Le microvescicole rilasciate dalla membrana plasmatica agiscono come effettori cellulari. Le microvescicole della milza (SMV) sono marcatori surrogati di condizioni fisiopatologiche. Nei ratti e nei topi, il contenuto e le proprietà di SMV caratterizzano l'invecchiamento o l'infiammazione e sono alterati dai trattamenti citoprotettivi, rendendoli uno strumento di monitoraggio prezioso ma abbondante per la ricerca preclinica.
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Articolo metodologico
Isolamento di microvescicole spleniche in un modello murino di infezione batterica intraperitoneale
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le microvescicole (MV) sono frammenti submicronici rilasciati dalla membrana plasmatica delle cellule attivate che agiscono come effettori cellulari proinfiammatori e procoagulanti. Nei ratti, le MV della milza (SMV) sono marcatori surrogati di condizioni fisiopatologiche. Precedenti studi in vitro hanno dimostrato che il Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis), un importante patogeno parodontale, consente la perdita endoteliale e l'apoptosi, mentre il lipopolisaccaride (LPS) favorisce la perdita di microvescicole derivate dagli splenociti (SMV). Studi in vivo hanno dimostrato la fattibilità del controllo farmacologico della diffusione dell'SMV. Il presente protocollo stabilisce una procedura standardizzata per l'isolamento degli SMV splenici dal modello di infezione murina acuta da P. gingivalis . L'infezione da P. gingivalis è stata indotta in giovani topi C57BL/6 mediante iniezione intraperitoneale (tre iniezioni di 5 x 107 batteri/settimana). Dopo due settimane, le milze sono state raccolte, pesate e contati gli splenociti. Gli SMV sono stati isolati e quantificati mediante saggi di proteine, RNA e protrombinasi. La vitalità cellulare è stata valutata mediante ioduro di propidio o coloranti di esclusione blu di tripano. Dopo l'estrazione degli splenociti, la conta dei neutrofili è stata ottenuta mediante citometria a flusso dopo 24 ore di coltura degli splenociti. Nei topi iniettati con P. gingivalis, sono stati osservati un aumento di 2,5 volte del peso della milza e un aumento di 2,3 volte della conta degli splenociti, mentre la conta dei neutrofili è aumentata di 40 volte. La vitalità cellulare degli splenociti dei topi iniettati con P. gingivalis variava dal 75% al 96% ed è diminuita del 50% dopo 24 ore di coltura senza alcuna differenza significativa rispetto ai controlli non esposti. Tuttavia, gli splenociti dei topi iniettati perdono quantità maggiori di MV mediante il saggio della protrombinasi o le misurazioni delle proteine. I dati dimostrano che gli SMV procoagulanti sono strumenti affidabili per valutare una risposta precoce della milza all'infezione intraperitoneale da P. gingivalis .
Introduzione
Le microvescicole (MV), chiamate anche microparticelle o ectosomi, sono frammenti di membrana plasmatica con un diametro di 0,1-1,0 μm rilasciati nei fluidi corporei e nello spazio extracellulare in risposta a vari stimoli cellulari. Identificate per la prima volta come polvere piastrinica che espone fosfolipidi procoagulanti, principalmente fosfatidilserina (PSer), le MV costituiscono una superficie aggiuntiva per l'assemblaggio dei complessi della coagulazione del sangue 1,2. Il ruolo chiave delle MV circolanti come effettori procoagulanti è stato dimostrato in pazienti con ....
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Protocollo
Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati e seguiti dalle relative linee guida del Comitato Etico locale (APAFIS#28745-2020121815051557) e della cura degli animali dell'Università di provenienza e dell'INSERM. Per gli esperimenti sono stati utilizzati giovani topi maschi C57BL/6, di 6-8 settimane di età. I topi sono stati regolarmente esaminati per valutare il dolore e lo stress e il loro peso è stato monitorato quotidianamente. Salvo diversa indicazione, tutti i tamponi e le soluzioni di estrazione devono essere sterili e a temperatura ambiente.
1. Preparazione degli animali
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Risultati
I dati forniti forniscono una rappresentazione completa dell'intera procedura, utilizzando due principali condizioni animali: giovani topi C57BL/6 di controllo non trattati e i loro compagni di cucciolata sottoposti a sei iniezioni intraperitoneali (IP) di PG ogni 2 giorni, per 2 settimane. Mostrano anche l'azione remota di un'iniezione intraperitoneale di PG sulla risposta della milza dopo 2 settimane. Le microvescicole degli splenociti sono state quantificate mediante saggio enzimatico della protrombinasi o misurando l.......
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Discussione
Il presente studio conferma che la milza è una fonte importante e affidabile di MV con rilevanza fisiopatologica rispetto ad altre fonti come il sangue, di volume limitato nei topi. A condizione che vengano prese precauzioni, il metodo è facile da configurare e non richiede attrezzature costose. Poiché non è disponibile un metodo alternativo diverso dalla valutazione in vivo , l'attuale modello sembra essere un metodo prezioso per studiare l'impatto dei pro-farmaci sulla diffusi.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori sono in debito con Claudine Ebel del Service commun de cytométrie en flux (Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, Strasburgo) per l'assistenza esperta e la formazione per l'analisi complessa della citometria a flusso della milza e Ali El Habhab per la formazione iniziale sulla marcatura delle cellule della milza di ratto. Deniz Karagyoz aiutò a scavare nella raccolta di letteratura. Questo lavoro è stato in parte sostenuto da due sovvenzioni ANR: COCERP (N°A17R417B), ENDOPAROMP (N°ANR-17-CE17-0024-01).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette da 2 mL tipo Eppendorf | Dutscher | 54816 | Sté riel microprovette |
| Allegra 64 R Centrifuga | Beckman Coulter | ||
| Contatore cellulare automatico | Biorad | ||
| Albumina sierica bovina | Euromedex | 04-100-812-E | Preparato, filtrato con 0,22 &; m setaccio e conservato a 4 ° C in condizioni sterili utilizzando le seguenti formule: 2 mM EDTA, 0,5% BSA e PBS sterile |
| CD11 (Mac-1) | e-Biosciences | 45-00112-80 | Coniugato a eFluor 450; λ Eccitazione max 405 nm λ max emissione 445 nm |
| CD16/32 | BD Biosciences | 553142 | EDTA non coniugato |
| Calbiochem | Calbiochem S | 6381-92-6 | |
| Tubo di falco | Cell star 227261 | 50 mL | |
| Siero fetale bovino | Dutscher | S1810-500 | Numero di lotto = |
| S14028S1810 Fortessa Aria | BD Biosciences | per smistamento cellulare | |
| citometro a flusso Fortessa | Becton-Dickinson. | ||
| Fungizone | PAN biotech | P06-01050 | |
| HBSS | Gibco | 14175-053 | Senza rosso fenolo, senza Ca+2 e Mg+2 |
| ICAM-1 | abcam | ab171123 | |
| LYG-6 (Gr-1) | BD Biosciences | 566218 | Coniugato a BUV395; λ max eccitazione 348 nm, λ emissione max 395 nm |
| Eritrociti tampone di lisi (ACK) | Sigma | Preparato, filtrato con 0,22 &; m setaccio e conservato a 4 gradi C in condizioni sterili utilizzando le seguenti formule: NH4Cl, 0,15 M (molarità), 53,491 (mw) 4 g KHCO3 1 mM (molarità) 100,115 (mw), 50 mg EDTA 0,1 mM (molarità), 292,24 (mw), 14,6 g pH: 7,2– 7.4 | |
| Spettrofotometro NanoDrop 1000 | Thermoscientific | ||
| PBS | Lonza | 17-516F | Senza Ca+2 e Mg+2 |
| Petri in plastica | 100 mm | ||
| Tubo in polistirene | Falcon | 352070 | |
| q-Nano Gold | iZON science | ||
| Terreno di coltura RPMI 1640: 2 g/L di glucosio | PAN biotech | p04-18047 | Integrato conIntegrato con streptomicina (100 U/mL) /Penicillina (100 U/mL), Fungizone (250 mg/mL), L-glutammina (2 mM) e FBS 10%. |
| Setaccio per bisturi | |||
| Nylon | Falcon USA | 352360 | 100 µ m |
| Streptomicina/Penicillina | PAN biotech | P06-07100 | |
| Siringa | 2 mL | ||
| Trypan Blue | Biorad | 1450013 | |
| VCAM1 | abcam | ab215380 |
Riferimenti
- Loyer, X., et al. Intra-cardiac release of extracellular vesicles shapes inflammation following myocardial infarction. Circulation Research. 123 (1), 100-106 (2018).
- Aupeix, K., Toti, F., Satta, N., Bischoff, P., Freyssinet, J. M.
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Ristampe e permessi
