento e analisi funzionale dell'endotelio arteriolare del parenchima cerebrale del topo

DOI:

10.3791/63463

⸱

11 marzo 2022

 ,  , 
1Department of Basic Sciences, Loma Linda University, 2Departments of Physiology, Surgery and Neurosurgery and Sarver Heart Center, University of Arizona College of Medicine Tucson

In questo articolo

Sommario

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La preparazione intensiva di "tubi" endoteliali cerebrali di topo intatti da arteriole parenchimali cerebrali è illustrata per lo studio della regolazione del flusso sanguigno cerebrale. Inoltre, dimostriamo i punti di forza sperimentali di questo modello di studio endoteliale per l'imaging a fluorescenza e la misurazione elettrofisiologica delle principali vie di segnalazione cellulare, compresi i cambiamenti nel potenziale intracellulare [Ca2+] e di membrana.

Abstract

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Il flusso sanguigno cerebrale è trasmesso dalle arterie di resistenza vascolare e dalle arteriole parenchimali a valle. La resistenza vascolare allo stato stazionario al flusso sanguigno aumenta con la diminuzione del diametro dalle arterie alle arteriole che alla fine alimentano i capillari. A causa delle loro dimensioni e posizione più piccole nel parenchima, le arteriole sono state relativamente poco studiate e con una minore riproducibilità nei reperti rispetto alle arterie piali superficiali. Indipendentemente da ciò, la struttura e la funzione delle cellule endoteliali arteriolari, parte integrante della fisiologia e dell'eziologia delle malattie degenerative croniche, richiedono un'indagine approfondita. In particolare, prove emergenti dimostrano che la funzione endoteliale compromessa precede ed esacerba il deterioramento cognitivo e la demenza.

Nella microcircolazione parenchimale, la funzione del canale K+ endoteliale è lo stimolo più robusto per controllare finemente la diffusione della vasodilatazione per promuovere aumenti del flusso sanguigno verso le aree di attività neuronale. Questo documento illustra un metodo raffinato per isolare di nuovo "tubi" endoteliali intatti ed accoppiati elettricamente (diametro, ~ 25 μm) dalle arteriole parenchimali del cervello di topo. I tubi endoteliali arteriolari sono fissati durante le condizioni fisiologiche (37 °C, pH 7,4) per risolvere le variabili sperimentali che comprendono la funzione del canale K+ e la loro regolazione, tra cui la dinamica intracellulare di Ca2+ , i cambiamenti nel potenziale di membrana e la regolazione lipidica di membrana. Un netto vantaggio tecnico rispetto all'endotelio arterioso è la maggiore risoluzione morfologica delle dimensioni delle cellule e degli organelli (ad esempio, i mitocondri), che espande l'utilità di questa tecnica. Una sana perfusione cerebrale per tutta la vita comporta una robusta funzione endoteliale nelle arteriole parenchimali, collegando direttamente il flusso sanguigno all'alimentazione dell'attività neuronale e gliale in precise regioni anatomiche del cervello. Pertanto, si prevede che questo metodo farà progredire significativamente la conoscenza generale della fisiologia vascolare e delle neuroscienze riguardanti il cervello sano e malato.

Introduzione

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Le arteriole parenchimali forniscono direttamente ossigeno e sostanze nutritive essenziali in tutto il cervello1. Durante l'interfacciamento con i capillari, le arteriole altamente vasoattive rispondono alla segnalazione retrograda avviata dai canali ionici capillari che rilevano i segnali metabolici provenienti da specifiche regioni neuronali2. Con il parenchima cerebrale che ha storicamente ricevuto la maggior parte delle indagini, è ora emerso un ruolo per la disfunzione endoteliale per chiarire i meccanismi patologici associati a vari disturbi cerebrovascolari che sono alla base della demenza (ad esempio, ictus ische....

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Protocollo

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Gli sperimentatori dovrebbero garantire che l'uso designato degli animali e dei protocolli associati sia approvato dal loro Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) ed eseguito in conformità con la "Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio" del Consiglio nazionale delle ricerche (8a edizione, 2011) e le linee guida ARRIVE. La IACUC della Loma Linda University e dell'Università dell'Arizona ha approvato tutti i protocolli utilizzati per questo manoscritto per topi C57BL/6N e 3xTg-AD (maschi e femmine; fascia di età: 2-30 mesi). Vedere la Figura 1 come panoramica dell'isolamento e de....

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Risultati

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Una dimostrazione del protocollo è mostrata in Figura 1 con le fasi di dissezione arteriolare e isolamento del tubo endoteliale come Figura 2 e Figura 3, rispettivamente. Qui, la funzione endoteliale è stata valutata misurando [Ca2+]i e Vm utilizzando la fotometria Fura-2 e l'elettrofisiologia con elettrodi affilati (Figura 4A) in risposta a un agente farmacologico [2-me.......

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Discussione

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Prove crescenti suggeriscono che la malattia cerebrovascolare (CVD), l'invecchiamento e il morbo di Alzheimer sono fortemente correlati e sono un argomento attuale della ricerca sulla demenza 4,8,14,21. Pertanto, è ovvio che gli studi sulla rete cerebrovascolare avrebbero un ampio impatto sulla salute, pur richiedendo un'indagine approfondita continua durante le condizioni di malattia. Come pun.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni del National Institutes of Health (R00AG047198 & R56AG062169 a EJB; R00HL140106 a PWP) e l'Alzheimer's Association (AZRGD-21-805835 a PWP). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Institutes of Health o dell'Alzheimer's Association.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Amplificatori MolecularDevices, Sunnyvale, CA, USAAxoclamp 2B & Axoclamp 900A
Monitor acustici di baseAmpol US LLC, Sarasota, FL, USA  Refrigeratore da bagno BM-A-TM
(Isotemp 500LCU)ThermoFisher Scientific
(Pinning)Warner InstrumentsG150T-6
(elettrodi affilati)CapillariWarner InstrumentsGC100F-10
(triturazione)World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA1B100-4
BSA: Albumina sierica bovinaSigmaA7906
CaCl2: Cloruro di calcioSigma223506
Collagenasi (miscela di tipo H)SigmaC8051
(2.4  &volte;   5,0  cm)ThermoFisher Scientific12-548-5M
Digitalizzatore di acquisizione datiMolecular Devices, Sunnyvale, CA, USADigidata 1550A
Dissection Dish (Petri in vetro con fondo Sylgard a carbone)Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USADD-90-S-BLK
DitioreritritoloSigmaD8255
DMSO: DimetilsolfossidoSigmaD8418
Elastasi (pancreas suino)SigmaE7885
Tracker del reticolo endoplasmatico (ER-Tracker rosso, BODIPY TR Glibenclamide)ThermoFisher ScientificE34250
Sorgenti luminose in fibra ottica  Schott, Magonza, Germania & KL200, valvola di controllo del flusso ZeissFostec 8375
Warner Instruments  Interfaccia
, lampada ARC e alimentatore, hyperswitch e dispositivimolecolari PMT, Sunnyvale, CA, USAIonOptix Systems
Pincipi (a punta fine, affilati)FSTDumont #5 & Dumont #55
Generatore di funzioniEZ Digital, Seoul, Corea del SudFG-8002
Fura-2 AM coloranteInvitrogen, Carlsbad, CA, USAF14185
GlucosioSigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)G7021
HCl: Acido cloridricoThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)A466250
HeadstagesMolecular DispositiviHS-2A e HS-9A
HEPES: (acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfofonico)SigmaH4034
Riscaldatore di soluzione in lineaWarner InstrumentsSH-27B
KCl: Cloruro di potassioSigmaP9541
MgCl2: Cloruro di magnesioSigmaM2670
MicroforgeNarishige, East Meadow, NY, USA  MF-900
MicromanipolatoreSiskiyou  Estrattore per micropipette MX10
(digitale)Sutter Instruments, Novato, CA, USAP-97 o P-1000
(Nikon-invertito)Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USAMicroscopio Ts2
(Nikon-invertito)Nikon Instruments IncEclipse TS100
Obiettivi per microscopioNikon Instruments Inc20X (S-Fluor) e 40X (Plan Fluor)
Piattaforma per microscopio (alluminio anodizzato; diametro, 7,8  WarnerInstrumentsPM6 o PH6
Tavolino per microscopio (alluminio)Siskiyou, Grants Pass, OR, USA8090P
Microsyringe Pump ControllerWorld Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USASYS-MICRO4
MTA: 2-metiltioadenosina difosfato sale trisodicoTocris1624
NaCl: cloruro di sodioSigmaS7653
NaOH: Idrossido di sodioSigmaS8045
Colorazione nucleare (Reagente NucBlue Live ReadyProbes; Hoechst 33342)Oscilloscopio ThermoFisher ScientificR37605
Tektronix, Beaverton, Oregon, USA  TDS 2024B
PapainSigmaP4762
Obiettivi a contrasto di faseNikon Instruments Inc ( Ph1 DL; 10 volte e 20X)
Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red)ThermoFisher ScientificC10046
Plexiglas camera di superfusioneWarner Instruments, Camden, CT, USARC-27
Forbici (lame da 3 mm e 7 mm)Fine Science Tools (o FST), Foster City, CA, USAMoria MC52 & 15000-00
Forbici (stile Vannas; 9.5  mm & 3  WorldPrecision Instruments555640S, 14364
StereomicroscopiZeiss, NY, USAStemi 2000 & 2000-C
(0,22 &; micro; m)Termoregolatore ThermoFisher Scientific722-2520
(doppio canale)Warner InstrumentsTC-344B o C
Sistema di controllo delle valvoleWarner InstrumentsVC-6
Tabella di isolamento dalle vibrazioniProduzione tecnica, Peabody, MA, USA  Micro-g
Capillari in vetro borosilicato 13874647 Capillari in vetro borosilicato in vetro borosilicato Vetro di copertura del sistema di fluorescenza FR-50 Microscopio Filtro per siringa

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22290-22295 (2010).
  2. Longden, T. A., et al.

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Parenchymal ArteriolesEndothelial Tube IsolationMouse Brain VasculatureIntracerebral Blood FlowEndothelial FunctionMembrane PotentialIntracellular CalciumLive Cell ImagingImmunohistochemistry

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