Analisi della proteinuria, infiltrazione renale dei leucociti e deposizione renale di proteine in topi MRL/lpr inclini al lupus

La funzione primaria del rene è l'eliminazione delle sostanze tossiche attraverso l'urina mantenendo l'omeostasi di acqua e sali¹. Questa funzione è minacciata nei pazienti con lupus eritematoso sistemico (LES), che porta alla cosiddetta nefrite da lupus (LN). La LN è una conseguenza del sistema immunitario che attacca il rene, portando a un'infiammazione renale persistente, perdendo quindi la sua capacità di pulire i rifiuti dal sangue e regolare le concentrazioni di sale e liquidi. Questo alla fine porterà a insufficienza renale, che può essere fatale. Durante il processo nefritico, le cellule B circolanti, le cellule T e i monociti vengono reclutati nel rene, secernendo chemochine, citochine e autoanticorpi che formano complessi immunitari. Ciò alla fine si traduce in danno alle cellule endoteliali, lesioni membranose, atrofia tubulare renale e fibrosi².

MRL / Mp-Fas lpr (MRL / ^lpr) topi inclini al lupus sono un modello murino classico che presenta segni clinici simili al lupus che assomigliano al LES umano³. Questo modello è stato determinante per comprendere una delle principali cause di mortalità nei pazienti affetti da LES, la nefrite da lupus (LN)⁴. Sia nel LES umano che in quello murino, la LN è caratterizzata da un'infiammazione graduale innescata dalla deposizione renale di immunocomplessi, seguita dall'attivazione del complemento, dal reclutamento di cellule infiammatorie e dalla perdita della funzionalità renale⁵. La deposizione di immunocomplessi è il primo passo per indurre la produzione di chemochine e citochine da parte delle cellule renali intrinseche, che espande la risposta infiammatoria reclutando cellule immunitarie⁶. L'attuale protocollo presenta diverse tecniche per seguire la progressione della malattia renale che analizzano l'infiltrazione cellulare e la deposizione di complessi immunitari.

L'urina raccolta ogni settimana consente il rilevamento e la visualizzazione del decorso temporale della proteinuria prima, durante e dopo l'insorgenza del lupus. La proteinuria come biomarcatore può determinare la progressione biologica dei LN. Altri vantaggi di questa tecnica sono che non è invasiva, economica e facile da implementare⁷. Quando il rene funziona perfettamente, il livello di proteinuria è costantemente basso; tuttavia, nei topi MRL/LPR, dopo 8-9 settimane di età, si osserva un graduale aumento del livello di proteinuria, che alla fine è abbastanza alto da causare insufficienza renale⁸. Strisce di reagenti multipli e reagenti colorimetrici sono disponibili in commercio per monitorare il problema. Tuttavia, il test di Bradford è economico e molto accurato nel determinare l'insorgenza della proteinuria e il decorso della nefrite da lupus. Questo test è rapido e il reagente non è influenzato dalla presenza di solventi, tamponi, agenti riducenti e agenti chelanti dei metalli che possono essere nel campione 9,10,11.

Un aspetto importante da considerare è l'infiltrazione cellulare nel rene. Questi infiltrati promuovono la patogenesi innescando la secrezione di fattori solubili come le citochine per peggiorare l'infiammazione¹². Per capire meglio quali popolazioni cellulari sono presenti negli infiltrati, un metodo utile è quello di isolare i leucociti¹³. Qui, il rilevamento dell'infiltrazione renale delle cellule B viene utilizzato come esempio. La procedura inizia con un processo di digestione con desossiribonucleasi (DNasi) e collagenasi, seguito dalla separazione del gradiente di densità che rimuove detriti, globuli rossi e granulociti densi. La ragione per isolare le cellule B (CD19+) e le plasmacellule (CD138⁺) è che i reni lupus possono concentrare queste cellule¹⁴. Si suggerisce che la presenza di cellule B in piccoli aggregati nel rene possa indicare l'espansione clonale e, di conseguenza, la produzione di immunoglobuline (Ig). Le plasmacellule sono ben note per essere presenti anche in questi aggregati¹⁵. Una volta isolati i leucociti, la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) può essere utilizzata per analizzare le cellule di interesse dopo la colorazione con diversi anticorpi coniugati a fluorescenza.

L'immunofluorescenza è uno dei metodi di rilevamento dell'immunoistochimica (IHC) che consente la visualizzazione fluorescente delle proteine in campioni di tessuto renale spessi 4 μm. Altri metodi di rilevazione IHC dipendono dalla natura degli analiti, dalla chimica di legame e da altri fattori¹⁶. L'immunofluorescenza è un metodo di identificazione rapida che espone l'antigene alla sua controparte anticorpo marcato con uno specifico fluorocromo (o un colorante fluorescente). Quando è eccitato, produce luce che un microscopio a fluorescenza può rilevare. Questa tecnica può essere utilizzata per osservare la deposizione di complemento C3 e IgG2a¹⁷. Un'eccessiva attivazione a cascata del complemento potrebbe essere associata a una risposta immunitaria incontrollata e alla perdita di funzione¹⁸. La deposizione immunitaria di autoanticorpi anti-DNA a doppio filamento (anti-dsDNA) nel rene è una delle principali preoccupazioni¹⁹, dove quelli con isotipo IgG2a sono stati associati a LN²⁰. In particolare, gli anticorpi anti-dsDNA mostrano maggiore patogenicità e affinità con i materiali nucleari, formando immunocomplessi²¹. Quando IgG2a è presente, la cascata del complemento, incluso C3, viene attivata per eliminare gli immunocomplessi²². I marcatori C3 e IgG2a possono essere quantificati singolarmente o sovrapposti per stabilire la loro correlazione.

In particolare, la misurazione della creatinina sierica è un'altra tecnica affidabile che può essere utilizzata insieme all'ematuria microscopica e alle biopsie renali per diagnosticare LN²³. Tuttavia, la presenza di proteinuria è un forte indicatore di danno glomerulare. In questo senso, il monitoraggio del livello di proteinuria durante il lupus può rilevare l'insorgenza della malattia e integrare altri metodi per diagnosticare il lupus. Inoltre, gli immunocomplessi depositati nei glomeruli possono indurre una risposta infiammatoria, attivare il sistema del complemento e reclutare più cellule infiammatorie. Un altro punto degno di nota di questo protocollo è l'infiltrazione delle cellule B nel rene. Questo, insieme alle cellule T infiltrate, amplifica le risposte immunitarie locali che innescano danni agli organi. È importante sottolineare che la classificazione dei LN non si basa solo sui cambiamenti morfologici glomerulari osservati al microscopio, ma anche sui depositi immunitari osservati con l'immunofluorescenza. Pertanto, in questo protocollo, vengono offerti metodi accurati ed economici per l'analisi della funzionalità renale in ambienti di laboratorio.

Il presente protocollo è approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso la Virginia Tech. Poiché la malattia da lupus ha una maggiore incidenza nelle femmine, sono stati utilizzati solo topi MRL / lpr femmina. La raccolta del campione è iniziata a 4 settimane di età e terminata a 15 settimane. I topi sono stati ottenuti da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali) e sono stati allevati e mantenuti in uno specifico ambiente privo di agenti patogeni seguendo le linee guida istituzionali.

1. Test della proteinuria

1. Raccogli l'urina seguendo i passaggi seguenti.
   1. Sterilizzare il cappuccio spruzzando il 70% di etanolo. Posizionare un foglio di plastica sterile sulla superficie. Preparare punte, provette da 1,5 ml e una pipetta per raccogliere circa 20 μL di liquido.
      NOTA: Le punte e i tubi devono essere sterili e senza alcun pretrattamento.
   2. Prendi la gabbia e spruzza etanolo al 70% prima di metterlo all'interno del cappuccio.
   3. Tenere il mouse con una mano e usare l'altra mano per massaggiare delicatamente l'area ventrale dall'alto verso il basso.
   4. Utilizzare un tubo da 1,5 ml o una pipetta per raccogliere direttamente l'urina o, se il campione cade, raccoglierlo dal foglio di plastica. Usa guanti, lenzuola e punte freschi per ogni campione.
      NOTA: se questo non funziona, utilizzare un becher sterile per isolare il topo, quindi raccogliere l'urina dal becher dopo che il topo ha urinato.
   5. Rimetti il mouse nella gabbia. Estrarre un altro mouse e ripetere i passaggi 1.1.3-1.1.4.
      NOTA: Pulire sempre il foglio di plastica e il becher con etanolo al 70% dopo aver raccolto il campione per ciascun topo. Almeno cinque topi per gruppo sono necessari per la significatività statistica. I campioni di urina possono essere conservati a -80 °C fino all'uso fino a 12 mesi.
2. Quantificare le proteine con il metodo Bradford²⁴.
   1. Lasciare che i campioni di urina, l'albumina standard e il reagente Bradford raggiungano la temperatura ambiente (RT) tenendoli fuori dal congelatore per 10-20 minuti.
      NOTA: il reagente Bradford e lo standard di albumina sono inclusi in un kit disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali). La concentrazione iniziale dello standard di albumina è di 2 mg/ml. Le diluizioni seriali (1: 2 sei volte) devono essere fatte con acqua.
   2. Aggiungere il reagente Bradford a una piastra a 96 pozzetti (200 μL/pozzetto), non diluita.
   3. Pipettare 5 μL di campione di urina non diluita per pozzetto e utilizzare la punta per pipettare su e giù più volte per miscelare correttamente.
   4. Aggiungere gli standard (400, 200, 100, 50, 25, 12,5 mg/dL) in duplicati. Lascia un paio di pozzi come spazi vuoti.
      NOTA: l'aggiunta di campioni e standard deve essere eseguita rapidamente.
   5. Lasciare riposare per 5-10 minuti a RT.
   6. Leggere la piastra a 595 nm in un lettore di piastre secondo il protocollo del produttore (vedere la tabella dei materiali).

2. Isolamento delle cellule renali

1. Eutanasia del topo con CO₂ (portata: 30% -70% volume / min, per ottenere perdita di coscienza o morte) in una camera seguita da lussazione cervicale. Procedere con la dissezione per raccogliere entrambi i reni. Metti un rene e mezzo in un mezzo C10 ghiacciato. Mettere l'altra metà del rene nell'OCT (fase 3.1.1).
   NOTA: C10 è prodotto con RPMI 1640 integrato con siero bovino fetale al 10%, 1 mM di piruvato di sodio, 1% di aminoacidi non essenziali MEM 100x, 10 mM di HEPES, 55 μM di 2-mercaptoetanolo e 100 U / mL di penicillina-streptomicina (vedere Tabella dei materiali).
2. Tagliare i reni in granulometria (1-2 mm³ pezzi) e digerire in 5 ml di tampone digestivo contenente 1 mg/ml di collagenasi e 0,2 mg/ml di DNasi I (vedi Tabella dei materiali) in terreno RPMI 1640 contenente 10 mmol/L di HEPES per 1 ora con agitazione continua e delicata a 37 °C.
   NOTA: Aggiungere 1 mL di tampone digestivo in un tubo sterile da 2 mL e utilizzare forbici sterili per tagliare il rene.
3. Aggiungere 10 ml di 1x PBS ghiacciato contenente 10 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e incubare per 10 minuti su ghiaccio. Quindi vortice la sospensione due volte.
4. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro da 100 μM e lavare con 10 mL di HBSS-pieno.
   NOTA: HBSS-full contiene 5 mM di EDTA, 0,1% BSA e 10 mM di HEPES.
5. Centrifugare a 350 x g per 10 minuti a RT.
6. Preparare la soluzione SIP (Isotonic Percoll) al 30%, 37% e 70%.
   NOTA: Mescolare 1 volume in parte di 10x PBS e 9 parti di volume di Percoll per preparare SIP (vedere Tabella dei materiali); utilizzare HBSS-full per diluire SIP al 30%, 37% e 70% SIP.
7. Risospendere le celle in 5 mL di SIP al 30% e caricare il 37% di 5 mL (in alto) e il 70% di 5 mL (in basso), facendo gradiente SIP, lentamente con una pipetta paster.
8. Centrifugare con Up9 down0 (o freno 0) a 1000 x g per 30 minuti a RT.
9. Raccogliere i leucociti dall'interfaccia 37%-70% e risospenderli in 5 ml di C10.
10. Centrifugare a 350 x g per 10 minuti a 4 °C.
11. Risospendere il pellet cellulare in 3 ml di tampone FACS. Le cellule sono pronte per la colorazione FACS.
    NOTA: il tampone FACS contiene 1x PBS e 0,1% di albumina sierica bovina (BSA).
12. Centrifugare a 350 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante (SN), lasciando circa 50 μL.
    NOTA: Per rimuovere il surnatante, versare con cautela o pipettare la soluzione lontano dal solido o utilizzare un aspiratore semiautomatico per aspirare il surnatante.
13. Aggiungere 50 μL di blocco FcR (vedi Tabella dei materiali) per tubo (prediluito 1/50 in 1x PBS); Mescolare e incubare sul ghiaccio al buio per 10 min.
14. Aggiungere 2 mL di tampone FACS al lavaggio.
15. Centrifugare a 350 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare SN, lasciando circa 50 μL.
16. Aggiungere 20 μL del colorante fluorescente appropriato (diluire 1/100 con 1x PBS, vedere Tabella dei materiali) e lasciare riposare per 15-30 minuti su ghiaccio.
17. Aggiungere 50 μL di miscela di anticorpi 15 per tubo: CD138-BV711 (1/200 in 1x PBS) e CD45-AF700 (1/200 in^1x PBS) (vedere Tabella dei materiali).
18. Incubare su ghiaccio al buio per 15-30 minuti e aggiungere 3 ml di tampone FACS.
19. Centrifugare a 350 x g per 5 minuti a 4 °C e sottovuoto SN, lasciando circa 50 μL. Risospendere in 200 μL di 1x PBS. Questo è ora pronto per essere analizzato mediante citometria a flusso.

3. Colorazione immunofluorescente

1. Eseguire la raccolta di campioni.
   1. Incorporare il mezzo rene nel piccolo criomold di plastica con il composto della temperatura di taglio ottimale (OCT) (vedere la tabella dei materiali).
   2. Aggiungere ghiaccio secco in una scatola di polistirene espanso (vedere Tabella dei materiali) e posizionare con cura il criomold sopra il ghiaccio secco. Assicurarsi che i criostampi siano posizionati in piano.
      NOTA: ci vogliono 3-4 minuti perché il composto OCT si solidifichi e diventi bianco.
   3. Estrarre il criomold e avvolgerlo in un foglio di alluminio. Conservare a -80 °C fino a ulteriore utilizzo.
      NOTA: Può essere conservato a -80 °C per almeno 1 anno.
2. Eseguire il sezionamento e il fissaggio del campione.
   1. Tagliare i campioni in sezioni da 4 μm, attendere almeno 2-3 ore per asciugare, quindi fissare con acetone freddo (a 4 °C) per 10 minuti.
      NOTA: Fare attenzione quando si utilizza l'acetone, che richiede una cappa chimica specializzata.
   2. Dopo aver fissato i vetrini, asciugare all'aria per 0,5-1 h e conservarli per un breve periodo a -20 °C, o a lungo a -80 °C.
3. Macchiare i campioni.
   1. Rifissare i vetrini in acetone freddo per 5-10 minuti.
   2. Lasciare che le sezioni si riscaldino fino a RT. Utilizzare una penna PAP (vedere Tabella dei materiali) attorno alla sezione e lasciarla asciugare.
      NOTA: è possibile utilizzare anche lo smalto per unghie. Questo passaggio impedisce alla diluizione degli anticorpi di galleggiare su tutto il vetrino.
   3. Posizionare i vetrini in 1x soluzione salina Tris-buffered (TBS) nel barattolo Coplin (vedi Tabella dei materiali) per 20 minuti, mettere il barattolo sullo shaker e agitare delicatamente.
   4. Versare 1x TBS e riempire il barattolo con 1x TBS, 5% BSA e 0.1% Tween 20. Incubare per 20 minuti sullo shaker, agitare delicatamente.
   5. Estrarre le diapositive e asciugare il fondo delle diapositive. Se necessario, agitare i vetrini asciutti. Aggiungere 100 μL di anticorpi coniugati²⁵ C3-FITC (1/100) e IgG2a-PE (1/100) alla sezione (vedere Tabella dei materiali). Incubare a RT in camera umidificata per 1 ora.
   6. Lavare la sezione 3 volte in 1x TBS, 5% BSA e 0,1% Tween 20 per 10 minuti sullo shaker.
   7. Agitare i vetrini e montare la sezione con un reagente antisbiadimento (vedi Tabella dei materiali) e poi un coprivetrino.
   8. Conservare i vetrini a 4 °C fino alla visualizzazione al microscopio (ad es. microscopio confocale o microscopio a sistema di imaging). Quantifica le immagini utilizzando il software e sottrai i segnali di sfondo quando confronti l'intensità della fluorescenza tra le regioni.
   9. Per l'analisi delle immagini mediante il software ImageJ (vedere Tabella dei materiali), delineare la regione desiderata.
   10. Impostare i parametri standard facendo clic su Analizza, quindi su Imposta misure e area di misura per ottenere i risultati.
   11. Trasferire i dati ottenuti dalle finestre di misura in un foglio di calcolo.
       NOTA: è possibile selezionare una piccola area dall'immagine come sfondo; Non dovrebbe avere alcuna fluorescenza.
   12. Una volta fatto, fai clic su Analizza per misurare la regione e trasferire nuovamente i dati sul foglio di calcolo precedente.
   13. Ripetere i passaggi 3.3.11-3.3.12 per diverse regioni.
   14. Calcolare la fluorescenza media come Fluorescenza cellulare corretta (CCF) = Densità integrata - (Regione cellulare selezionata x Fluorescenza media di fondo).
   15. Calcola per ogni regione e analizza i dati utilizzando il software grafico e statistico (vedi Tabella dei materiali).

Il protocollo utilizza diversi metodi per valutare i topi MRL / lpr per la nefrite da lupus. In primo luogo, viene descritta una procedura per studiare l'aumento dei livelli di proteinuria a causa della disfunzione renale nel tempo. Come mostrato in Figura 1, topi femmina sono stati trattati con sonda gastrica orale di 200 μL di soluzione salina tamponata fosfato (1x PBS) come gruppo di controllo e probiotico Lactobacillus reuteri come gruppo di trattamento, ad una concentrazione di 109 ufc / ml, due volte a settimana. Il trattamento è iniziato a 3 settimane e si è concluso a 15 settimane. Il gruppo di topi trattati con L. reuteri aveva una progressione della proteinuria più aggressiva rispetto al gruppo di controllo.

Figura 1: Rilevazione dei livelli di proteine nelle urine dei topi MRL/lpr nel tempo. n = 5 topi per gruppo. Le statistiche sono state eseguite con il semplice test di regressione lineare. *P < 0,05, **P < 0,01. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

La figura 2 mostra l'analisi FACS dei leucociti renali isolati. I topi sono stati trattati con vancomicina (2 g / L) o vancomicina più E. coli dsDNA (80 μg) in questo esperimento. La vancomicina è stata somministrata insieme all'acqua potabile durante il periodo di tempo indicato. Il sonda gastrico orale di DNA batterico è stato somministrato ai topi trattati con vancomicina una volta alla settimana per quattro settimane consecutive a 4, 5, 6 e 7 settimane di età. Ci si aspettava che il dsDNA di E. coli innescasse l'infiltrazione renale delle plasmacellule portando a una compromissione della funzionalità renale, ma non è stata trovata alcuna differenza significativa.

Figura 2: Analisi delle plasmacellule in leucociti renali isolati. (A) Strategia di gating sequenziale: cellule totali, cellule singole, cellule vive, cellule CD45+ e infine cellule CD138+. (B) Percentuale di plasmacellule dopo il trattamento con van (Vancomicina) o van + DNA (Vancomicina + E. coli dsDNA) per 3 settimane (n ≥ 5 topi per gruppo). Non è stata osservata alcuna significatività statistica ('ns'). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

La Figura 3 mostra la colorazione con immunofluorescenza del complemento C3 e IgG2a su sezioni renali femminili MRL/lpr. In questo esperimento, l'effetto dei fattori ambientali è stato confrontato per quanto riguarda la deposizione renale di C3 e IgG2a. I topi interni sono stati allevati nella struttura animale per diverse generazioni e sono stati confrontati con topi acquistati di recente da un fornitore. L'analisi immunoistochimica non ha mostrato alcuna differenza tra le diverse strutture.

Figura 3: Rilevazione del complemento C3 e IgG2a nelle sezioni renali mediante colorazione con immunofluorescenza. (A) Immagini rappresentative di sezioni renali colorate con anti-C3-FITC (verde) e anti-IgG2a-PE (rosso). (B) Confronto della fluorescenza cellulare corretta (CCF) tra i due gruppi (n ≥ 5 topi per gruppo). Barra di scala = 100 μM. Non è stata osservata alcuna significatività statistica ('ns'). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Gli autori dichiarano che non vi è conflitto di interessi.