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Articolo metodologico

In tempo reale, a due colori stimolato Raman Scattering Imaging del cervello di topo per la diagnosi dei tessuti

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DOI:

10.3791/63484

⸱

1 febbraio 2022

 ,  , 
1Department of Chemistry, University of Washington

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

La microscopia A dispersione Raman stimolata (SRS) è una tecnica di imaging potente, non distruttiva e priva di etichette. Un'applicazione emergente è l'istologia Raman stimolata, in cui l'imaging SRS a due colori nelle transizioni Raman proteiche e lipidiche viene utilizzato per generare immagini di pseudo-ematossilina ed eosina. Qui, dimostriamo un protocollo per l'imaging SRS a due colori in tempo reale per la diagnosi dei tessuti.

Abstract

La microscopia a dispersione Raman stimolata (SRS) è emersa come una potente tecnica di imaging ottico per la diagnosi dei tessuti. Negli ultimi anni, la SRS a due colori ha dimostrato di essere in grado di fornire immagini equivalenti a ematossilina ed eosina (H & E) che consentono una diagnosi rapida e affidabile del cancro al cervello. Tale capacità ha permesso interessanti applicazioni di diagnosi intraoperatoria del cancro. L'imaging SRS a due colori del tessuto può essere eseguito con una sorgente laser a picosecondi o femtosecondi. I laser a femtosecondi hanno il vantaggio di abilitare modalità di imaging flessibili, tra cui l'imaging iperspettrale veloce e l'imaging SRS a due colori in tempo reale. Un approccio di messa a fuoco spettrale con impulsi laser cinguettati viene in genere utilizzato con laser a femtosecondi per ottenere un'elevata risoluzione spettrale.

L'acquisizione SRS a due colori può essere realizzata con modulazione ortogonale e rilevamento lock-in. La complessità del cinguettio, della modulazione e della caratterizzazione degli impulsi è un collo di bottiglia per l'adozione diffusa di questo metodo. Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato per dimostrare l'implementazione e l'ottimizzazione della messa a fuoco spettrale SRS e l'imaging a due colori in tempo reale del tessuto cerebrale del topo in modalità epi. Questo protocollo può essere utilizzato per un'ampia gamma di applicazioni di imaging SRS che sfruttano l'alta velocità e la capacità di imaging spettroscopico di SRS.

Introduzione

La diagnostica tissutale tradizionale si basa su protocolli di colorazione seguiti da un esame al microscopio ottico. Un metodo di colorazione comune utilizzato dai patologi è la colorazione H & E: l'ematossilina colora i nuclei cellulari di un blu violaceo e l'eosina colora la matrice extracellulare e il citoplasma rosa. Questa semplice colorazione rimane il gold standard in patologia per molti compiti di diagnosi tissutale, in particolare la diagnosi del cancro. Tuttavia, l'istopatologia H& E, in particolare la tecnica di sezionamento congelato utilizzata in un ambiente intraoperatorio, ha ancora dei limiti. La procedura di colorazione è un processo laborioso che coinvolge l'incorporamento del tessuto, il sezionamento, la fissazione e la colorazione1. Il tempo di consegna tipico è di 20 minuti o più. L'esecuzione di H & E durante il sezionamento congelato a volte può diventare più impegnativa quando più sezioni vengono elaborate contemporaneamente a causa della necessità di valutare le caratteristiche cellulari o i modelli di crescita in 3D per la valutazione del margine. Inoltre, le tecniche istologiche intraoperatorie richiedono tecnici e clinici specializzati. La limitazione del numero di patologi certificati in molti ospedali è un vincolo per la consultazione intraoperatoria in molti casi. Tali limitazioni possono essere alleviate con gli interessi di rapido sviluppo nella patologia digitale e nella diagnosi basata sull'intelligenza artificiale2. Tuttavia, i risultati della colorazione H & E sono variabili, a seconda dell'esperienza del tecnico, il che presenta ulteriori sfide per la diagnosi basata su computer2.

Queste sfide possono potenzialmente essere affrontate con tecniche di imaging ottico senza etichetta. Una di queste tecniche è la microscopia SRS. SRS utilizza laser pulsati sincronizzati ( pompa e Stokes - per eccitare le vibrazioni molecolari con alta efficienza3. Recenti rapporti hanno dimostrato che l'imaging SRS di proteine e lipidi può generare immagini equivalenti A&E (note anche come istologia Raman stimolata o SRH) con tessuto fresco intatto, che bypassa la necessità di qualsiasi elaborazione tissutale, riduce significativamente il tempo necessario per la diagnosi ed è stato adattato intraoperatoriamente4. Inoltre, l'imaging SRS può fornire immagini 3D, che offrono informazioni aggiuntive per la diagnosi quando le immagini 2D sono insufficienti5. SRH è imparziale e genera immagini digitali che sono prontamente disponibili per la diagnosi basata su computer. Emerge rapidamente come una possibile soluzione per la diagnosi intraoperatoria del cancro e l'analisi del margine tumorale, specialmente nel cancro al cervello 6,7,8. Più recentemente, l'imaging SRS dei cambiamenti chimici del tessuto è stato anche suggerito per fornire utili informazioni diagnostiche che possono ulteriormente aiutare i medici a stratificare diversi tipi di cancro o stadi9.

Nonostante il suo enorme potenziale nelle applicazioni di diagnosi tissutale, l'imaging SRS è per lo più limitato ai laboratori accademici specializzati in ottica a causa della complessità associata alla piattaforma di imaging, che include laser ultraveloci, il microscopio a scansione laser e sofisticata elettronica di rilevamento. Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro dettagliato per dimostrare l'uso di una comune sorgente laser a femtosecondi per l'imaging SRS a due colori in tempo reale e la generazione di immagini pseudo-H & E dal tessuto cerebrale del topo. Il protocollo riguarderà le seguenti procedure:

Allineamento e ottimizzazione del cinguettio
La maggior parte degli schemi di imaging SRS utilizza laser a picosecondi o femtosecondi come fonte di eccitazione. Con i laser a femtosecondi, la larghezza di banda del laser è molto più grande della larghezza di linea Raman. Per superare questa limitazione, viene utilizzato un approccio di messa a fuoco spettrale per cinguettare i laser a femtosecondi su una scala temporale di picosecondi per ottenere una risoluzione spettrale ristretta10. La risoluzione spettrale ottimale si ottiene solo quando il cinguettio temporale (noto anche come dispersione del ritardo di gruppo o semplicemente dispersione) è correttamente abbinato per la pompa e i laser Stokes. La procedura di allineamento e i passaggi necessari per ottimizzare la dispersione dei raggi laser utilizzando barre di vetro altamente dispersive sono dimostrati qui.

Calibrazione della frequenza
Un vantaggio della messa a fuoco spettrale SRS è che l'eccitazione Raman può essere rapidamente regolata modificando il ritardo temporale tra la pompa e i laser Stokes. Tale sintonizzazione offre immagini veloci e un'acquisizione spettrale affidabile rispetto alla sintonizzazione delle lunghezze d'onda laser. Tuttavia, la relazione lineare tra frequenza di eccitazione e ritardo temporale richiede una calibrazione esterna. I solventi organici con picchi Raman noti vengono utilizzati per calibrare la frequenza Raman per la messa a fuoco spettrale SRS.

Imaging a due colori in tempo reale
È importante aumentare la velocità di imaging nelle applicazioni di diagnosi tissutale per ridurre il tempo necessario per l'analisi di campioni di tessuto di grandi dimensioni. L'imaging SRS simultaneo a due colori di lipidi e proteine evita la necessità di sintonizzare il laser o il ritardo temporale, il che aumenta la velocità di imaging di oltre due volte. Ciò si ottiene utilizzando una nuova tecnica di modulazione ortogonale e demodulazione a doppio canale con un amplificatore lock-in11. Questo articolo descrive il protocollo per la modulazione ortogonale e l'acquisizione di immagini a doppio canale.

Imaging SRS in modalità Epi
La maggior parte delle immagini SRS mostrate fino ad oggi viene eseguita in modalità di trasmissione. L'imaging in modalità epi rileva i fotoni retrodiffusi dal tessuto12. Per le applicazioni di patologia, i campioni chirurgici possono essere piuttosto grandi. Per l'imaging in modalità di trasmissione, è spesso necessario il sezionamento dei tessuti, che richiede indesiderabilmente tempo extra. Al contrario, l'imaging in modalità epi può funzionare con campioni chirurgici intatti. Poiché lo stesso obiettivo viene utilizzato per raccogliere la luce retrodiffusa, non è inoltre necessario allineare un condensatore ad alta apertura numerica necessario per l'imaging della trasmissione. La modalità Epi è anche l'unica opzione quando il sezionamento dei tessuti è difficile, come con l'osso. In precedenza abbiamo dimostrato che per il tessuto cerebrale, l'imaging in modalità epi offre una qualità di imaging superiore per lo spessore del tessuto > 2 mm13. Questo protocollo utilizza uno splitter a fascio polarizzatore (PBS) per raccogliere fotoni sparsi depolarizzati dal tessuto. È possibile raccogliere più fotoni con un rivelatore anulare a scapito della complessità del gruppo rivelatore personalizzato12. L'approccio PBS è più semplice da implementare (simile alla fluorescenza), con il fotodiodo standard già utilizzato per il rilevamento della modalità di trasmissione.

Generazione di immagini Pseudo-H&E
Una volta raccolte le immagini SRS a due colori, possono essere ricolorate per simulare la colorazione H & E. Questo documento dimostra la procedura per convertire le immagini SRS lipidiche e proteiche in immagini SRS pseudo-H & E per applicazioni patologiche. Il protocollo sperimentale descrive in dettaglio i passaggi critici necessari per generare immagini SRS di alta qualità. La procedura mostrata qui non è solo applicabile alla diagnosi tissutale, ma può anche essere adattata per molte altre applicazioni di imaging SRS iperspettrale come l'imaging farmacologico e l'imaging metabolico14,15.

Requisiti generali di sistema
Il sistema laser per questo protocollo deve essere in grado di emettere 2 raggi laser sincronizzati a femtosecondi. I sistemi sono idealmente dotati di un oscillatore parametrico ottico (OPO) per la sintonizzazione ad ampia lunghezza d'onda di uno dei raggi laser. La configurazione di questo protocollo utilizza un sistema laser commerciale Insight DS + che emette due laser (un raggio fisso a 1.040 nm e un raggio sintonizzabile basato su OPO, che va da 680 a 1.300 nm) con una frequenza di ripetizione di 80 MHz. I microscopi a scansione laser, sia dei principali produttori di microscopi che costruiti in casa, possono essere utilizzati per l'imaging SRS. Il microscopio utilizzato è un microscopio a scansione laser verticale costruito sopra un telaio per microscopio verticale commerciale. Una coppia di specchi galvo da 5 mm viene utilizzata per scansionare il raggio laser. Per gli utenti che scelgono di adottare un microscopio a scansione laser costruito in casa, fare riferimento a un protocollo precedentemente pubblicato per la costruzione di un microscopio a scansione laser16.

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Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sugli animali sono state condotte con cervelli di topo a sezione fissa da 200 μm, in conformità con il protocollo (# 4395-01) approvato dall'Institute of Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università di Washington. I topi wild-type (ceppo C57BL/6J) vengono eutanasizzati con CO2. Quindi, viene eseguita una craniotomia per estrarre i loro cervelli per la fissazione in paraformaldeide al 4% in soluzione salina tamponata con fosfato. I cervelli sono incorporati in una miscela di agarosio al 3% e gelatina allo 0,3% e sezionati in fette spesse 200 μm da un vibratoma.

1. Allineamento iniziale

NOTA: assicurarsi che le dimensioni del fascio e la divergenza di entrambi i bracci siano abbinate per la migliore sensibilità e risoluzione. Collimate la pompa e i raggi Stokes e regolate le loro dimensioni prima che entrino nel microscopio a scansione laser. Per fare questo, utilizzare un paio di lenti acromatiche per ogni fascio prima di combinarle sullo specchio dicroico. Indossare sempre occhiali laser adeguati per l'allineamento del fascio.

  1. Collimazione del fascio
    1. Installare un paio di lenti acromatiche per il fascio della pompa. Come punto di partenza, utilizzare un obiettivo da 100 mm e un obiettivo da 200 mm per ingrandire le dimensioni del raggio laser di 2 volte. Assicurarsi che la distanza dei due obiettivi sia di circa 300 mm. Allineare il fascio della pompa attraverso il centro di entrambe le lenti.
    2. Posizionare uno specchio dopo la seconda lente per inviare il raggio verso una parete (>1 m di distanza). Fare attenzione quando si invia il raggio su lunghe distanze. Traccia il raggio dallo specchio alla parete con una scheda IR e controlla se il raggio cambia di dimensioni. Collimare il raggio se il raggio cambia di dimensioni in funzione della distanza.
      1. Se il fascio è convergente (diminuendo le dimensioni con la propagazione), avvicinare le due lenti.
      2. Se il fascio è divergente (aumentando le dimensioni con la propagazione), spostare le due lenti più lontano. Regolare la distanza fino a quando il raggio non è collimato.
    3. Ripetere i passaggi 1.1.1 e 1.1.2 affinché la trave di Stokes collimi la trave.
  2. Regolazione della dimensione del fascio
    1. Se è disponibile un profilatore a fascio, misurare la dimensione del fascio collimato per ogni trave. In alternativa, stimare la dimensione del fascio utilizzando la scheda IR e un righello per ottenere un diametro del fascio di 4-5 mm.
    2. Se la dimensione del fascio è troppo piccola o troppo grande, modificare la coppia di obiettivi utilizzata nel passaggio 1.1. Regolare la coppia di lenti fino a quando entrambi i fasci hanno un diametro di 4-5 mm.
      NOTA: l'ingrandimento del fascio è il rapporto tra la lunghezza focale del secondo obiettivo e il primo obiettivo (f2/f1).
  3. Sovrapposizione spaziale
    NOTA: l'imaging SRS richiede che entrambi i raggi laser siano combinati nello spazio e nel tempo per eccitare le vibrazioni molecolari. Uno schema dell'imaging SRS a messa a fuoco spettrale è mostrato nella Figura 1.
    1. Combina i due raggi laser installando uno specchio dicroico con diversi specchietti dello sterzo per la regolazione. Ottimizza la sovrapposizione spaziale della pompa e di Stokes monitorando i fasci dopo lo specchio dicroico in due diverse posizioni distanti (~1 m). Regolare iterativamente lo specchietto retrovisore prima dello specchio dicroico e dicroico per allineare il fascio di Stokes con il fascio della pompa.
      NOTA: se le due travi si sovrappongono spazialmente in entrambe le posizioni, sono sufficientemente sovrapposte.
    2. Assicurarsi che i raggi combinati vengano inviati al centro degli specchi di scansione del microscopio a scansione laser regolando una coppia di specchi sterzanti quando gli specchietti retrovisori sono parcheggiati. Assicurarsi che entrambi i fasci viaggino attraverso il centro dell'obiettivo del microscopio e il condensatore.
    3. Dopo il condensatore, utilizzare un'altra coppia di obiettivi con lunghezze focali di 100 mm e 30 mm, rispettivamente, per trasmettere il fascio trasmesso sul fotodiodo. Assicurarsi che entrambi i fasci siano contenuti all'interno del fotodiodo e installare due filtri passa-basso per bloccare il fascio di Stokes modulato.

2. Rilevamento del segnale SRS

  1. Modulazione elettroottica (EOM)
    NOTA: EOM di 20 MHz viene utilizzato per modulare l'ampiezza di Stokes. Come discusso in seguito, l'EOM è derivato dal treno di impulsi laser a 80 MHz, necessario per la modulazione ortogonale. Altre frequenze di modulazione possono essere utilizzate se viene eseguito solo SRS monocolore o iperspettrale. In tal caso, la sincronizzazione della frequenza di modulazione con la frequenza laser non è necessaria. Un generatore di frequenza con un amplificatore di potenza RF può essere utilizzato per pilotare l'EOM. Di conseguenza, i passaggi 2.1.1-2.1.4 possono essere ignorati.
    1. Posiziona un campionatore di fascio nel percorso del fascio di Stokes per raccogliere il 10% del raggio e inviarlo a un fotodiodo veloce per rilevare il treno di impulsi a 80 MHz.
      NOTA: il segnale del fotodiodo viene inviato a un divisore di frequenza per generare un'uscita TTL a 20 MHz. Questa uscita viene ulteriormente inviata in un buffer fanout per replicare l'uscita in quattro uscite identiche a 20 MHz. Una delle uscite viene utilizzata per attivare l'oscilloscopio.
    2. Prendi una delle uscite del buffer fanout e filtrala con un filtro passabanda per ottenere un'onda sinusoidale a 20 MHz. Utilizzare un attenuatore RF per regolare la tensione da picco a picco di uscita a ~500 mV.
    3. Inviare l'uscita risultante a uno sfasatore, che consente la regolazione fine della fase RF con una sorgente di tensione. Inviare questa uscita a un amplificatore di potenza RF e collegare l'uscita dell'amplificatore all'EOM.
    4. Sblocca il fascio di Stokes e ottimizza la profondità di modulazione di EOM1 posizionando un fotodiodo nel percorso del fascio. Regolare la tensione EOM e la piastra a quarto d'onda fino a quando la profondità di modulazione (rapporto valle-picco) appare soddisfacente.
      NOTA: Alla modulazione di 20 MHz (1/4 della frequenza di ripetizione laser), sono previsti due impulsi ogni 50 ns.
  2. Sovrapposizione temporale
    NOTA: la sovrapposizione temporale della pompa e di Stokes si ottiene ritardando uno dei due treni di impulsi laser con un catadiottro montato su uno stadio di ritardo (la Figura 1 mostra lo Stokes in ritardo). La sovrapposizione grossolana viene monitorata con l'oscilloscopio e la sovrapposizione fine viene monitorata dal segnale SRS. La sovrapposizione temporale fine può anche essere ottenuta con un autocorrelatore, se disponibile.
    1. Posizionare un fotodiodo dopo lo specchio dicroico per rilevare il raggio laser. Blocca prima la trave di Stokes. Ingrandire uno dei picchi di impulso della pompa sull'oscilloscopio. Posizionare un cursore verticale per contrassegnare la posizione temporale di questo picco con l'oscilloscopio.
    2. Bloccare il raggio della pompa e sbloccare il raggio di Stokes. Traduci lo stadio di ritardo in modo che corrisponda temporalmente la posizione di picco sull'oscilloscopio alla posizione contrassegnata nel passaggio precedente. Vedere la Figura 2 per una visualizzazione della sovrapposizione temporale di due fasci.
      1. (FACOLTATIVO) Se la traslazione dello stadio di ritardo è insufficiente per abbinare temporalmente i due raggi, spostare lo stadio di ritardo al centro del suo intervallo di movimento.
      2. Calcola la distanza di ritardo necessaria per abbinare i due fasci prendendo la differenza temporale tra i due fasci e moltiplicando la differenza per la velocità della luce per trovare la quantità di distanza necessaria per abbinare i due fasci temporalmente.
      3. Allungare il percorso del fascio del raggio più veloce o accorciare il percorso del raggio più lento per corrispondere approssimativamente al ritardo temporale di conseguenza.
    3. Preparare un campione di vetrino per microscopio con DMSO e nastro biadesivo come distanziatore per tenere il campione tra il vetrino e un coperchio.
    4. Posizionare il campione sul microscopio con il lato coverslip rivolto verso l'obiettivo del microscopio. Cambiare il microscopio con illuminazione a campo luminoso e osservare il campione dall'oculare. Trova il fuoco del campione trovando prima lo stato attivo sia nello strato superiore che in quello inferiore delle bolle d'aria nell'interfaccia vetro-nastro, quindi sposta lo stato attivo in modo che si trovi tra i due strati di nastro.
      NOTA: assicurarsi che i raggi laser siano bloccati prima di esaminare l'oculare.
    5. Impostare l'uscita del fascio sintonizzabile su 798 nm. In base al throughput ottico del condensatore, regolare la potenza ottica in modo che sia di ~ 40 mW ciascuno per la pompa e i fasci di Stokes alla messa a fuoco dell'obiettivo.
    6. Apri ScanImage in MATLAB (o altro software di scansione che controlla il microscopio) e fai clic sul pulsante FOCUS per avviare la scansione.
      NOTA: i raggi laser verranno scansionati raster attraverso il campione per generare un'immagine. L'uscita del segnale a bassa frequenza dal fotodiodo (<100 kHz) viene inviata direttamente nel canale 1 della scheda di acquisizione dati (denominato canale CC). L'uscita ad alta frequenza (>100 kHz) dal fotodiodo viene inviata all'amplificatore lock-in e l'uscita X del segnale dell'amplificatore lock-in viene inviata al canale 2 della scheda di acquisizione dati (denominato canale CA).
    7. Regolare lo specchietto retrovisore prima dello scanner galvo per centrare il segnale CC sul display del canale 1. Spostare lo stadio di ritardo motorizzato e osservare da vicino l'uscita di blocco mostrata sul display del canale 2 (cioè il canale CA).
      NOTA: quando la pompa e Stokes coincidono nel tempo, un segnale apparirà sul canale CA. È utile regolare la scala dei colori del canale CA per visualizzare la piccola variazione di intensità.
    8. Massimizza l'intensità del segnale CA regolando finemente il ritardo temporale. Regolare lo specchio dicroico per centrare il segnale SRS sul canale CA (mantenendo centrato il canale CC). Regolare la fase dell'amplificatore lock-in per massimizzare il segnale. Vedere la Figura 3 per un segnale soddisfacente.

3. Ottimizzazione della risoluzione spettrale

NOTA: la pompa e i fasci di Stokes che raggiungono il campione devono avere la stessa quantità di dispersione del ritardo di gruppo (GDD) per massimizzare la risoluzione spettrale. La dispersione dipende fortemente dall'impostazione sperimentale. La configurazione sperimentale qui descritta utilizza impulsi a femtosecondi a 1.040 nm e 800 nm come Stokes e pompa, rispettivamente. Le aste di vetro a pietra focaia densa (H-ZF52A) sono utilizzate come mezzo di allungamento degli impulsi.

  1. Inserire 48 cm di un'asta di vetro altamente dispersiva (H-ZF52A o vetro flint denso equivalente) nel percorso del fascio di 800 nm. Stimare il GDD utilizzando Eq (1):
    figure-protocol-1 (1)
    NOTA: GVD di vari materiali di vetro a diverse lunghezze d'onda può essere trovato dalla risorsa del database dell'indice di rifrazione. Ad esempio, H-ZF52A ha un GVD di 220,40 fs2/mm a 800 nm. Il GDD totale è 105792 fs2.
  2. Calcola quanti cm dell'asta di vetro dispersiva è necessario aggiungere al percorso del fascio di 1.040 nm per abbinare il GDD della pompa. Inserire la lunghezza appropriata delle barre di vetro dispersive nel percorso del fascio di 1.040 nm per corrispondere approssimativamente al GDD del raggio da 800 nm. Si noti che l'aggiunta di aste di vetro cambierà la sovrapposizione temporale delle due travi e potrebbe essere necessaria la regolazione del ritardo.
  3. Calibrazione della risoluzione spettrale
    1. Fai un campione di vetrino al microscopio con DMSO. Posizionare il vetrino sul microscopio e controllare la potenza dei fasci che escono dal condensatore del microscopio. Regolare la potenza di conseguenza per avere ~ 40 mW ciascuno a fuoco del campione.
    2. Apri ScanImage da MATLAB. Trova il segnale SRS massimo scansionando attraverso lo stadio di ritardo, che corrisponde al picco Raman di 2.913 cm-1 di DMSO. Stimare la posizione dello stadio in base alla posizione dello stadio precedente con l'aumento della lunghezza del percorso ottico dovuto all'inserimento delle aste. Riallineare la sovrapposizione spaziale del fascio a causa della piccola deviazione del raggio quando vengono aggiunte aste di vetro.
    3. Salvare una scansione SRS iperspettrale scattando in sequenza una serie di immagini SRS mentre si sposta lo stadio motorizzato.
      NOTA: l'intervallo di scansione ritardata copre due picchi Raman, corrispondenti rispettivamente ai picchi Raman di 2.913 cm-1 e 2.994 cm-1 di DMSO. Queste due transizioni si osservano quando si utilizza una pompa da 800 nm e un laser Stokes da 1.040 nm.
    4. Traccia gli spettri SRS della soluzione DMSO utilizzando ImageJ o MATLAB. Adatta il grande picco DMSO 2.913 cm-1 a una funzione gaussiana o lorentziana in MATLAB per calcolare la larghezza completa a metà massimo (FWHM) del picco.
      NOTA: i risultati rappresentativi sono mostrati nella Figura 4. Se è presente un solo picco ampio, significa che la risoluzione spettrale è troppo scarsa per distinguere i due picchi e sono necessarie più aste di vetro, oppure che l'intervallo scansionato era troppo piccolo per rilevare il secondo picco. In genere, una risoluzione spettrale accettabile DMSO è ~ 20-25 cm-1 quando vengono utilizzate aste di vetro di lunghezza >60 cm. Una risoluzione inferiore viene spesso utilizzata per l'imaging tissutale per scambiare segnali più alti con impulsi più brevi17.
  4. (FACOLTATIVO) Utilizzare un autocorrelatore o un FROG (Frequency-Resolved Optical Gating) per determinare la durata dell'impulso di ciascun braccio per calcolare esattamente la quantità di GDD e la lunghezza delle aste necessarie per abbinare il GDD tra la pompa e lo Stokes.
  5. Ripetere i passaggi 3.3.2-3.3.4 per diverse lunghezze di aste sul fascio di Stokes per trovare la risoluzione spettrale ottimale, il che significa che la migliore corrispondenza GDD è stata trovata sperimentalmente. Utilizzare più set di aste di vetro di lunghezza diversa per ottenere una risoluzione spettrale ottimale.

4. Caratterizzazione segnale-rumore (SNR)

  1. Assicurarsi che il passaggio 4.2 venga eseguito dopo il completo allineamento spaziale e temporale.
  2. Acquisire un'immagine SRS corrispondente al picco Raman di 2.913 cm-1 di DMSO. Aprite l'immagine in ImageJ e selezionate una piccola area al centro della cornice. Utilizzare la funzione di misura per calcolare la deviazione media e standard dei valori nell'area selezionata.
  3. Dividere il valore medio dell'area selezionata per la deviazione standard per trovare il valore SNR, come in Eq (2).
    figure-protocol-2 (2)
    NOTA: Un buon SNR per il sistema (con una costante di tempo di lock-in di 4 μs) che utilizza DMSO a 40 mw/40 mw a fuoco per entrambi i bracci è >800. Concentrazioni più basse di DMSO o minore potenza possono essere utilizzate per una stima più accurata dell'SNR se la scheda di acquisizione dati ha una profondità di bit limitata.
  4. Se l'SNR è troppo basso, riallineare gli impulsi laser per ottimizzare la sovrapposizione spaziale, la sovrapposizione temporale, la corrispondenza tra dimensioni del fascio e collimazione e/o la corrispondenza di dispersione. Per un obiettivo con un collare di correzione dell'aberrazione, ottimizzare il segnale regolando il collare di correzione.

5. Calibrazione dell'asse di frequenza

NOTA: questo passaggio viene eseguito per correlare la posizione dello stadio di ritardo alla transizione Raman scansionata. È necessaria un'attenta selezione dei solventi per generare un "Raman Ruler" appropriato. DMSO è un solvente efficace per i legami CH in quanto ha due picchi Raman affilati a 2.913 cm-1 e 2.994 cm-1.

  1. Salva una scansione iperspettrale con l'intervallo dello stadio di ritardo che copre i picchi Raman di 2.913 cm-1 e 2.994 cm-1 di DMSO. Salvare le posizioni dello stage corrispondenti al set di dati iperspettrale.
    NOTA: Il picco massimo globale dello spettro corrisponde allo spostamento Raman DMSO 2.913 cm-1 e il secondo picco massimo corrisponde allo spostamento Raman DMSO 2.994 cm-1 .
  2. Eseguire la regressione lineare per le posizioni del palco e gli spostamenti Raman a 2.913 cm-1 e 2.994 cm-1. Usando l'equazione di regressione lineare che mette in relazione la posizione dello stadio con lo spostamento Raman, converti le posizioni di ritardo nelle frequenze Raman corrispondenti.

6. Modulazione ortogonale e imaging a due colori

NOTA: la fase di modulazione ortogonale è necessaria solo quando è necessaria l'imaging a due colori in tempo reale. Uno schema di questo schema è mostrato nella Figura 5. La modulazione ortogonale utilizza una coppia di EOM guidate a un quarto della frequenza laser (20 MHz per laser a 80 MHz) con uno sfasamento di 90° tra i due. Questa fase di modulazione ortogonale può essere saltata per l'imaging SRS a colore singolo o l'imaging SRS iperspettrale.

  1. Modulazione EOM1
    1. Installare un PBS (PBS2), una piastra a quarto d'onda (QWP2) e un secondo EOM (EOM2) nel percorso del fascio di Stokes dopo il primo EOM. Scollegare l'ingresso del segnale a EOM2. Collegare l'ingresso del segnale a EOM1 e accenderlo.
    2. Modula il fascio di Stokes (fissato a 1.040 nm) a 20 MHz (f0/4) inviando il raggio attraverso il primo EOM. Regola l'inclinazione e la posizione di EOM1 per assicurarti che il raggio colpisca dritto e centrato attraverso il cristallo EOM.
    3. Monitorare la profondità di modulazione osservando entrambe le polarizzazioni in uscita da PBS1 con due fotodiodi e visualizzando la modulazione su un oscilloscopio.
    4. Regolare la tensione QWP1, EOM1 e la fase dell'ingresso a 20 MHz (utilizzando uno sfasatore) per ottimizzare la profondità di modulazione del fascio trasmesso in modo che sia vicina al 100%. Vedere la Figura 2B per un'illustrazione di una buona profondità di modulazione.
  2. Modulazione EOM2
    1. Scollegare EOM1 e collegare EOM2.
    2. Invia l'uscita ad alta tensione del secondo amplificatore a 20 MHz a EOM2. Regola l'inclinazione e la posizione di EOM2 per assicurarti che il raggio colpisca dritto e centrato attraverso il cristallo EOM.
    3. Ancora una volta, monitora la profondità di modulazione osservando entrambe le polarizzazioni che escono da PBS2 con un oscilloscopio. Regolare la tensione QWP2, EOM2 e lo sfasatore secondo necessità per ottenere una modulazione vicina al 100% per entrambe le polarizzazioni.
    4. Assicurarsi che la modulazione del treno di impulsi abbia uno sfasamento di 90° rispetto alla prima modulazione.
      NOTA: Se i due treni di impulsi della pompa non sono ortogonali a 90 °, la diafonia tra i due canali sarà un problema.
    5. Testare l'ortogonalità della modulazione accendendo e collegando sia EOM1 che EOM2. Monitorare entrambe le polarizzazioni divise da PBS2 con un oscilloscopio. Riottimare EOM1 e EOM2 singolarmente se il treno di impulsi dopo il secondo PBS non è simile alla Figura 2C.
    6. Installare un cristallo di quarzo birifrangente da 20 mm (BRC) e HWP a valle di EOM2. Collegare entrambe le EOM contemporaneamente e monitorare il treno di impulsi in modo che assomigli alla Figura 2D.
      NOTA: Per il cinguettio utilizzato in questo esperimento, 20 mm BRC induce un ritardo temporale che corrisponde a uno spostamento Raman di 80 cm-1 . Potrebbe essere necessaria una lunghezza BRC diversa se viene utilizzato un cinguettio diverso.
  3. Taratura
    1. Calibrare il sistema utilizzando DMSO rilevando i segnali dall'uscita del canale X e Y dell'amplificatore lock-in (inviati ai canali 2 e 3 della scheda di acquisizione dati).
    2. Verificare se i segnali generati dal picco di 2.913 cm-1 dalla polarizzazione più veloce e quelli dalla polarizzazione più lenta sono vicini a 90° fuori fase sull'amplificatore lock-in. In caso contrario, regolare l'allineamento EOM fino a quando i due segnali non sono vicini a 90° fuori fase.
    3. Una volta completata la calibrazione, trova la posizione di ritardo che sonda la transizione proteica a 2.930 cm-1 per uno dei fasci ortogonali. Assicurarsi che l'altra polarizzazione sonde la transizione lipidica di 2.850 cm-1.

7. Imaging SRS in modalità Epi

NOTA: nello schema di imaging in modalità di trasmissione, l'obiettivo focalizza il laser nel campione e quindi una lente a condensatore dirige il raggio trasmesso verso un fotodiodo per il rilevamento lock-in. Nello schema di imaging epi-mode, la luce retrodiffusa e depolarizzata dal campione viene raccolta dall'obiettivo di messa a fuoco e isolata utilizzando uno splitter a fascio polarizzante. I fotoni isolati e retrodiffusi vengono inviati a un fotodiodo attraverso un paio di lenti a relè per il rilevamento del lock-in. La Figura 6 illustra lo schema di imaging epi-mode.

  1. Installare un HWP prima che il fascio entri nel microscopio per modificare la polarizzazione del fascio che entra nel microscopio. Posizionare un PBS sopra l'obiettivo per consentire al fascio depolarizzato retroriflettente di raggiungere il rilevatore.
  2. Utilizzare una coppia di obiettivi costituiti da una lente acromata da 75 mm e una lente asferica da 30 mm per trasmettere i fotoni retrodiffusi dall'apertura posteriore dell'obiettivo al fotorivelatore. Montare il rilevatore per raccogliere la luce retrodiffusa diretta dal PBS. Installare un filtro per impedire al fascio modulato di entrare nel rilevatore.
  3. Posizionare il campione di tessuto sotto l'obiettivo. Poiché il condensatore non è necessario per l'imaging in modalità epi, rimuoverlo se è necessario più spazio.
  4. Imaging
    1. Bloccare il raggio con un otturatore; far brillare una sorgente di luce bianca sul campione dal lato; e usa brightfield per trovare una messa a fuoco obiettiva.
    2. Sblocca entrambi i fasci e utilizza le posizioni di ritardo precalibrate per acquisire immagini SRS lipidiche e proteiche dal tessuto dalle due uscite dell'amplificatore lock-in.
    3. Regola il guadagno di lock-in e il fattore pixel bin per acquisire immagini di buona qualità.

8. Colorazione a falsi colori

  1. Aprire lo stack di immagini con ImageJ.
  2. Estrai le due immagini che corrispondono alla specie lipidica (2.850 cm-1) e proteica (2.930 cm-1) facendo clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine e facendo clic su Duplica.
  3. Rinominare l'immagine lipidica in lipidi e l'immagine proteica in proteine.
  4. Vai a | processo Image Calculator e le proteine performano sottrarre lipidi.
  5. Combina le immagini andando su Image | | colore Unisci i canali, impostando i lipidi su verde e le proteine su blu. Aprire lo strumento canali immagine (Image | | colore Strumento Canali) e regola la luminosità e il contrasto (Image | Regolare | Luminosità/Contrasto).
  6. Regola la luminosità e il contrasto per ogni canale utilizzando lo strumento canali . Per il canale lipidico, regolare il contrasto fino a quando le caratteristiche cellulari appaiono scure. Per il canale proteico, regolare il contrasto fino a quando le caratteristiche cellulari appaiono blu. Converti l'immagine verde/blu del canale unito in un'immagine RGB andando su Immagine | Tipo | Colore RGB. Esporta questa immagine tramite File | Salva con nome | Tiff.
    NOTA: per la falsa colorazione H & E, la combinazione di colori mostra il citoplasma rosa, mentre i nuclei sono blu-viola scuro.
  7. Scarica lo script HE.m MATLAB dalla falsa risorsa script di colorazione H&E nella Tabella dei materiali.
  8. Esegui lo script HE.m in MATLAB. Selezionare l'immagine RGB esportata dal passaggio precedente per generare un'immagine macchiata artificialmente H&E.
  9. (FACOLTATIVO) Normalizza l'intensità dell'immagine per immagini con un campo visivo di grandi dimensioni perché l'immagine appare più scura nella periferia che al centro.
    1. Per eseguire la normalizzazione sul campo delle immagini, calcolare la media del maggior numero possibile di immagini. Quindi, rimuovete le feature di intensità con ImageJ (Process | Filtri | Gaussian Blur | Raggio=50).
    2. Misurare l'intensità massima dell'immagine sfocata (CTRL+M). Dividere l'immagine sfocata per l'intensità massima (Process | matematica | Dividere). Dividere l'immagine SRS raw per l'immagine sfocata (Process | | immagine Calcolatrice).

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Risultati

Ottimizzazione della risoluzione spettrale:
La dispersione attraverso un materiale è influenzata dal mezzo dispersivo (lunghezza e materiale) e dalla lunghezza d'onda. La modifica della lunghezza dell'asta di dispersione influisce sulla risoluzione spettrale e sulla dimensione del segnale. È una relazione di dare e avere che può essere pesata in modo diverso a seconda dell'applicazione. Le aste allungano l'impulso del fascio dall'essere largo in frequenza e stretto nel tempo ad essere stretto in frequ...

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Discussione

Lo schema di imaging SRS a due colori presentato in questo protocollo dipende dalla corretta implementazione dell'imaging SRS monocolore. Nell'imaging SRS a un colore, i passaggi critici sono l'allineamento spaziale, l'allineamento temporale, la profondità di modulazione e lo sfasamento. La combinazione spaziale dei due fasci è realizzata da uno specchio dicroico. Diversi specchi dello sterzo vengono utilizzati per la regolazione fine quando si inviano i raggi allo specchio dicroico. Una volta che i fasci sono combinati ...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano che non ci sono conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questo studio è stato supportato da NIH R35 GM133435 a D.F.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Obiettivo acromatico da 100 mmTHORLABSAC254-100-BBanda larga, 650 - 1.050 nm, lunghezza focale dell'obiettivo acromatico, 100 mm
Filtro passa-banda 20 MHzMinicircuitiBBP-21.4+Filtro passa banda LC concentrato, 19,2 - 23,6 MHz, 50 e Omega;
Lente acromatica da 200 mmTHORLABSAC254-200-BBanda larga, 650 - 1.050 nm, lunghezza focale lente acromatica, 200 mm
Mezza piastra d'onda acromaticaUnion OpticWPA2210-650-1100-M25.4Mezza piastra d'onda a banda larga Quarto d'onda
acromaticoUnion OpticWPA4210-650-1100-M25.4banda larga a quarto di piastra d'onda
THORLABSBSN1110:90 Beamsplitter a piastre
Specchio dicroicoTHORLABSDMSP1000È possibile utilizzare altri dicroici con una lunghezza d'onda centrale di circa 1.000 nm.
DMSO (Dimetilsolfossido)Sigma Aldrich472301Solvente per la calibrazione dello spostamento Raman. Possono essere utilizzati altri solventi con picchi Raman noti.
Modulatore di ampiezza elettrootticoTHORLABSEO-AM-NR-C1Per la modulazione ortogonale e l'imaging a doppio canale sono necessarie due EOM. Si consiglia la versione risonante in modo da poter utilizzare una tensione di pilotaggio inferiore.
Falso H& Script di colorazioneMatlabhttps://github.com/TheFuGroup/HE_Staining
Fanout BufferPRL-414BPulse Research Lab1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer e driver di linea, per generare la frequenza di pilotaggio EOM e il riferimento al
fotodiodo veloceTHORLABSDET10A2Si Detector, 1 ns Rise Time
Frequency DividerPRL-220APulse Research LabDivisore (f/2, f/4, f/8, f/16), per generare 20 MHz dall'uscita laser.
Barre di vetro ad alta dispersioneUnion OpticCYLROD01Lente ad asta H-ZF52A ad alta dispersione 120 mm, lente ad asta SF11 100 mm
Sistema laser Insight DS+Newportin grado di emettere due laser pulsati sincronizzati (un raggio fisso a 1.040 nm e un raggio sintonizzabile, che varia da 680-1.300 nm) con una frequenza di ripetizione di 80 MHz.
Amplificatore Lock-inStrumenti liquidiMoku LabAmplificatore lock-in per estrarre il segnale SRS dal fotodiodo. È possibile utilizzare anche uno Zurich Instrument HF2LI o uno strumento simile.
SpecchiTHORLABSBB05-E03-10Specchio dielettrico a banda larga, 750 - 1.100 nm. Possono essere utilizzati anche specchi d'argento.
Stadio di ritardo motorizzatoZaberX-DMQ12P-DE52Stadio di ritardo per il controllo preciso della sovrapposizione temporale della pompa e dei laser Stokes. Qualsiasi altro stadio motorizzato dovrebbe funzionare.
Condensatore ad immersione in olioNikonCSC10031.4 NA. È possibile utilizzare altri condensatori con NA>1.2.
OscilloscopioTektronix TDS7054Qualsiasi altro oscilloscopio con banda di 400 MHz o superiore dovrebbe funzionare.
SfasatoreSigaTekSF50A2Per lo spostamento della fase della frequenza di modulazione
FotodiodoHamamatsu CorpS3994-01Diodo PIN al silicio con ampia area (10 x 10 cm2). È possibile utilizzare altri diodi con ampia area e bassa capacità.
Beam Splitterpolarizzatore Union OpticPBS9025-620-1000Beamsplitter polarizzatore a banda larga
Refactive Index Databaserefractiveindex.info
Retro-riflettoreEdmund Optics34-408BBAR Prisma ad angolo retto. È possibile utilizzare altri prismi o retroriflettori.
Amplificatore di potenza RFMinicircuitiZHL-1-2W+Blocco di guadagno, 5 - 500 MHz, 50 Ω
Specchi di scansioneCambridge Technologies6215HAbbiamo utilizzato un set di specchi da 5 mm con rivestimento in argento
ScanImageVidrioScanImage Software di controllo delmicroscopio a scansione laser
Filtro passa-cortoTHORLABSFESH1000Filtro passa-corto Premium da 25,0 mm, lunghezza d'onda: 1.000 nm. Per un'efficiente soppressione degli Stokes, potrebbero essere necessari due filtri.
Microscopio verticaleNikonEclipse FN1È possibile utilizzare qualsiasi altro telaio per microscopio. Se è disponibile un microscopio a scansione laser, può essere utilizzato direttamente. In caso contrario, era necessario aggiungere al microscopio uno scanner galvo e una lente di scansione.
Obiettivo ad immersione in acquaOlympusXLPLN25XWMP2 L'obiettivomultifotone 25X ha un NA di 1,05. Altri obiettivi simili possono essere utilizzati.
Campionatore di fasci a lock-in di base

Riferimenti

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