Colture primarie di astrociti e microglia di ratto e loro utilizzo nello studio della sclerosi laterale amiotrofica

Katarina Milićević; Andrej Korenić; Milena Milošević; Pavle R. Andjus

doi:10.3791/63483

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Articolo metodologico

Colture primarie di astrociti e microglia di ratto e loro utilizzo nello studio della sclerosi laterale amiotrofica

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DOI:

10.3791/63483

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23 giugno 2022

Katarina Milićević¹ , Andrej Korenić¹ , Milena Milošević¹ , Pavle R. Andjus¹

¹Center for Laser Microscopy, Institute for Physiology and Biochemistry “Jean Giaja”, University of Belgrade Faculty of Biology

In questo articolo

Sommario

Presentiamo qui un protocollo su come preparare colture primarie di cellule gliali, astrociti e microglia da cortecce di ratto per l'imaging video time-lapse di Ca²⁺ intracellulare per la ricerca sulla fisiopatologia della sclerosi laterale amiotrofica nel modello di ratto hSOD1^G93A .

Abstract

Questo protocollo dimostra come preparare colture primarie di cellule gliali, astrociti e microglia dalle cortecce dei ratti Sprague Dawley e come utilizzare queste cellule allo scopo di studiare la fisiopatologia della sclerosi laterale amiotrofica (SLA) nel modello di ratto hSOD1^G93A . In primo luogo, il protocollo mostra come isolare e coltivare astrociti e microglia da cortecce postnatali di ratto, e quindi come caratterizzare e testare queste colture per la purezza mediante immunocitochimica utilizzando il marcatore glial fibrillary acidic protein (GFAP) degli astrociti e il marcatore microgliale ionizzato della molecola adattatore legante il calcio 1 (Iba1). Nella fase successiva, vengono descritti i metodi per il caricamento del colorante (Fluo 4-AM sensibile al calcio) delle cellule coltivate e le registrazioni dei cambiamenti di Ca²⁺ negli esperimenti di imaging video su cellule vive.

Gli esempi di registrazioni video consistono in: (1) casi di imaging Ca²⁺ di astrociti in coltura acutamente esposti all'immunoglobulina G (IgG) isolata da pazienti affetti da SLA, che mostrano una risposta caratteristica e specifica rispetto alla risposta all'ATP come dimostrato nello stesso esperimento. Gli esempi mostrano anche un aumento transitorio più pronunciato della concentrazione intracellulare di calcio evocato da ALS IgG negli astrociti hSOD1^G93A rispetto ai controlli non transgenici; (2) Imaging Ca 2+ di astrociti in coltura durante un esaurimento delle riserve di calcio da parte di thapsigargin (Thg), un inibitore non competitivo del reticolo endoplasmatico Ca 2+ ATPasi, seguito da ingresso di calcio operato dal magazzino indotto dall'aggiunta di calcio nella soluzione di registrazione, che dimostra la differenza tra il funzionamento del magazzino Ca ²⁺ in hSOD1^G93A e negli astrociti non transgenici; (3) L'imaging Ca 2+ della microglia in coltura mostra prevalentemente una mancanza di risposta alle IgG di SLA, mentre l'applicazione di ATP ha provocato un cambiamento di Ca²⁺. Questo documento sottolinea anche possibili avvertimenti e precauzioni riguardanti la densità cellulare critica e la purezza delle colture, scegliendo la corretta concentrazione del colorante Ca²⁺ e le tecniche di caricamento del colorante.

Introduzione

Le tecniche di coltura cellulare hanno dato origine a numerosi progressi in diversi campi della neurofisiologia cellulare in salute e malattia. In particolare, le colture cellulari primarie, appena isolate dal tessuto neuronale di un animale da laboratorio, consentono allo sperimentatore di studiare da vicino il comportamento di diverse cellule in diversi mezzi biochimici e configurazioni fisiologiche. L'utilizzo di diversi indicatori fisiologici fluorescenti come i coloranti sensibili al Ca²⁺ in combinazione con la microscopia video time-lapse fornisce una migliore comprensione dei processi biofisici e biochimici cellulari in tempo reale.