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Articolo metodologico

Analisi della proteinuria, infiltrazione renale dei leucociti e deposizione renale di proteine in topi MRL/lpr inclini al lupus

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DOI:

10.3791/63506

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8 giugno 2022

 , 
1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University

In questo articolo

Sommario

Il presente protocollo descrive un metodo per monitorare la progressione del lupus nei topi. Vengono presentate due procedure aggiuntive per caratterizzare la nefrite da lupus basate sull'infiltrazione cellulare e sulla deposizione di proteine nei reni.

Abstract

Il lupus eritematoso sistemico (LES) è una malattia autoimmune senza cura nota ed è caratterizzata da infiammazione persistente in molti organi, compresi i reni. In tali circostanze, il rene perde la sua capacità di pulire i rifiuti dal sangue e regolare le concentrazioni di sale e liquidi, portando infine a insufficienza renale. Le donne, in particolare quelle in età fertile, vengono diagnosticate nove volte più spesso degli uomini. La malattia renale è la principale causa di mortalità nei pazienti affetti da LES. Il presente protocollo descrive un metodo rapido e semplice per misurare i livelli di proteine escrete nelle urine raccolte, monitorando la progressione del lupus nel tempo. Inoltre, viene fornito un approccio per isolare le cellule mononucleate renali basato sulla selezione delle dimensioni e della densità per studiare l'infiltrazione renale dei leucociti. Inoltre, è stato sviluppato un metodo immunoistochimico per caratterizzare la deposizione proteica nei glomeruli e l'infiltrazione dei leucociti nello spazio tubulointerstiziale. Insieme, questi metodi possono aiutare a studiare la progressione dell'infiammazione cronica associata ai reni dei topi MRL / LPR inclini al lupus.

Introduzione

La funzione primaria del rene è l'eliminazione delle sostanze tossiche attraverso l'urina mantenendo l'omeostasi di acqua e sali1. Questa funzione è minacciata nei pazienti con lupus eritematoso sistemico (LES), che porta alla cosiddetta nefrite da lupus (LN). La LN è una conseguenza del sistema immunitario che attacca il rene, portando a un'infiammazione renale persistente, perdendo quindi la sua capacità di pulire i rifiuti dal sangue e regolare le concentrazioni di sale e liquidi. Questo alla fine porterà a insufficienza renale, che può essere fatale. Durante il processo nefritico, le cellule B circolanti, le cellule T e i monociti vengono reclutati nel rene, secernendo chemochine, citochine e autoanticorpi che formano complessi immunitari. Ciò alla fine si traduce in danno alle cellule endoteliali, lesioni membranose, atrofia tubulare renale e fibrosi2.

MRL / Mp-Fas lpr (MRL / lpr) topi inclini al lupus sono un modello murino classico che presenta segni clinici simili al lupus che assomigliano al LES umano3. Questo modello è stato determinante per comprendere una delle principali cause di mortalità nei pazienti affetti da LES, la nefrite da lupus (LN)4. Sia nel LES umano che in quello murino, la LN è caratterizzata da un'infiammazione graduale innescata dalla deposizione renale di immunocomplessi, seguita dall'attivazione del complemento, dal reclutamento di cellule infiammatorie e dalla perdita della funzionalità renale5. La deposizione di immunocomplessi è il primo passo per indurre la produzione di chemochine e citochine da parte delle cellule renali intrinseche, che espande la risposta infiammatoria reclutando cellule immunitarie6. L'attuale protocollo presenta diverse tecniche per seguire la progressione della malattia renale che analizzano l'infiltrazione cellulare e la deposizione di complessi immunitari.

L'urina raccolta ogni settimana consente il rilevamento e la visualizzazione del decorso temporale della proteinuria prima, durante e dopo l'insorgenza del lupus. La proteinuria come biomarcatore può determinare la progressione biologica dei LN. Altri vantaggi di questa tecnica sono che non è invasiva, economica e facile da implementare7. Quando il rene funziona perfettamente, il livello di proteinuria è costantemente basso; tuttavia, nei topi MRL/LPR, dopo 8-9 settimane di età, si osserva un graduale aumento del livello di proteinuria, che alla fine è abbastanza alto da causare insufficienza renale8. Strisce di reagenti multipli e reagenti colorimetrici sono disponibili in commercio per monitorare il problema. Tuttavia, il test di Bradford è economico e molto accurato nel determinare l'insorgenza della proteinuria e il decorso della nefrite da lupus. Questo test è rapido e il reagente non è influenzato dalla presenza di solventi, tamponi, agenti riducenti e agenti chelanti dei metalli che possono essere nel campione 9,10,11.

Un aspetto importante da considerare è l'infiltrazione cellulare nel rene. Questi infiltrati promuovono la patogenesi innescando la secrezione di fattori solubili come le citochine per peggiorare l'infiammazione12. Per capire meglio quali popolazioni cellulari sono presenti negli infiltrati, un metodo utile è quello di isolare i leucociti13. Qui, il rilevamento dell'infiltrazione renale delle cellule B viene utilizzato come esempio. La procedura inizia con un processo di digestione con desossiribonucleasi (DNasi) e collagenasi, seguito dalla separazione del gradiente di densità che rimuove detriti, globuli rossi e granulociti densi. La ragione per isolare le cellule B (CD19+) e le plasmacellule (CD138+) è che i reni lupus possono concentrare queste cellule14. Si suggerisce che la presenza di cellule B in piccoli aggregati nel rene possa indicare l'espansione clonale e, di conseguenza, la produzione di immunoglobuline (Ig). Le plasmacellule sono ben note per essere presenti anche in questi aggregati15. Una volta isolati i leucociti, la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) può essere utilizzata per analizzare le cellule di interesse dopo la colorazione con diversi anticorpi coniugati a fluorescenza.

L'immunofluorescenza è uno dei metodi di rilevamento dell'immunoistochimica (IHC) che consente la visualizzazione fluorescente delle proteine in campioni di tessuto renale spessi 4 μm. Altri metodi di rilevazione IHC dipendono dalla natura degli analiti, dalla chimica di legame e da altri fattori16. L'immunofluorescenza è un metodo di identificazione rapida che espone l'antigene alla sua controparte anticorpo marcato con uno specifico fluorocromo (o un colorante fluorescente). Quando è eccitato, produce luce che un microscopio a fluorescenza può rilevare. Questa tecnica può essere utilizzata per osservare la deposizione di complemento C3 e IgG2a17. Un'eccessiva attivazione a cascata del complemento potrebbe essere associata a una risposta immunitaria incontrollata e alla perdita di funzione18. La deposizione immunitaria di autoanticorpi anti-DNA a doppio filamento (anti-dsDNA) nel rene è una delle principali preoccupazioni19, dove quelli con isotipo IgG2a sono stati associati a LN20. In particolare, gli anticorpi anti-dsDNA mostrano maggiore patogenicità e affinità con i materiali nucleari, formando immunocomplessi21. Quando IgG2a è presente, la cascata del complemento, incluso C3, viene attivata per eliminare gli immunocomplessi22. I marcatori C3 e IgG2a possono essere quantificati singolarmente o sovrapposti per stabilire la loro correlazione.

In particolare, la misurazione della creatinina sierica è un'altra tecnica affidabile che può essere utilizzata insieme all'ematuria microscopica e alle biopsie renali per diagnosticare LN23. Tuttavia, la presenza di proteinuria è un forte indicatore di danno glomerulare. In questo senso, il monitoraggio del livello di proteinuria durante il lupus può rilevare l'insorgenza della malattia e integrare altri metodi per diagnosticare il lupus. Inoltre, gli immunocomplessi depositati nei glomeruli possono indurre una risposta infiammatoria, attivare il sistema del complemento e reclutare più cellule infiammatorie. Un altro punto degno di nota di questo protocollo è l'infiltrazione delle cellule B nel rene. Questo, insieme alle cellule T infiltrate, amplifica le risposte immunitarie locali che innescano danni agli organi. È importante sottolineare che la classificazione dei LN non si basa solo sui cambiamenti morfologici glomerulari osservati al microscopio, ma anche sui depositi immunitari osservati con l'immunofluorescenza. Pertanto, in questo protocollo, vengono offerti metodi accurati ed economici per l'analisi della funzionalità renale in ambienti di laboratorio.

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Protocollo

Il presente protocollo è approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso la Virginia Tech. Poiché la malattia da lupus ha una maggiore incidenza nelle femmine, sono stati utilizzati solo topi MRL / lpr femmina. La raccolta del campione è iniziata a 4 settimane di età e terminata a 15 settimane. I topi sono stati ottenuti da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali) e sono stati allevati e mantenuti in uno specifico ambiente privo di agenti patogeni seguendo le linee guida istituzionali.

1. Test della proteinuria

  1. Raccogli l'urina seguendo i passaggi seguenti.
    1. Sterilizzare il cappuccio spruzzando il 70% di etanolo. Posizionare un foglio di plastica sterile sulla superficie. Preparare punte, provette da 1,5 ml e una pipetta per raccogliere circa 20 μL di liquido.
      NOTA: Le punte e i tubi devono essere sterili e senza alcun pretrattamento.
    2. Prendi la gabbia e spruzza etanolo al 70% prima di metterlo all'interno del cappuccio.
    3. Tenere il mouse con una mano e usare l'altra mano per massaggiare delicatamente l'area ventrale dall'alto verso il basso.
    4. Utilizzare un tubo da 1,5 ml o una pipetta per raccogliere direttamente l'urina o, se il campione cade, raccoglierlo dal foglio di plastica. Usa guanti, lenzuola e punte freschi per ogni campione.
      NOTA: se questo non funziona, utilizzare un becher sterile per isolare il topo, quindi raccogliere l'urina dal becher dopo che il topo ha urinato.
    5. Rimetti il mouse nella gabbia. Estrarre un altro mouse e ripetere i passaggi 1.1.3-1.1.4.
      NOTA: Pulire sempre il foglio di plastica e il becher con etanolo al 70% dopo aver raccolto il campione per ciascun topo. Almeno cinque topi per gruppo sono necessari per la significatività statistica. I campioni di urina possono essere conservati a -80 °C fino all'uso fino a 12 mesi.
  2. Quantificare le proteine con il metodo Bradford24.
    1. Lasciare che i campioni di urina, l'albumina standard e il reagente Bradford raggiungano la temperatura ambiente (RT) tenendoli fuori dal congelatore per 10-20 minuti.
      NOTA: il reagente Bradford e lo standard di albumina sono inclusi in un kit disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali). La concentrazione iniziale dello standard di albumina è di 2 mg/ml. Le diluizioni seriali (1: 2 sei volte) devono essere fatte con acqua.
    2. Aggiungere il reagente Bradford a una piastra a 96 pozzetti (200 μL/pozzetto), non diluita.
    3. Pipettare 5 μL di campione di urina non diluita per pozzetto e utilizzare la punta per pipettare su e giù più volte per miscelare correttamente.
    4. Aggiungere gli standard (400, 200, 100, 50, 25, 12,5 mg/dL) in duplicati. Lascia un paio di pozzi come spazi vuoti.
      NOTA: l'aggiunta di campioni e standard deve essere eseguita rapidamente.
    5. Lasciare riposare per 5-10 minuti a RT.
    6. Leggere la piastra a 595 nm in un lettore di piastre secondo il protocollo del produttore (vedere la tabella dei materiali).

2. Isolamento delle cellule renali

  1. Eutanasia del topo con CO2 (portata: 30% -70% volume / min, per ottenere perdita di coscienza o morte) in una camera seguita da lussazione cervicale. Procedere con la dissezione per raccogliere entrambi i reni. Metti un rene e mezzo in un mezzo C10 ghiacciato. Mettere l'altra metà del rene nell'OCT (fase 3.1.1).
    NOTA: C10 è prodotto con RPMI 1640 integrato con siero bovino fetale al 10%, 1 mM di piruvato di sodio, 1% di aminoacidi non essenziali MEM 100x, 10 mM di HEPES, 55 μM di 2-mercaptoetanolo e 100 U / mL di penicillina-streptomicina (vedere Tabella dei materiali).
  2. Tagliare i reni in granulometria (1-2 mm3 pezzi) e digerire in 5 ml di tampone digestivo contenente 1 mg/ml di collagenasi e 0,2 mg/ml di DNasi I (vedi Tabella dei materiali) in terreno RPMI 1640 contenente 10 mmol/L di HEPES per 1 ora con agitazione continua e delicata a 37 °C.
    NOTA: Aggiungere 1 mL di tampone digestivo in un tubo sterile da 2 mL e utilizzare forbici sterili per tagliare il rene.
  3. Aggiungere 10 ml di 1x PBS ghiacciato contenente 10 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e incubare per 10 minuti su ghiaccio. Quindi vortice la sospensione due volte.
  4. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro da 100 μM e lavare con 10 mL di HBSS-pieno.
    NOTA: HBSS-full contiene 5 mM di EDTA, 0,1% BSA e 10 mM di HEPES.
  5. Centrifugare a 350 x g per 10 minuti a RT.
  6. Preparare la soluzione SIP (Isotonic Percoll) al 30%, 37% e 70%.
    NOTA: Mescolare 1 volume in parte di 10x PBS e 9 parti di volume di Percoll per preparare SIP (vedere Tabella dei materiali); utilizzare HBSS-full per diluire SIP al 30%, 37% e 70% SIP.
  7. Risospendere le celle in 5 mL di SIP al 30% e caricare il 37% di 5 mL (in alto) e il 70% di 5 mL (in basso), facendo gradiente SIP, lentamente con una pipetta paster.
  8. Centrifugare con Up9 down0 (o freno 0) a 1000 x g per 30 minuti a RT.
  9. Raccogliere i leucociti dall'interfaccia 37%-70% e risospenderli in 5 ml di C10.
  10. Centrifugare a 350 x g per 10 minuti a 4 °C.
  11. Risospendere il pellet cellulare in 3 ml di tampone FACS. Le cellule sono pronte per la colorazione FACS.
    NOTA: il tampone FACS contiene 1x PBS e 0,1% di albumina sierica bovina (BSA).
  12. Centrifugare a 350 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante (SN), lasciando circa 50 μL.
    NOTA: Per rimuovere il surnatante, versare con cautela o pipettare la soluzione lontano dal solido o utilizzare un aspiratore semiautomatico per aspirare il surnatante.
  13. Aggiungere 50 μL di blocco FcR (vedi Tabella dei materiali) per tubo (prediluito 1/50 in 1x PBS); Mescolare e incubare sul ghiaccio al buio per 10 min.
  14. Aggiungere 2 mL di tampone FACS al lavaggio.
  15. Centrifugare a 350 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare SN, lasciando circa 50 μL.
  16. Aggiungere 20 μL del colorante fluorescente appropriato (diluire 1/100 con 1x PBS, vedere Tabella dei materiali) e lasciare riposare per 15-30 minuti su ghiaccio.
  17. Aggiungere 50 μL di miscela di anticorpi 15 per tubo: CD138-BV711 (1/200 in 1x PBS) e CD45-AF700 (1/200 in1x PBS) (vedere Tabella dei materiali).
  18. Incubare su ghiaccio al buio per 15-30 minuti e aggiungere 3 ml di tampone FACS.
  19. Centrifugare a 350 x g per 5 minuti a 4 °C e sottovuoto SN, lasciando circa 50 μL. Risospendere in 200 μL di 1x PBS. Questo è ora pronto per essere analizzato mediante citometria a flusso.

3. Colorazione immunofluorescente

  1. Eseguire la raccolta di campioni.
    1. Incorporare il mezzo rene nel piccolo criomold di plastica con il composto della temperatura di taglio ottimale (OCT) (vedere la tabella dei materiali).
    2. Aggiungere ghiaccio secco in una scatola di polistirene espanso (vedere Tabella dei materiali) e posizionare con cura il criomold sopra il ghiaccio secco. Assicurarsi che i criostampi siano posizionati in piano.
      NOTA: ci vogliono 3-4 minuti perché il composto OCT si solidifichi e diventi bianco.
    3. Estrarre il criomold e avvolgerlo in un foglio di alluminio. Conservare a -80 °C fino a ulteriore utilizzo.
      NOTA: Può essere conservato a -80 °C per almeno 1 anno.
  2. Eseguire il sezionamento e il fissaggio del campione.
    1. Tagliare i campioni in sezioni da 4 μm, attendere almeno 2-3 ore per asciugare, quindi fissare con acetone freddo (a 4 °C) per 10 minuti.
      NOTA: Fare attenzione quando si utilizza l'acetone, che richiede una cappa chimica specializzata.
    2. Dopo aver fissato i vetrini, asciugare all'aria per 0,5-1 h e conservarli per un breve periodo a -20 °C, o a lungo a -80 °C.
  3. Macchiare i campioni.
    1. Rifissare i vetrini in acetone freddo per 5-10 minuti.
    2. Lasciare che le sezioni si riscaldino fino a RT. Utilizzare una penna PAP (vedere Tabella dei materiali) attorno alla sezione e lasciarla asciugare.
      NOTA: è possibile utilizzare anche lo smalto per unghie. Questo passaggio impedisce alla diluizione degli anticorpi di galleggiare su tutto il vetrino.
    3. Posizionare i vetrini in 1x soluzione salina Tris-buffered (TBS) nel barattolo Coplin (vedi Tabella dei materiali) per 20 minuti, mettere il barattolo sullo shaker e agitare delicatamente.
    4. Versare 1x TBS e riempire il barattolo con 1x TBS, 5% BSA e 0.1% Tween 20. Incubare per 20 minuti sullo shaker, agitare delicatamente.
    5. Estrarre le diapositive e asciugare il fondo delle diapositive. Se necessario, agitare i vetrini asciutti. Aggiungere 100 μL di anticorpi coniugati25 C3-FITC (1/100) e IgG2a-PE (1/100) alla sezione (vedere Tabella dei materiali). Incubare a RT in camera umidificata per 1 ora.
    6. Lavare la sezione 3 volte in 1x TBS, 5% BSA e 0,1% Tween 20 per 10 minuti sullo shaker.
    7. Agitare i vetrini e montare la sezione con un reagente antisbiadimento (vedi Tabella dei materiali) e poi un coprivetrino.
    8. Conservare i vetrini a 4 °C fino alla visualizzazione al microscopio (ad es. microscopio confocale o microscopio a sistema di imaging). Quantifica le immagini utilizzando il software e sottrai i segnali di sfondo quando confronti l'intensità della fluorescenza tra le regioni.
    9. Per l'analisi delle immagini mediante il software ImageJ (vedere Tabella dei materiali), delineare la regione desiderata.
    10. Impostare i parametri standard facendo clic su Analizza, quindi su Imposta misure e area di misura per ottenere i risultati.
    11. Trasferire i dati ottenuti dalle finestre di misura in un foglio di calcolo.
      NOTA: è possibile selezionare una piccola area dall'immagine come sfondo; Non dovrebbe avere alcuna fluorescenza.
    12. Una volta fatto, fai clic su Analizza per misurare la regione e trasferire nuovamente i dati sul foglio di calcolo precedente.
    13. Ripetere i passaggi 3.3.11-3.3.12 per diverse regioni.
    14. Calcolare la fluorescenza media come Fluorescenza cellulare corretta (CCF) = Densità integrata - (Regione cellulare selezionata x Fluorescenza media di fondo).
    15. Calcola per ogni regione e analizza i dati utilizzando il software grafico e statistico (vedi Tabella dei materiali).

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Risultati

Il protocollo utilizza diversi metodi per valutare i topi MRL / lpr per la nefrite da lupus. In primo luogo, viene descritta una procedura per studiare l'aumento dei livelli di proteinuria a causa della disfunzione renale nel tempo. Come mostrato in Figura 1, topi femmina sono stati trattati con sonda gastrica orale di 200 μL di soluzione salina tamponata fosfato (1x PBS) come gruppo di controllo e probiotico Lactobacillus reuteri come gruppo di trattamento, ad una concentrazione di...

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Discussione

La LN è una delle principali cause di mortalità nei pazienti affetti da LES e i fattori che aggravano la malattia rimangono poco chiari. L'applicazione di questo protocollo è quella di caratterizzare la funzione renale utilizzando molteplici metodi, tra cui la misurazione della proteinuria, l'analisi FACS di leucociti renali isolati e la colorazione con immunofluorescenza di sezioni renali congelate.

Un punto importante da considerare durante la raccolta dell'urina è che si deve essere coerent...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano che non vi è conflitto di interessi.

Ringraziamenti

Ringraziamo la Flow Cytometry Core Facility, il Laboratorio di Istopatologia, il Fralin Imaging Center presso il Virginia Polytechnic Institute e la State University per il supporto tecnico. Questo lavoro è supportato da vari NIH e sovvenzioni interne.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
10x soluzione salina tamponata Tris (TBS)Thermo Fisher ScientificJ60764. K2
2-mercaptoetanoloThermo Fisher Scientific21985-023
Anti-umano/topo C3CedarlaneCL7632F
Anti-topo CD138 BV711Biolegend142519
Anti-topo CD45 AF700Biolegend103127
Siero bovino AlbuminaSigma-AldrichA9418-100G
Collagenasi DSigma-Aldrich11088882001
Microscopio confocale LSM 880ZeissLSM 880
Barattolo CoplinFisher Scientific50-212-281
CryomoldFisher ScientificNC9511236
Gradiente di densità medioGE Healthcare17-1440-02Percoll
DEPC-Acqua trattataThermo Fisher ScientificAM9906
DNasi ISigma-AldrichD4527
dsDNA-ECInvivoGentlrl-ecdna
Acido etilendiamminotetraaceticoFisher ScientificS311-500EDTA
EVOS M5000 Sistema di imaging per microscopioThermo Fisher ScientificAMF5000
FACS Fusion Selezionatore cellulareBD Biosciencesbovino FACS Fusion
- Premium, R& R inattivato a caldo Sistemi DS11150H
Fisherbrand Piastre in polistirene a 96 pozzettiFisher Scientific12-565-501
PrismaGraphPadN/A
Hank' s Soluzione salina bilanciataThermo Fisher Scientific14175-079
HEPESThermo Fisher Scientific15630-080
Software ImageJNational Institutes of HealthN/A
Lactobacillus reuteri Kandler et al.ATCC23272
MEM aminoacidi non essenzialiThermo Fisher Scientific11140-050
MRL/MpJ-Fas lpr /J Topi (MRL/lpr)Jackson Lab485
Smalto per unghieN/AN/AQualsiasi
composto OCTTisse-Tek4583
PAP penSigma-AldrichZ377821
Stampi per inclusione monouso Peel-A-WayPolysciencesR-30
Penicillina-StreptomicinaThermo Fisher Scientific15140-122
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Thermo Fisher Scientific70011069
Pierce 20x TBS BufferThermo Fisher Scientific28358
Kit di test Pierce Coomassie Plus (Bradford)Thermo Fisher Scientific23236Albumina standard inclusa
ProLon Gold Antifade MountantThermoFisherP36934
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32BD Biosciences553141Blocco FcR
RPMI 1640Thermo Fisher Scientific11875-093
Piruvato di sodioThermo Fisher Scientific11360-070
SpectraMax M5Molecular DevicesN/ASoftware SoftMax Pro 6.1
Filtri per cellule sterili 100 &; micro; MFisher Scientific22363549
Tween 20Fisher ScientificBP337-500
Vancomicina cloridratoGoldbioV-200-1
Zombie AquaBiolegend423102colorante fluorescente per analisi di citometria a flusso
Siero fetale convenzionale

Riferimenti

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