È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Colture primarie di astrociti e microglia di ratto e loro utilizzo nello studio della sclerosi laterale amiotrofica

3.8K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/63483

⸱

23 giugno 2022

 ,  ,  , 
1Center for Laser Microscopy, Institute for Physiology and Biochemistry “Jean Giaja”, University of Belgrade Faculty of Biology

In questo articolo

Sommario

Presentiamo qui un protocollo su come preparare colture primarie di cellule gliali, astrociti e microglia da cortecce di ratto per l'imaging video time-lapse di Ca2+ intracellulare per la ricerca sulla fisiopatologia della sclerosi laterale amiotrofica nel modello di ratto hSOD1G93A .

Abstract

Questo protocollo dimostra come preparare colture primarie di cellule gliali, astrociti e microglia dalle cortecce dei ratti Sprague Dawley e come utilizzare queste cellule allo scopo di studiare la fisiopatologia della sclerosi laterale amiotrofica (SLA) nel modello di ratto hSOD1G93A . In primo luogo, il protocollo mostra come isolare e coltivare astrociti e microglia da cortecce postnatali di ratto, e quindi come caratterizzare e testare queste colture per la purezza mediante immunocitochimica utilizzando il marcatore glial fibrillary acidic protein (GFAP) degli astrociti e il marcatore microgliale ionizzato della molecola adattatore legante il calcio 1 (Iba1). Nella fase successiva, vengono descritti i metodi per il caricamento del colorante (Fluo 4-AM sensibile al calcio) delle cellule coltivate e le registrazioni dei cambiamenti di Ca2+ negli esperimenti di imaging video su cellule vive.

Gli esempi di registrazioni video consistono in: (1) casi di imaging Ca2+ di astrociti in coltura acutamente esposti all'immunoglobulina G (IgG) isolata da pazienti affetti da SLA, che mostrano una risposta caratteristica e specifica rispetto alla risposta all'ATP come dimostrato nello stesso esperimento. Gli esempi mostrano anche un aumento transitorio più pronunciato della concentrazione intracellulare di calcio evocato da ALS IgG negli astrociti hSOD1G93A rispetto ai controlli non transgenici; (2) Imaging Ca 2+ di astrociti in coltura durante un esaurimento delle riserve di calcio da parte di thapsigargin (Thg), un inibitore non competitivo del reticolo endoplasmatico Ca 2+ ATPasi, seguito da ingresso di calcio operato dal magazzino indotto dall'aggiunta di calcio nella soluzione di registrazione, che dimostra la differenza tra il funzionamento del magazzino Ca 2+ in hSOD1G93A e negli astrociti non transgenici; (3) L'imaging Ca 2+ della microglia in coltura mostra prevalentemente una mancanza di risposta alle IgG di SLA, mentre l'applicazione di ATP ha provocato un cambiamento di Ca2+. Questo documento sottolinea anche possibili avvertimenti e precauzioni riguardanti la densità cellulare critica e la purezza delle colture, scegliendo la corretta concentrazione del colorante Ca2+ e le tecniche di caricamento del colorante.

Introduzione

Le tecniche di coltura cellulare hanno dato origine a numerosi progressi in diversi campi della neurofisiologia cellulare in salute e malattia. In particolare, le colture cellulari primarie, appena isolate dal tessuto neuronale di un animale da laboratorio, consentono allo sperimentatore di studiare da vicino il comportamento di diverse cellule in diversi mezzi biochimici e configurazioni fisiologiche. L'utilizzo di diversi indicatori fisiologici fluorescenti come i coloranti sensibili al Ca2+ in combinazione con la microscopia video time-lapse fornisce una migliore comprensione dei processi biofisici e biochimici cellulari in tempo reale.

La SLA è una malattia neurodegenerativa devastante che colpisce i motoneuroni superiori e inferiori1. La malattia presenta una patogenesi complessa di tipo familiare ma soprattutto della forma sporadica (90% dei casi)2. È noto che i meccanismi autonomi non cellulari contribuiscono alla fisiopatologia della SLA, principalmente a causa del ruolo essenziale delle cellule gliali3. La SLA è anche ben caratterizzata come una malattia neuroinfiammatoria con coinvolgimento di fattori umorali e cellulari di infiammazione.

L'immunoglobulina G è ampiamente usata come marcatore molecolare nella SLA e in altre malattie neurodegenerative. Studiare il livello sierico di questo marcatore può indicare la presenza e lo stadio della neuroinfiammazione nella malattia 4,5,6, mentre la sua presenza nel liquido cerebrospinale può indicare una rottura della barriera ematoencefalica7. Le IgG sono state anche identificate come depositi nei motoneuroni del midollo spinale dei pazienti con SLA7. Tuttavia, questo approccio ha mostrato alcune incongruenze nella correlazione del livello di IgG con lo stadio e le caratteristiche della malattia6.

Le IgG isolate dai sieri dei pazienti affetti da SLA (SLA IgG) possono indurre una risposta al calcio negli astrociti naïve8 e il rilascio di glutammato nei neuroni, indicando un effetto eccitotossico, un segno distintivo della patologia della SLA9. Tuttavia, gli studi sul modello di ratto hSOD1G93A ALS (contenente copie multiple della mutazione umana SOD110) hanno mostrato un numero di marcatori di stress ossidativo in cellule neurogliali in coltura11, tessuti 12,13,14 o animali vivi 13. È interessante notare che gli astrociti coltivati dal modello di ratto SLA erano più inclini allo stress ossidativo indotto dal perossido rispetto agli astroglia dei compagni di cucciolata non transgenici11.

Le cellule microgliali in coltura sono influenzate dalla SLA IgG in modo meno evidente. Vale a dire, una linea cellulare microgliale BV-2 ha mostrato un aumento del segnale dai marcatori fluorescenti dello stress ossidativo in risposta all'applicazione di soli 4/11 campioni di pazienti IgG ALS15. È noto che le microglia partecipano a molte patologie neuroinfiammatorie, aggiungendo stress ossidativo e fase di progressione tardiva nel meccanismo autonomo non cellulare della SLA16,17. Tuttavia, i dati con le IgG della SLA hanno indicato che queste cellule potrebbero non essere reattive come gli astrociti a questi fattori umorali dell'infiammazione della SLA. Diversi studi sono stati condotti con astrociti primari da modelli murini di SLA, non solo nei cuccioli ma anche in animali sintomatici, sia sul cervello che sul midollo spinale 18,19,20,21. Questo vale anche per le colture primarie microgliali, anche se in misura minore rispetto agli astrociti e per lo più dalle regioni del cervello allo stadio embrionale22,23,24.

Usiamo l'imaging video time-lapse di Ca2+ su cellule in coltura principalmente come mezzo per seguire i transitori intracellulari di questo ione come marker fisiologico di eccitotossicità. Pertanto, mediante la caratterizzazione biofisica di questi transitori (ampiezza, area sotto transitoria, tempo di salita, frequenza) il ricercatore può ottenere parametri diagnostici sperimentali da diversi modelli cellulari di neurodegenerazione. Questa tecnica offre quindi il vantaggio di una valutazione fisiologica quantitativa delle IgG come biomarcatori della malattia. Esiste un ampio corpus di letteratura sul ruolo delle IgG e del Ca2+ nell'induzione della SLA. La maggior parte di questi studi sono stati condotti inducendo la SLA iniettando IgG del paziente in animali da esperimento 25,26,27,28,29, che hanno poi mostrato elevazione intracellulare di Ca 2+ e deposizioni di IgG. Una linea di studi ha esplorato l'effetto delle IgG di SLA sulla sinapsi motoria in vitro30,31,32. Nel contesto di cui sopra, la tecnica qui presentata pone l'attenzione sulle cellule gliali come attori importanti nel meccanismo autonomo non cellulare della SLA e quantifica la loro potenziale risposta eccitotossica alle IgG come fattori umorali della neuroinfiammazione. Questo approccio può avere un'applicazione più ampia nel testare altri fattori umorali come sieri interi, liquori o citochine in diversi sistemi di coltura cellulare e in modelli cellulari di infiammazione generale.

Questo articolo descrive come preparare colture primarie di cellule gliali, astrociti e microglia dalle cortecce dei ratti Sprague Dawley e come utilizzare ulteriormente queste cellule per studiare la fisiopatologia della SLA con IgG derivate dai sieri dei pazienti. I protocolli sono dettagliati per il caricamento del colorante delle cellule in coltura (Figura 1) e le registrazioni dei cambiamenti di Ca2+ negli esperimenti di imaging video time-lapse. Esempi di registrazioni video mostreranno come le cellule gliali reagiscono alle IgG della SLA rispetto all'ATP, quest'ultimo attivando i recettori purinergici della membrana. Viene mostrato per la prima volta un esempio di come gli astrociti isolati dal cervello del ratto hSOD1G93A ALS reagiscono con una risposta Ca 2+ più pronunciata alle IgG di SLA rispetto ai controlli non transgenici e come correlare questo processo alle differenze nel funzionamento del negozio Ca2+. Viene anche mostrato un esempio di imaging del calcio nelle cellule microgliali acutamente sfidate con SLA IgG, con solo una modesta risposta di calcio intracellulare.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le direttive UE sulla protezione degli animali per scopi scientifici e con il permesso della Commissione etica della Facoltà di Biologia, Università di Belgrado (numero di approvazione EK-BF-2016/08). Per quanto riguarda il materiale del paziente (sieri per IgG), è stato raccolto per l'esame clinico di routine con il consenso informato del paziente in conformità con il Codice etico dell'Associazione medica mondiale (Dichiarazione di Helsinki) per gli esperimenti che coinvolgono esseri umani. Il protocollo è stato approvato dal comitato etico del Centro clinico della Serbia (n. 850/6).

1. Preparazione della coltura cellulare primaria

  1. Isolamento del tessuto cerebrale
    NOTA: l'isolamento deve essere eseguito su ghiaccio, utilizzando soluzioni ghiacciate.
    1. Utilizzare cuccioli appena nati di 1-3 giorni per la coltura cellulare neonatale primaria33.
      NOTA: Per lo studio qui presentato, sono stati utilizzati Sprague Dawley hSOD1G93A e ratti non transgenici. Per la genotipizzazione, le code di ratto sono state utilizzate per la successiva estrazione del DNA e la PCR.
    2. Cospargere la testa del cucciolo con etanolo al 70% e decapitarlo immediatamente velocemente usando le forbici.
    3. Tagliare la pelle usando forbici ad angolo piccolo per esporre il cranio. Apri il cranio facendo un taglio dal forame magno verso le orbite . Quindi, esegui un taglio perpendicolare della linea mediana. Rimuovere il cervello dal cranio e metterlo in una capsula di Petri contenente soluzione salina tamponata fosfato (PBS).
      NOTA: Pulire gli strumenti tra i cuccioli per evitare la contaminazione incrociata tra cuccioli transgenici e non transgenici. L'isolamento delle cortecce dal resto del cervello dovrebbe essere fatto sotto uno stereomicroscopio.
    4. Usando la punta della pinza, strappare le connessioni tra i due emisferi. Quindi, separare gli emisferi con una pinza curva spingendo delicatamente un emisfero dal centro verso il lato.
    5. Rimuovere le meningi strappandole con cura con una pinza dritta e curva.
    6. Rimuovere l'ippocampo pizzicandolo con una pinza curva. Scartare l'ippocampo o usarlo per un'altra preparazione di coltura cellulare.
      NOTA: Ulteriori passaggi devono essere eseguiti sotto la cappa a flusso laminare per garantire condizioni sterili.
  2. Omogeneizzazione e dissociazione dei tessuti
    1. Trasferire una corteccia in un tubo da 15 mL riempito con 3 mL di PBS freddo. Pipet la sospensione su e giù con una punta da 1 ml, completando 10-15 colpi fino a quando la sospensione diventa omogenea.
      NOTA: Prestare molta attenzione a non produrre bolle in questo processo.
    2. Centrifugare a 500 × g per 5 min. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 3 ml di PBS freddo pipettandolo su e giù con una punta da 1 ml. Ripetere la fase di centrifugazione.
      NOTA: Tutte le soluzioni utilizzate da questo punto devono essere preriscaldate a 37 °C.
    3. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 2 ml di DMEM (Modified Eagle Medium) completo di Dulbecco integrato con siero bovino fetale (FBS) al 10% e antibiotici (penicillina e streptomicina). Trasferire l'omogenato in una provetta da 2 ml.
    4. Passare l'omogenato attraverso aghi da 21 G e 23 G (tre volte ciascuno) per fare una sospensione di singole cellule.
      NOTA: Prestare molta attenzione a non produrre bolle in questo processo.
  3. Versare la sospensione cellulare preparata da una corteccia in una capsula di Petri di 60 mm di diametro o in un matraccio T25 (con la superficie pretrattata con un rivestimento polipeptidico per la crescita di cellule aderenti) contenente 3 ml di DMEM completo. Agitare leggermente la capsula di Petri in modo che la sospensione sia uniformemente distribuita.
  4. Far crescere le cellule nell'incubatore in atmosfera umidificata al 5% di CO2/95% di aria a 37 °C.
  5. Cambiare il mezzo 48 ore dopo l'isolamento e sostituire il mezzo ogni 3 giorni.
  6. Per promuovere la crescita degli astrociti, quando le cellule raggiungono il 70% -80% di confluenza, lavarle con PBS preriscaldato per rimuovere le cellule gliali debolmente attaccate e le tracce di FBS nel mezzo.
    1. Tripsinizzare lo strato sottostante di astrociti aggiungendo 1 ml di soluzione di tripsina preriscaldata (0,25% tripsina, 0,02% EDTA in PBS, filtrata sterile).
    2. Posizionare il piatto nell'incubatrice a 37 °C per 2-5 min.
    3. Controlla le cellule al microscopio. Quando iniziano a staccarsi, aggiungere 4 ml di DMEM completo.
    4. Raccogliere la sospensione cellulare e trasferirla in un tubo da 15 ml. Centrifugare a 500 × g per 5 min.
    5. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di terreno completo. Contare le cellule usando un emocitometro.
    6. Riplaccare le celle ad una densità di 104 cellule/cm2 in 5 ml di DMEM completo fresco.
  7. Cambia il mezzo ogni 3 giorni. Per ridurre al minimo la presenza di altri tipi di cellule gliali, dopo che gli astrociti hanno raggiunto il 50% di confluenza e prima di ogni sostituzione del mezzo, lavare le cellule con DMEM completo.
    1. Aspirare il mezzo surnatante con una pipetta da 1 mL e erogarlo delicatamente sullo strato di cellule più volte. Assicurarsi che l'intera superficie dello strato cellulare sia coperta durante questa fase di lavaggio.
  8. Una volta che le cellule raggiungono l'80% di confluenza (di solito dopo 14 giorni), ripetere la tripsinizzazione e la raccolta di astrociti come descritto al punto 1.6.
  9. Seme 5 × 103 di astrociti su un coprislip circolare di vetro di 7 mm rivestito con poli-L-lisina (50 μg/ml). Usali in esperimenti dopo 48 ore.
  10. Per promuovere la microglia, dopo il passaggio 1.7, consentire alle cellule gliali di raggiungere uno strato confluente34. Quando le cellule microgliali appaiono sopra lo strato di astrociti (dopo 10-15 giorni, riconosciute dai loro corpi più piccoli e più ovali e dai processi più brevi), agitare la capsula di Petri su uno shaker orbitale per 2 ore a 220 giri / min.
  11. Disperdere e seminare cellule microgliali
    1. Lavare leggermente le cellule staccate e attaccate liberamente aspirando il mezzo surnatante con una punta di pipetta da 1 mL e erogarlo delicatamente sullo strato di cellule più volte. Assicurarsi di coprire l'intera superficie dello strato cellulare durante questa fase di lavaggio, raccogliere il mezzo con le celle staccate e trasferirlo in un tubo da 15 ml.
    2. Centrifugare a 500 × g per 5 min. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 1 ml di terreno.
    3. Far passare la sospensione cellulare attraverso un ago da 21 G per ottenere una sospensione a cellula singola.
      NOTA: La maggior parte dei metodi pubblicati utilizza tripsina o papaina per dissociare il tessuto; tuttavia, gli aghi 21 G hanno il vantaggio di prevenire la sovradigestione delle cellule, consentendo una dissociazione più delicata.
    4. Contare le cellule usando un emocitometro. Seme 5 × 103 cellule microgliali su un coprislip circolare di vetro di 7 mm rivestito con poli-L-lisina (50 μg/ml). Usali in esperimenti dopo 48 ore.
      NOTA: È difficile ottenere una coltura microgliale pura agitando, poiché le cellule precursori degli oligodendrociti e gli astrociti possono essere ancora presenti in numero variabile a seconda dell'esperienza dello sperimentatore. Il protocollo immunocitochimico utilizzato per stimare la presenza di diverse popolazioni cellulari in colture gliali è stato descritto altrove35.

2. Immunocitochimica

  1. Risciacquare le celle placcate su coprivetrini in PBS, 2 x 1 min.
  2. Fissare le cellule in paraformaldeide al 4% per 20 minuti a temperatura ambiente (RT).
  3. Lavare in PBS 3 x 5 min.
  4. Incubare in una soluzione bloccante contenente il 10% di siero normale d'asina (NDS)/l'1% di albumina sierica bovina (BSA)/lo 0,1% di Triton X-100 per 45 minuti a RT.
    1. Aggiungere 50 μL di una soluzione bloccante per coprislip di 10 mm di diametro.
  5. Preparare anticorpi primari in 1% NDS/1% BSA/0,1% TritonX-100 nelle seguenti diluizioni: mouse anti-GFAP 1:300, capra anti-Iba1 1:500. Incubare le cellule con anticorpi primari durante la notte a +4 °C.
  6. Risciacquare in PBS, 3 x 10 min.
  7. Incubare con gli anticorpi secondari coniugati con un fluoroforo: asino anti-topo (eccitazione 488 nm [1:200)) o asino anti-capra (eccitato a 647 nm [1:200)). Incubare le cellule per 2 ore a RT al buio.
  8. Lavare in PBS, 7 x 5 min.
  9. Incubare le cellule con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, 1:4.000) per 10 minuti a RT.
  10. Lavare in PBS 5 x 5 min.
  11. Montare i vetrini sui vetrini del microscopio utilizzando una soluzione di montaggio; Usane una goccia per ogni foglietto.
    NOTA: le diluizioni degli anticorpi possono variare a seconda del produttore. Gli utenti devono determinare le diluizioni ottimali per i loro esperimenti.

3. Imaging video time-lapse

NOTA: Le soluzioni contenenti il colorante fluorescente devono essere protette dalla luce diretta. Prima di iniziare l'esperimento di imaging, assicurarsi che il vetrino di copertura non si muova quando si attiva la perfusione.

  1. Preparazione di soluzioni e celle
    1. Preparare la soluzione extracellulare (ECS) per l'imaging: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCal 2, 2 mM MgCl2, 10 mM D-glucosio e 10 mM HEPES. Regolare il pH a 7,4. Assicurarsi che l'osmolarità sia 280-300 mOsm/kg e preparare ECS senza Ca2+: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 10 mM D-glucosio, 10 mM HEPES e 0,1 mM EGTA.
    2. Preparare le soluzioni di prova: 100 μM di ATP disciolto in ECS, 1 μM Thg in ECS senza Ca2+ e 0,1 mg/mL di ALS IgG in ECS8.
    3. Trasferire un foglietto su un piatto con ECS per lavare il DMEM completo. Preparare la soluzione di caricamento del colorante diluendo 1 mM di soluzione madre di Fluo-4 AM con ECS fino alla concentrazione finale di 5 μM Fluo-4 AM.
      1. Posizionare il coprislip con le celle nella soluzione di caricamento del colorante per 30 minuti a RT al buio. Lavare le celle in ECS per 20 minuti.
    4. Se le celle non sono adeguatamente caricate (cioè se il livello basale di fluorescenza è troppo basso, <5% della gamma dinamica della telecamera con tempo di esposizione superiore a 400 ms), aumentare il tempo di caricamento fino a 45 minuti a 1 ora a 37 °C. In alternativa, miscelare la soluzione madre di Fluo-4 AM con un volume uguale di detergente al 20% (p/v) (Pluronico) in DMSO prima di diluire in ECS, ottenendo la concentrazione Pluronica finale ~0,02%.
      NOTA: Gli esempi sperimentali di questo studio sono stati eseguiti con IgG umane isolate da sieri sanguigni di pazienti affetti da SLA come descritto in precedenza 4,5,11. Ogni esperimento è stato eseguito con campioni di IgG di un singolo paziente.
  2. Immagini video
    NOTA: In questo protocollo, il sistema di imaging video è stato combinato con una lampada ad arco corto allo xeno, un sistema policromatore e un microscopio a epifluorescenza invertita dotato di acqua, glicerina e obiettivo ad immersione in olio. L'imaging timelapse è stato eseguito utilizzando un sistema di fotocamere digitali.
    1. Accendere i componenti della configurazione di imaging 15 minuti prima dell'esperimento per consentire al sistema di raggiungere la temperatura di lavoro.
    2. Introdurre il coprislip nella camera di registrazione con 1 mL di soluzione di lavoro (ECS o ECS senza Ca2+).
    3. Per scegliere il protocollo di imaging corretto, aprire il software di imaging e nel pannello Acquisizione, scegliere le coppie di filtri per Fluo4-AM con una lunghezza d'onda di eccitazione a 480 nm, uno specchio dicroico a 505 nm e una lunghezza d'onda di emissione a 535 nm.
    4. Scegli il campo visivo avendo cura di avere un numero consistente di celle durante tutto l'esperimento. Regolare il tempo di esposizione e il guadagno del rilevatore in modo appropriato, in modo tale che il segnale non sia saturo. Scegliere la modalità pseudocolore per l'acquisizione. Per istruzioni più dettagliate, fare riferimento al manuale fornito dal produttore.
    5. Regolare la frequenza di campionamento su 1 Hz (1 fotogramma al secondo).
    6. Iniziare l'imaging acquisendo il livello basale di fluorescenza per 3-5 minuti per la determinazione basale (F0). Garantire un flusso costante della soluzione di lavoro.
    7. Arrestare il flusso della soluzione di lavoro e passare alla soluzione di prova per il periodo di tempo desiderato (vedere anche le barre temporali negli esempi della Figura 2 e della Figura 3). Tra una soluzione di prova e l'altra, lavare le celle con un flusso costante della soluzione di lavoro per 3-5 minuti.
    8. Mantenere il volume della soluzione nella camera di registrazione a ~1 mL organizzando un'aspirazione costante dalla parte superiore della soluzione (vedere Figura 2E).
      NOTA: Per applicare il trattamento direttamente alle celle riprese, è stato posizionato un sistema di erogazione personalizzato costituito da una pipetta di vetro (diametro interno 0,8 mm) a ~350 μm di distanza e ~1 mm sopra le celle, con un angolo di 45° combinato con il sistema di scambio della soluzione contenente valvole a manicotto e un controller elettronico della valvola (vedere Figura 2E).

4. Analisi dei dati

  1. Definire un'area di interesse (ROI) corrispondente alla singola cella.
    1. Scegli il fotogramma con la più alta intensità di segnale (cioè dall'applicazione di ATP) e cerchia una cella utilizzando l'applicazione Polygonal Tool. Ripetere l'operazione per tutte le celle nel campo acquisito. Scegli cinque ROI in background utilizzando lo strumento Cerchio.
    2. Per misurare l'intensità media del segnale di una singola cella e lo sfondo per ogni intervallo di tempo, selezionare tutti i ROI e utilizzare il comando Multi Measure in ROI Manager in ImageJ o qualsiasi comando equivalente nel software commerciale (vedere la tabella dei materiali).
  2. Esporta i valori medi di intensità del segnale dei ROI come foglio di calcolo.
  3. Calcola la media di cinque ROI di sfondo e sottrai lo sfondo medio di ciascun fotogramma dall'intensità media del ROI del fotogramma acquisito contemporaneamente.
  4. Per normalizzare i dati ottenuti al segnale di base, utilizzare l'equazione (1):
    ΔF/F 0 = (F - F 0)/F0 (1)
    dove F è l'intensità del segnale di ogni intervallo di tempo dopo la sottrazione dello sfondo e F0 è la fluorescenza Fluo-4 di base.
    NOTA: in questo studio è stato utilizzato un codice personalizzato.
  5. Per analizzare l'attività del calcio, determinare diversi parametri4: l'ampiezza del picco del calcio (ΔF/F 0), la variazione integrata (integrale temporale, superficie sotto la registrazione della risposta) del transitorio di calcio (ΔF/F 0 × s), tempo trascorso dal momento al picco dall'inizio della stimolazione al massimo del transitorio di calcio (s), tempo di aumento trascorso dall'inizio della stimolazione al valore di ΔF/F 0 che raggiunge il 50%-80% dell'ampiezza massima (s), mezza larghezza-larghezza completa di un transitorio a metà ampiezza massima (s), frequenza delle risposte se sono ripetitive (Hz).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Caratterizzazione di diversi tipi di cellule gliali in coltura
Di solito ci vogliono 15-21 giorni per produrre astrociti per gli esperimenti, mentre le cellule microgliali impiegano 10-15 giorni per crescere. L'immunocolorazione è stata eseguita per valutare la purezza cellulare della coltura. La Figura 1 mostra l'espressione della doppia marcatura del marcatore astrocitico GFAP e del marcatore microgliale Iba1 nelle rispettive colture.

L'imagi...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Questo articolo presenta il metodo di coltura cellulare primaria come uno strumento veloce e "economico" per studiare diversi aspetti della fisiologia cellulare (pato) come la SLA nel modello di ratto hSOD1G93A . La tecnica è quindi adatta per studi a livello di singola cellula che possono essere estrapolati e ulteriormente studiati a un livello superiore di organizzazione (cioè in fette di tessuto o in un animale vivo). La coltura cellulare come tecnica, tuttavia, ha alcuni avvertimenti. È fondamentale esegui...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero dell'Istruzione, della Scienza e dello Sviluppo Tecnologico Repubblica di Serbia Contratto n. 451-03-9/2021-14/ 200178, dal progetto FENS - NENS Education and Training Cluster "Corso Trilaterale sulla Glia nella Neuroinfiammazione" e dalla sovvenzione EC H2020 MSCA RISE #778405. Ringraziamo Marija Adžić e Mina Perić per aver fornito le immagini di immunoistochimica e Danijela Bataveljić per l'aiuto nella scrittura di articoli.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provetta da 15 mLSarstedt, Germania62 554 502
Provetta da 2 mLSarstedt, Germania72.691
Ago da 21 GNipro, GiapponeHN-2138-ET
Ago da 23 GNipro, GiapponeHN-2338-ET
Siringa da 5 mLNipro, GiapponeSY3-5SC-EC
Vetrino coprioggetto circolare da 6 mmMenzel Glasser, Germania630-2113
Piastra di Petri da 60 mmThermoFisher Sientific, USA130181
ATPSigma-Aldrich, GermaniaA9062
AxioObserver A1Carl Zeiss, Germania
Albumina sierica bovinaSigma-Aldrich, GermaniaB6917
Cloruro di calcioSigma-Aldrich, Germania2110
CentrifugaEppendorf, Germania
DAPISigma-Aldrich, Germania10236276001
D-glucosioSigma-Aldrich, Germania158968
DMEMSigma-Aldrich, GermaniaD5648
Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibodyInvitrogen, USAA-21447
Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 Anticorpo IgGInvitrogen, USAA-21202
EDTASigma-Aldrich, GermaniaEDS-100G
EGTASigma-Aldrich, GermaniaE4378
" evolve"-EM 512 Sistema di fotocamere digitaliFotometria, USA
Siero fetale bovino (FBS)Gibco, ThermoFisher Scientific, USA10500064
Fiji ImageJ SoftwareOpen source ai sensi della GNU General Public License
Set di filtri FITCChroma Technology Inc., USA
Fluo-4 AMMolecular Probes, USAF14201
Capra anti-Iba1Fujifilm Wako Chemicals, USA011-27991
HEPESBiowest, FranciaP5455
Sistema di scambio di soluzioni ad alta velocitàALA Scientific Instruments, USA
IncubatoreMemmert GmbH + Co. KG, Germania
Cloruro di magnesioSigma-Aldrich, GermaniaM2393
Software MatlabMath Works, USA
Topo anti-GFAPMerck Millipore, USAMAB360
Mowiol 40-88Sigma-Aldrich, Germania324590
Siero d'asino normaleSigma-Aldrich, GermaniaD9663
ParaformaldeideSigma-Aldrich, Germania158127
Penicilina e StreptomicinaThermoFisher Sientific, USA15140122
Poli-L-lisinaSigma-Aldrich, GermaniaP5899
Cloruro di potassioSigma-Aldrich, GermaniaP5405
Diidrogeno fosfato di potassioCarlo Erba Reagenti, Spagna471686
Shaker DELFIA PlateShakePerkinElmer Life Sciencies, USA
Bicarbonato di sodioSigma-Aldrich, GermaniaS3817
Cloruro di sodioSigma-Aldrich, GermaniaS5886
Fosfato di sodio eptaidrato bibasicoCarl ROTH GmbHX987.2
Piruvato di sodioSigma-Aldrich, GermaniaP5280
ThapsigargineTocris Bioscience, Regno Unito1138
Triton X - 100Sigma-Aldrich, GermaniaT8787
TripsinaSigma-Aldrich, GermaniaT4799
Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520Wescor, ELITechGroup Inc., USA
Sistema di imaging ViiFluorVisitron System Gmbh, Germania
Sistema policromatore VisiChromeVisitron System Gmbh, Germania
VisiView configurazione ad alte prestazioniVisitron System Gmbh, Germania
Lampada ad arco corto allo xenoUshio, Giappone

Riferimenti

  1. Kiernan, M. C., et al. Amyotrophic lateral sclerosis. Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).
  2. Taylor, J. P., Brown, R. H. J., Cleveland, D. W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).
  3. Gleichman, A. J., Carmichael, S. T. Glia in neurodegeneration: Drivers of disease or along for the ride. Neurobiology of Disease. 142, 104957(2022).
  4. Zhang, R., et al. Evidence for systemic immune system alterations in sporadic amyotrophic lateral sclerosis (sALS). Journal of Neuroimmunology. 159 (1-2), 215-224 (2005).
  5. Saleh, I. A., et al. Evaluation of humoral immune response in adaptive immunity in ALS patients during disease progression. Journal of Neuroimmunology. 215 (1-2), 6(2009).
  6. Wang, M., et al. Evaluation of Peripheral Immune Activation in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Frontiers in Neurology. 12, 628710(2021).
  7. Li, J. -Y., et al. Blood-brain barrier dysfunction and myelin basic protein in survival of amyotrophic lateral sclerosis with or without frontotemporal dementia. Neurological Sciences. 43 (5), 3201-3210 (2022).
  8. Milošević, M., et al. Immunoglobulins G from patients with sporadic amyotrophic lateral sclerosis affects cytosolic Ca2+ homeostasis in cultured rat astrocytes. Cell Calcium. 54 (1), 17-25 (2013).
  9. Andjus, P. R., Stevic-Marinkovic, Z., Cherubini, E. Immunoglobulins from motoneurone disease patients enhance glutamate release from rat hippocampal neurones in culture. Journal of Physiology. 504, 103-112 (1997).
  10. Howland, D. S., et al. Focal loss of the glutamate transporter EAAT2 in a transgenic rat model of SOD1 mutant-mediated amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (3), 1604-1609 (2002).
  11. Dučić, T., Stamenković, S., Lai, B., Andjus, P., Lučić, V. Multimodal synchrotron radiation microscopy of intact astrocytes from the hSOD1 G93A rat model of amyotrophic lateral sclerosis. Analytical Chemistry. 91 (2), 1460-1471 (2019).
  12. Popović-Bijelić, A., et al. Iron-sulfur cluster damage by the superoxide radical in neural tissues of the SOD1(G93A) ALS rat model. Free Radical Biology & Medicine. 96, 313-322 (2016).
  13. Stamenković, S., et al. In vivo EPR pharmacokinetic evaluation of the redox status and the blood brain barrier permeability in the SOD1(G93A) ALS rat model. Free Radical Biology & Medicine. 108, 258-269 (2017).
  14. Stamenković, S., Dučić, T., Stamenković, V., Kranz, A., Andjus, P. R. Imaging of glial cell morphology, SOD1 distribution and elemental composition in the brainstem and hippocampus of the ALS hSOD1(G93A) rat. Neuroscience. 357, 37-55 (2017).
  15. Milošević, M., et al. Immunoglobulins G from sera of amyotrophic lateral sclerosis patients induce oxidative stress and upregulation of antioxidative system in BV-2 microglial cell line. Frontiers in Immunology. 8, 1619(2017).
  16. Boillée, S., Cleveland, D. W. Revisiting oxidative damage in ALS: microglia, Nox, and mutant SOD1. Journal of Clinical Investigation. 118 (2), 474-478 (2008).
  17. Boillée, S., et al. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 312 (5778), 1389-1392 (2006).
  18. Martínez-Palma, L., et al. Mitochondrial modulation by dichloroacetate reduces toxicity of aberrant glial cells and gliosis in the SOD1G93A rat model of amyotrophic lateral sclerosis. Journal of American Society for Experimental Neurotherapeutics. 16 (1), 203-215 (2019).
  19. Díaz-Amarilla, P., et al. Phenotypically aberrant astrocytes that promote motoneuron damage in a model of inherited amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (44), 18126-18131 (2011).
  20. Barbosa, M., et al. Recovery of depleted miR-146a in ALS cortical astrocytes reverts cell aberrancies and prevents paracrine pathogenicity on microglia and motor neurons. Frontiers in Cell Developmental Biology. 9, 634355(2021).
  21. Gomes, C., et al. Astrocyte regional diversity in ALS includes distinct aberrant phenotypes with common and causal pathological processes. Experimental Cell Research. 395 (2), 112209(2020).
  22. Kovacs, M., et al. CD34 identifies a subset of proliferating microglial cells associated with degenerating motor neurons in ALS. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 3880(2019).
  23. Komiya, H., et al. Ablation of interleukin-19 improves motor function in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Molecular Brain. 14 (1), 1-13 (2021).
  24. Trias, E., et al. Emergence of microglia bearing senescence markers during paralysis progression in a rat model of inherited ALS. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 1-14 (2019).
  25. Pullen, A. H., Demestre, M., Howard, R. S., Orrell, R. W. Passive transfer of purified IgG from patients with amyotrophic lateral sclerosis to mice results in degeneration of motor neurons accompanied by Ca2+ enhancement. Acta Neuropatholgica. 107 (1), 35-46 (2004).
  26. Obál, I., et al. Intraperitoneally administered IgG from patients with amyotrophic lateral sclerosis or from an immune-mediated goat model increase the levels of TNF-α, IL-10 in the spinal cord and serum of mice. Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 121(2016).
  27. Obál, I., et al. Experimental motor neuron disease induced in mice with long-term repeated intraperitoneal injections of serum from ALS patients. International Journal of Molecular Sciences. 20 (10), 2573(2019).
  28. Mohamed, H. A., et al. Immunoglobulin Fc gamma receptor promotes immunoglobulin uptake, immunoglobulin-mediated calcium increase, and neurotransmitter release in motor neurons. Journal of Neuroscience Research. 69 (1), 110-116 (2002).
  29. Engelhardt, J. I., Siklos, L., Appel, S. H. Altered calcium homeostasis and ultrastructure in motoneurons of mice caused by passively transferred anti-motoneuronal IgG. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 56 (1), 21-39 (1997).
  30. Pagani, M. R., Reisin, R. C., Uchitel, O. D. Calcium signaling pathways mediating synaptic potentiation triggered by amyotrophic lateral sclerosis IgG in motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 26 (10), 2661-2672 (2006).
  31. Carter, J. R., Mynlieff, M. Amyotrophic lateral sclerosis patient IgG alters voltage dependence of Ca2+ channels in dissociated rat motoneurons. Neuroscience Letters. 353 (3), 221-225 (2003).
  32. Fratantoni, S. A., Weisz, G., Pardal, A. M., Reisin, R. C., Uchitel, O. D. Amyotrophic lateral sclerosis IgG-treated neuromuscular junctions develop sensitivity to L-type calcium channel blocker. Muscle & Nerve. 23 (4), 543-550 (2000).
  33. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
  34. Vay, S. U., et al. The impact of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) and voltage-gated potassium KCNQ/Kv7 channels on primary microglia function. Journl of Neuroinflammation. 17 (1), 100(2020).
  35. Bijelić, D. D., et al. Central nervous system-infiltrated immune cells induce calcium increase in astrocytes via astroglial purinergic signaling. Journal of Neuroscience Research. 98 (11), 2317-2332 (2020).
  36. Kawamata, H., et al. Abnormal intracellular calcium signaling and SNARE-dependent exocytosis contributes to SOD1G93A astrocyte-mediated toxicity in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2331-2348 (2014).
  37. Nims, R. W., Price, P. J. Best practices for detecting and mitigating the risk of cell culture contaminants. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 53 (10), 872-879 (2017).
  38. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments. (71), e50079(2013).
  39. Adzic, M., et al. Extracellular ATP induces graded reactive response of astrocytes and strengthens their antioxidative defense in vitro. Journal of Neuroscience Research. 95 (4), 1053-1066 (2017).
  40. Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. Overview of general and discriminating markers of differential microglia phenotypes. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 198(2020).
  41. Butovsky, O., et al. Identification of a unique TGF-β-dependent molecular and functional signature in microglia. Nature Neuroscince. 17 (1), 131-143 (2014).
  42. Vankriekelsvenne, E., et al. Transmembrane protein 119 is neither a specific nor a reliable marker for microglia. Glia. 70 (6), 1170-1190 (2022).
  43. Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Tag

Coltura primaria di astrociticoltura di microgliaimaging del calcioisolamento di cellule glialimodello hSOD1G93Aimmunocitochimicamarker GFAPmarker Iba1colorante Fluo 4 AM
Colture primarie di astrociti e microglia di ratto e loro utilizzo nello studio della sclerosi laterale amiotrofica
Contattaci
Raccomanda alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.