Isolamento di microvescicole spleniche in un modello murino di infezione batterica intraperitoneale

Summary

Le microvescicole rilasciate dalla membrana plasmatica agiscono come effettori cellulari. Le microvescicole della milza (SMV) sono marcatori surrogati di condizioni fisiopatologiche. Nei ratti e nei topi, il contenuto e le proprietà di SMV caratterizzano l'invecchiamento o l'infiammazione e sono alterati dai trattamenti citoprotettivi, rendendoli uno strumento di monitoraggio prezioso ma abbondante per la ricerca preclinica.

Abstract

Le microvescicole (MV) sono frammenti submicronici rilasciati dalla membrana plasmatica delle cellule attivate che agiscono come effettori cellulari proinfiammatori e procoagulanti. Nei ratti, le MV della milza (SMV) sono marcatori surrogati di condizioni fisiopatologiche. Precedenti studi in vitro hanno dimostrato che il Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis), un importante patogeno parodontale, consente la perdita endoteliale e l'apoptosi, mentre il lipopolisaccaride (LPS) favorisce la perdita di microvescicole derivate dagli splenociti (SMV). Studi in vivo hanno dimostrato la fattibilità del controllo farmacologico della diffusione dell'SMV. Il presente protocollo stabilisce una procedura standardizzata per l'isolamento degli SMV splenici dal modello di infezione murina acuta da P. gingivalis . L'infezione da P. gingivalis è stata indotta in giovani topi C57BL/6 mediante iniezione intraperitoneale (tre iniezioni di 5 x 10⁷ batteri/settimana). Dopo due settimane, le milze sono state raccolte, pesate e contati gli splenociti. Gli SMV sono stati isolati e quantificati mediante saggi di proteine, RNA e protrombinasi. La vitalità cellulare è stata valutata mediante ioduro di propidio o coloranti di esclusione blu di tripano. Dopo l'estrazione degli splenociti, la conta dei neutrofili è stata ottenuta mediante citometria a flusso dopo 24 ore di coltura degli splenociti. Nei topi iniettati con P. gingivalis, sono stati osservati un aumento di 2,5 volte del peso della milza e un aumento di 2,3 volte della conta degli splenociti, mentre la conta dei neutrofili è aumentata di 40 volte. La vitalità cellulare degli splenociti dei topi iniettati con P. gingivalis variava dal 75% al 96% ed è diminuita del 50% dopo 24 ore di coltura senza alcuna differenza significativa rispetto ai controlli non esposti. Tuttavia, gli splenociti dei topi iniettati perdono quantità maggiori di MV mediante il saggio della protrombinasi o le misurazioni delle proteine. I dati dimostrano che gli SMV procoagulanti sono strumenti affidabili per valutare una risposta precoce della milza all'infezione intraperitoneale da P. gingivalis .

Introduction

Le microvescicole (MV), chiamate anche microparticelle o ectosomi, sono frammenti di membrana plasmatica con un diametro di 0,1-1,0 μm rilasciati nei fluidi corporei e nello spazio extracellulare in risposta a vari stimoli cellulari. Identificate per la prima volta come polvere piastrinica che espone fosfolipidi procoagulanti, principalmente fosfatidilserina (PSer), le MV costituiscono una superficie aggiuntiva per l'assemblaggio dei complessi della coagulazione del sangue ^1,2. Il ruolo chiave delle MV circolanti come effettori procoagulanti è stato dimostrato in pazienti con sindrome di Scott², una rara malattia genetica che porta a un'esposizione disfunzionale a PSer e sanguinamento (Figura 1 supplementare). Le MV sono state ampiamente studiate come biomarcatori circolanti del rischio trombotico nelle malattie croniche associate a disturbi cardiovascolari come il diabete, la malattia renale cronica, la preeclampsia e l'ipertensione ^3,4. Attualmente sono riconosciuti come veri effettori cellulari in fluidi o tessuti di organi come il miocardio¹. Poiché trasportano proteine attive, lipidi e miRNA, modulano in remoto le risposte vascolari come l'emostasi, l'infiammazione, l'angiogenesi vascolare e la crescita vascolare o il rimodellamento dei tessuti⁵.

Mentre gli studi clinici esaminano il valore prognostico delle MV per quanto riguarda i fattori di rischio, le MV isolate dai fluidi o dai tessuti del paziente consentono la valutazione ex vivo delle loro proprietà effettrici⁶. La decifrazione dei meccanismi che regolano la biogenesi delle MV e le capacità di cross-talk sono generalmente ottenute in modelli di coltura cellulare per identificare molecole attive esposte o incapsulate all'interno delle MV e la loro segnalazione a valle. Le interazioni MV con le cellule bersaglio dipenderanno dal legame proteina/proteina di membrana, quando sono disponibili contro-ligandi appropriati, e/o dalla fusione lipidica⁷.

In condizioni fisiologiche, le MV circolanti nel plasma originano principalmente da cellule vascolari, come identificato dai marcatori di differenziazione del cluster di lineage (CD)^8,9. Tuttavia, in patologia, in particolare nel cancro¹⁰ e nel rigetto del trapianto^11,12, le MV vengono eliminate dal tessuto danneggiato e presentano caratteristiche procoagulanti e proinfiammatorie nocive. Questi vengono rilevati nella circolazione sistemica, rendendoli sonde utili per il monitoraggio di terapie protettive o di ringiovanimento e possibili bersagli farmacologici¹³. Poiché le MV circolano come un pool di stoccaggio dinamico che riflette l'omeostasi delle cellule vascolari e tissutali in salute e malattia, è necessario studiare una migliore comprensione della loro azione remota anche in vivo, dopo l'iniezione endovenosa o l'instillazione nasale in piccoli animali^14,15. In effetti, le MV sono state considerate i principali contributori alle intricate vie che accoppiano l'infiammazione esagerata e la trombosi¹⁶.

La parodontite è una malattia infiammatoria di origine infettiva che colpisce i tessuti di sostegno dei denti^17,18 ed è associata a rischio trombotico. È caratterizzata da sanguinamento gengivale, distruzione dell'osso alveolare, mobilità dei denti e può infine portare alla perdita dei denti. La parodontite è molto diffusa in tutto il mondo e colpisce oltre il 50% della popolazione, con l'11% che presenta una forma grave¹⁹. La parodontite è indotta dalla disbiosi batterica dei biofilm sottogengivali, che sostengono una risposta infiammatoria esacerbata che innesca la distruzione dei tessuti²⁰. Nell'ultimo decennio, la parodontite è stata collegata a malattie sistemiche come disturbi cardiovascolari, diabete e artrite reumatoide. Le possibili spiegazioni sono l'azione dei patogeni parodontali a distanza e/o l'aumento dell'infiammazione sistemica mediata da citochine proinfiammatorie come l'interleuchina (IL-1, IL-6) e il TNF-α^21,22.

Tra i patogeni associati all'insorgenza e allo sviluppo della parodontite, Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis)²³ si trova nella maggior parte delle lesioni gravi che raccolgono diversi fattori di virulenza, tra cui il lipopolisaccaride (LPS)²⁴ che induce risposte infiammatorie mediate dal recettore Toll-like (TLR)²⁵ e il reclutamento di neutrofili e leucociti polimorfonucleati (PMN) nel sito dell'infezione iniziale²⁶. L'LPS di P. gingivalis attiva TLR-4 o TLR-2, facilitando il rilevamento immunitario e l'evasione della sopravvivenza batterica²⁷. A livello vascolare, l'attivazione di TLR2 da parte di LPS è associata all'immunotrombosi. La capacità unica di P. gingivalis di indurre la segnalazione di TLR-2, mentre il riconoscimento TLR-4-dipendente è significativamente compromesso, favorisce un'infezione persistente di basso grado^28,29.

Le procedure in vivo per studiare le risposte MV all'infezione cronica e prolungata di patogeni di basso grado sono scarse. Gli approcci metodologici per l'estrazione di MV tissutali sono scarsamente descritti in letteratura e generalmente riguardano il prelievo di MV da tessuti patologici come tumori solidi, steatosi epatica, placche aterotrombotiche o innesti 11,29,30, mentre la milza rileva batteri e virus nel flusso sanguigno. Immagazzina anche eritrociti, piastrine, linfociti, monociti, basofili ed eosinofili coinvolti nella risposta immunitaria. I granulociti come i neutrofili della polpa rossa generano anche specie reattive dell'ossigeno (ROS) e proteasi che distruggono gli agenti patogeni e prevengono la diffusione dell'infezione^31,32. Sorprendentemente, e per quanto ne sappiamo, le MV della milza non vengono studiate nel contesto degli insulti tissutali indotti da agenti patogeni. C'è un bisogno globale insoddisfatto di studiare le variazioni delle MV tissuari in fisiopatologia.

I dati in vitro del nostro laboratorio hanno dimostrato che l'LPS induce la fuoriuscita di MV procoagulanti dagli splenociti di ratto, che a sua volta provoca la senescenza di cellule endoteliali coronariche in coltura e un fenotipo endoteliale proinfiammatorio e proinfiammatorio proinfiammatorio¹¹. La fattibilità del controllo farmacologico delle MV della milza è stata ulteriormente dimostrata dopo aver trattato l'animale con una formula ottimizzata di omega-3. La sonda orale di ratti di mezza età e di età avanzata è risultata protettiva sia contro l'emissione di MV procoagulanti dagli splenociti sia contro le loro proprietà nocive prosenescenti verso l'endotelio coronarico³³.

Rispetto al sangue, la milza offre il vantaggio di essere un'importante fonte di leucociti in un individuo. Inoltre, è stato recentemente proposto un asse splenico-cardiaco ^3,34, rendendo la milza un possibile contributore al rischio cardiovascolare correlato all'infezione di interesse benefico per il controllo farmacologico. La valutazione delle proprietà o del rilascio degli SMV è fondamentale per comprendere le risposte infiammatorie o indotte da agenti patogeni. È interessante notare che può essere raggiunto negli animali trattati e in diversi modelli fisiopatologici (età, ipertensione, diabete). Infatti, confrontando ratti di mezza età e di^{età 33} anni, le differenze nelle proprietà e nel rilascio di MV della milza possono essere evidenziate dopo una semplice coltura di splenociti di 24 ore.

Date le evidenze di cui sopra dell'alterazione delle proprietà effettrici delle MV della milza con la condizione fisiopatologica e la fattibilità del loro controllo farmacologico nei ratti, viene descritto un protocollo standardizzato per l'isolamento delle MV della milza murina. La procedura si adatterebbe meglio a indagini approfondite sui meccanismi in vivo che supportano gli effetti mediati da SMV, eventualmente in topi ingegnerizzati. La procedura è stata stabilita in topi C57BL/6 utilizzando un'infezione intraperitoneale locale da P. gingivalis, per stabilire la prova di un'azione remota del patogeno sulle proprietà effettrici della milza MV (SMV).

Protocol

Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati e seguiti dalle relative linee guida del Comitato Etico locale (APAFIS#28745-2020121815051557) e della cura degli animali dell'Università di provenienza e dell'INSERM. Per gli esperimenti sono stati utilizzati giovani topi maschi C57BL/6, di 6-8 settimane di età. I topi sono stati regolarmente esaminati per valutare il dolore e lo stress e il loro peso è stato monitorato quotidianamente. Salvo diversa indicazione, tutti i tamponi e le soluzioni di estrazione devono essere sterili e a temperatura ambiente.

1. Preparazione degli animali

1. Somministrare ai topi sei iniezioni intraperitoneali di P. gingivalis (PG) ogni 2 giorni per 2 settimane (tre iniezioni di 5 x 10⁷ batteri/settimana, File supplementare 1).
2. Anestetizzare i topi utilizzando una combinazione di 100 mg/kg di ketamina e 10 mg/kg di xilazina.
3. Sacrificare i topi anestetizzati e prelevare la milza dopo la laparotomia.
   NOTA: Le condizioni specifiche per l'infezione da P. gingivalis e il sacrificio degli animali per il prelievo della milza sono descritte in dettaglio nella sezione "esperimenti sugli animali" del File Supplementare 1. La rappresentazione schematica dei passaggi del protocollo è mostrata nella Figura 1.

2. Estrazione di splenociti

1. Usando un bisturi, tritare il tessuto della milza in fette di ~1 mm in una capsula di Petri già riempita con 3 ml di RPMI contenente antibiotici (streptomicina (100 U/mL)/penicillina (100 U/mL), fungizone (250 mg/mL), L-glutammina (2 mM)), e integrata con il 10% di siero fetale bovino (FBS) (vedi Tabella dei materiali).
2. Trasferire le fette in un setaccio (vedi Tabella dei materiali), precedentemente attaccato a una provetta di polistirene da 50 mL.
3. Usa lo stantuffo di una siringa come un pestello per schiacciare i tessuti sul setaccio.
4. Sciacquare il setaccio con il terreno RPMI (3 mL).
5. Centrifugare l'eluato di sospensione cellulare a 450 x g per 5 minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante con cautela mediante riflusso.

3. Rimozione di eritrociti tramite shock osmotico

1. Aggiungere 1 mL di tampone ACK (vedere la Tabella dei materiali), mescolare bene, incubare per 3 minuti a temperatura ambiente e agitare delicatamente ruotando la mano.
2. Diluire aggiungendo 9 mL di RPMI e mescolare bene utilizzando l'aspirazione e il riflusso.
3. Centrifugare a 450 x g per 5 min a temperatura ambiente.
4. Scartare il surnatante per aspirazione e riflusso e risospendere il pellet in 5 mL di terreno RPMI.
5. Miscelare delicatamente (aspirazione/riflusso) ed eventualmente rimuovere eventuali detriti lipidici mediante pipettaggio o utilizzando un setaccio.

4. Regolazione della concentrazione di splenociti isolati

1. Riempire una microprovetta da 1,5 mL contenente 900 μL di RPMI.
2. Utilizzando una micropipetta, prelevare 100 μl di sospensione cellulare, aggiungerla alla microprovetta da 1,5 mL contenente 900 μl di terreno RPMI e mescolare bene.
3. Trasferire 10 μl di cellule diluite in una microprovetta, aggiungere 10 μl di colorante di esclusione blu di tripano e mescolare bene.
4. Introdurre 10 μl della soluzione (passaggio 3.3) nel vetrino di conteggio del contatore automatico di celle (vedere Tabella dei materiali) e determinare il conteggio delle cellule.
   NOTA: Il software del dispositivo fornisce due valori: il numero totale di celle e il numero e la percentuale di celle viventi.
5. Regolare la concentrazione di cellule viventi a 3 o 5 x 10⁶ cellule/mL (V_max = 20 mL; la capacità totale massima è 100 x 10⁶ cellule/mL).
6. Seminare le cellule in un matraccio da 75 ml contenente RPMI.
7. Incubare il matraccio verticalmente in un'incubatrice umidificata a 37 °C per 24 ore.
   ATTENZIONE: Il blu di tripano è un agente mutageno e cancerogeno ^35,36. Assicurati di indossare i guanti durante il conteggio, anche al di fuori del cappuccio. Gettare immediatamente i puntali e i liquidi nei contenitori e lavare la superficie del banco.
   NOTA: Se le cellule raccolte sono inferiori a 50 x 10⁶, utilizzare un pallone di coltura da 25 ml. Il numero di celle non dovrebbe variare molto da un individuo all'altro. La percentuale di cellule viventi è generalmente superiore all'80% in questa fase.

5. Isolamento delle microvescicole degli splenociti

1. Dopo 24 ore, versare il contenuto del pallone in una provetta da 50 ml di polipropilene o polistirene.
2. Centrifugare a 450 x g per 15 minuti a temperatura ambiente per rimuovere cellule e detriti.
3. Dopo la centrifugazione, conservare 100 μL del 1° surnatante (SN1) per un'eventuale misurazione della concentrazione MV iniziale per calcolare la resa di isolamento. Notare il volume SN1.
4. Centrifugare l'SN1 a 450 x g per 15 minuti a temperatura ambiente.
5. Scartare il pellet e centrifugare nuovamente a 450 x g per 15 minuti a temperatura ambiente. Prelevare rapidamente e raccogliere SN2 (notare il volume).
6. Trasferire SN2 in microprovette da 1,8 mL con fondo conico. Conservare 100 μl di SN2 per un'eventuale misurazione della concentrazione iniziale di MV per calcolare la resa di isolamento nel caso in cui una quantità eccessiva di detriti comprometta la misurazione di MV in SN1.
7. Aggiungere 5 mL di terreno RPMI al pellet (cellule) e contare gli splenociti.
   NOTA: La sospensione cellulare può anche essere fissata per la caratterizzazione della citometria a flusso in paraformaldeide allo 0,1% (concentrazione finale)³⁷.
8. Centrifugare SN2 a 14.000 x g per 1 ora a 4 °C ed eventualmente refrigerare il rotore in anticipo facendo funzionare il rotore vuoto a 4 °C. Questo passaggio genera SN3.
9. Prelevare immediatamente SN3 da ciascuna microprovetta capovolgendola su una singola provetta sterile da 50 mL (sotto il cofano). Notare il volume SN3.
10. Miscelare delicatamente SN3 utilizzando una pipetta sotto il cofano. Conservare le aliquote per eventuali misurazioni nelle sospensioni.
    NOTA: La soluzione è ora impoverita di MV ma contiene i mediatori solubili e gli esosomi.
11. Raschiare ogni microprovetta (chiusa) su una rastrelliera a spillo per favorire meccanicamente la risospensione delle MV nel pellet.
12. Aggiungere 200 μl di soluzione salina bilanciata di Hank senza Ca²⁺ e Mg²⁺ (HBSS) nella prima microprovetta (vedere la tabella dei materiali).
13. Risospendere il pellet MV della prima provetta con delicati cicli di aspirazione/riflusso (~10 volte) utilizzando una micropipetta da 1 mL. Fare molta attenzione per evitare la formazione di schiuma in quanto ciò favorirà l'ossidazione delle vescicole e di altre parti nella sospensione.
14. Raccogliere i primi 200 μl di MV risospesi e versarli nella seconda provetta sopra il pellet. Mescolate delicatamente come sopra, quindi versate nuovamente nel terzo tubo e mescolate delicatamente. La sospensione diventa sempre più torbida da un tubo all'altro. Chiudere il terzo tubo.
15. Iniziare la raccolta delle tre microprovette successive come sopra (passaggio 4.14).
16. Raccogliere tutte le MV risospese in una singola (o due) microprovette collettrici (2 mL con fondo conico). Mantenere 50 μl per l'eventuale calcolo della resa di questo passaggio. Notare il volume delle sospensioni.
17. Centrifugare la provetta del collettore a 14.000 x g per 1 ora a 4 °C. Questo passaggio genera SN4.
18. Eliminare immediatamente l'SN4 (versare su una provetta di raccolta del surnatante). Conservare un'aliquota di SN4 per calcolare la resa della fase di purificazione e risospendere delicatamente il pellet in 500 μL di HBBS (senza Ca²⁺ e Mg²⁺). Conservare un'aliquota di 50 μl del pellet risospeso per calcolare la resa di purificazione e annotarne il volume.
19. Conservare il pellet risospeso a 4 °C per un massimo di un mese per saggi funzionali in condizioni sterili o a -20 °C per saggi strutturali.
20. Calcolare la resa di purificazione (vedere la NOTA di seguito) di ogni fase o dell'intera procedura misurando la concentrazione di MV nei surnatanti e/o nelle sospensioni di pellet.
    NOTA: Resa di purificazione (%): ([MV1] x volume SN1) / ([MV4] x volume finale della sospensione) x 100.
    Questa resa deve essere razionalizzata al numero di splenociti isolati dal pallone di coltura e contati nella fase 4.4. La resa di purificazione del presente esperimento è di ~70% a partire da 111 x 10,⁶ cellule e 60 ml di surnatante.
    1. Valutare la perdita di SMV causata dalla procedura misurando gli SMV rimanenti nei surnatanti impoveriti di SMV e contenenti principalmente esosomi (SN2 e SN4).
    2. Misurare la concentrazione di MV mediante TRPS o il test della protrombinasi³⁸ per un'elevata sensibilità e specificità.
       ATTENZIONE: Raccogliere i MV dopo la centrifugazione mediante il rapido versamento capovolto del surnatante. L'attesa o l'utilizzo di microtubi a forma di U provocherà la perdita di MV sulla parete del microtubo. Non utilizzare mai una micropipetta per scartare il surnatante; Il pellet può invece essere aspirato. Non ritardare mai il processo dopo l'arresto della centrifuga. La centrifugazione a velocità eccessiva provocherà la contaminazione del pellet MV da parte degli esosomi.
       NOTA: Le velocità e la durata della centrifugazione sono ottimizzate per un arricchimento MV con una contaminazione minima da parte degli esosomi. Questo protocollo non è affidabile per studiare le MV dei monociti/macrofagi della milza perché queste cellule possono fagocitare e ricatturare rapidamente le proprie MV³⁹. Il protocollo non può essere messo in pausa e riavviato in un secondo momento a causa della perdita di cellule dovuta alla vitalità cellulare.

Results

I dati forniti forniscono una rappresentazione completa dell'intera procedura, utilizzando due principali condizioni animali: giovani topi C57BL/6 di controllo non trattati e i loro compagni di cucciolata sottoposti a sei iniezioni intraperitoneali (IP) di PG ogni 2 giorni, per 2 settimane. Mostrano anche l'azione remota di un'iniezione intraperitoneale di PG sulla risposta della milza dopo 2 settimane. Le microvescicole degli splenociti sono state quantificate mediante saggio enzimatico della protrombinasi o misurando l...

Discussion

Il presente studio conferma che la milza è una fonte importante e affidabile di MV con rilevanza fisiopatologica rispetto ad altre fonti come il sangue, di volume limitato nei topi. A condizione che vengano prese precauzioni, il metodo è facile da configurare e non richiede attrezzature costose. Poiché non è disponibile un metodo alternativo diverso dalla valutazione in vivo , l'attuale modello sembra essere un metodo prezioso per studiare l'impatto dei pro-farmaci sulla diffusi...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Provette da 2 mL tipo Eppendorf	Dutscher	54816	Sté riel microprovette
Allegra 64 R Centrifuga	Beckman Coulter
Contatore cellulare automatico	Biorad
Albumina sierica bovina	Euromedex	04-100-812-E	Preparato, filtrato con 0,22 &; m setaccio e conservato a 4 ° C in condizioni sterili utilizzando le seguenti formule: 2 mM EDTA, 0,5% BSA e PBS sterile
CD11 (Mac-1)	e-Biosciences	45-00112-80	Coniugato a eFluor 450; λ Eccitazione max 405 nm λ max emissione 445 nm
CD16/32	BD Biosciences	553142	EDTA non coniugato
	Calbiochem	Calbiochem S	6381-92-6
Tubo di falco	Cell star 227261		50 mL
Siero fetale bovino	Dutscher	S1810-500	Numero di lotto =
S14028S1810 Fortessa Aria	BD Biosciences		per smistamento cellulare
citometro a flusso Fortessa	Becton-Dickinson.
Fungizone	PAN biotech	P06-01050
HBSS	Gibco	14175-053	Senza rosso fenolo, senza Ca+2 e Mg+2
ICAM-1	abcam	ab171123
LYG-6 (Gr-1)	BD Biosciences	566218	Coniugato a BUV395; λ max eccitazione 348 nm, λ emissione max 395 nm
Eritrociti tampone di lisi (ACK)	Sigma		Preparato, filtrato con 0,22 &; m setaccio e conservato a 4 gradi C in condizioni sterili utilizzando le seguenti formule: NH4Cl, 0,15 M (molarità), 53,491 (mw) 4 g KHCO3 1 mM (molarità) 100,115 (mw), 50 mg EDTA  0,1 mM (molarità), 292,24 (mw), 14,6 g pH: 7,2– 7.4
Spettrofotometro NanoDrop 1000	Thermoscientific
PBS	Lonza	17-516F	Senza Ca+2  e Mg+2
		Petri in plastica	100 mm
Tubo in polistirene	Falcon	352070
q-Nano Gold	iZON science
Terreno di coltura RPMI 1640: 2 g/L di glucosio	PAN biotech	p04-18047	Integrato conIntegrato con streptomicina (100 U/mL) /Penicillina (100 U/mL), Fungizone (250 mg/mL), L-glutammina (2 mM) e FBS 10%.
Setaccio per bisturi
Nylon	Falcon USA	352360	100 µ m
Streptomicina/Penicillina	PAN biotech	P06-07100
Siringa			2 mL
Trypan Blue	Biorad	1450013
VCAM1	abcam	ab215380