Questo protocollo descrive come costruire un sistema a catena di polimerasi a flusso continuo basato su un chip microfluidico e come costruire un sistema di elettroforesi capillare in laboratorio. Presenta un metodo semplice per l'analisi degli acidi nucleici in laboratorio.
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Articolo metodologico
Amplificazione di Escherichia coli in un chip microfluidico PCR a flusso continuo e sua rilevazione con un sistema di elettroforesi capillare
In questo articolo
Sommario
Abstract
La reazione a catena della polimerasi (PCR) è un metodo tradizionale impiegato per l'amplificazione di un gene bersaglio che ha svolto un ruolo importante nella diagnostica biomolecolare. Tuttavia, la PCR tradizionale richiede molto tempo a causa dell'efficienza di variazione della bassa temperatura. Questo lavoro propone un sistema di PCR a flusso continuo (CF-PCR) basato su un chip microfluidico. Il tempo di amplificazione può essere notevolmente ridotto facendo scorrere la soluzione PCR in un microcanale posto su riscaldatori impostati a temperature diverse. Inoltre, poiché l'elettroforesi capillare (CE) è un modo ideale per differenziare i prodotti PCR positivi da quelli falsi positivi, è stato costruito un sistema CE per ottenere una separazione efficiente dei frammenti di DNA. Questo documento descrive il processo di amplificazione di Escherichia coli (E. coli) da parte del sistema CF-PCR costruito internamente e la rilevazione dei prodotti PCR da parte di CE. I risultati dimostrano che il gene bersaglio di E. coli è stato amplificato con successo entro 10 minuti, indicando che questi due sistemi possono essere utilizzati per la rapida amplificazione e rilevamento degli acidi nucleici.
Introduzione
La reazione a catena della polimerasi (PCR) è una tecnica di biologia molecolare utilizzata per amplificare specifici frammenti di DNA, amplificando così tracce di DNA centinaia di milioni di volte. È stato ampiamente utilizzato nella diagnosi clinica, nella ricerca medica, nella sicurezza alimentare, nell'identificazione forense e in altri campi. Il processo di PCR consiste principalmente in tre fasi: denaturazione a 90-95 °C, ricottura a 50-60 °C ed estensione a 72-77 °C. Il ciclo termico è una parte importante del processo di PCR; tuttavia, il termociclatore PCR tradizionale non è solo ingombrante ma anche inefficiente, richiedendo circa 40 minuti per completare 2....
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Protocollo
NOTA: Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, i reagenti e le apparecchiature utilizzati in questo protocollo.
1. Fabbricazione del chip microfluidico CF-PCR
- Riscaldare il wafer di silicio a 200 °C per 25 minuti per rimuovere l'umidità.
- Erogare 1 mL di fotoresist SU-8-2075 per pollice del wafer. Centrifugarlo sul wafer di silicio utilizzando uno spin coater a 500 giri/min per 5-10 s con un'accelerazione di 100 giri/min, e poi a 2.000 giri/min per 30 s con un'accelerazione di 500 giri/min/s.
- Cuocere il wafer di silicio a 65 °C per 3 minuti, p....
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Risultati
La Figura 5 rappresenta l'elettroferogramma dei prodotti della PCR e dei marcatori del DNA. La traccia (Figura 5A) è il risultato CE del prodotto amplificato CF-PCR, la traccia (Figura 5B) è il risultato CE del prodotto amplificato dal ciclo termico e la traccia (Figura 5C) è il risultato CE della scala del DNA a 100 bp. Per prima cosa abbiamo amplificato il gene bersaglio di E. coli nel sistem.......
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Discussione
Sia la PCR che la CE sono due biotecnologie popolari nell'analisi degli acidi nucleici. Questo documento descrive l'amplificazione di E. coli e la rilevazione dei prodotti PCR utilizzando i sistemi CF-PCR e CE, entrambi costruiti internamente. Il gene bersaglio di E. coli è stato amplificato con successo entro 10 minuti a causa delle elevate velocità di trasferimento del calore. I frammenti di DNA più piccoli di 1.500 bp sono stati separati entro 8 minuti (Figura 5). Il gra.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Commissione per la Scienza e la Tecnologia della Municipalità di Shanghai, in Cina (n. 19ZR1477500 e n. 18441900400). Riconosciamo con gratitudine il sostegno finanziario dell'Università di Shanghai per la scienza e la tecnologia (No.2017KJFZ049).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| scala DNA 100 bp | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 10x Tampone Rapido I | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| 10x TBE | Pechino Solarbio Scienza & Fornitore verificato - Technology Co., Ltd. | T1051 | |
| Alfa Aesar, USA | Miscela dNTP L15459 | ||
| (2,5 μ M) | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| EC-F | Sangon Biotech, Shanghai, Cina | ||
| EC-R | Sangon Biotech, Shanghai, Cina | ||
| HEC, 1300K | Sigma-Aldrich, USA | 9004-62-0 | |
| isopropanolo | Aladino, Shanghai, Cina | 67-63-0 | |
| microscopio | Olimpo, Giappone | BX51 | |
| fotolitografia nbsp; | SUSS MicroTec, Germania | MJB4 | |
| Hamamatsu Photonics, Giappone | R928 | ||
| fotoresist | MicroChem, USA | SU-8 2075 | |
| Regolatori di temperatura PID | Shanghai, Cina | Pulitore al plasma XH-W2023 | |
| Harrick Plasma | PDC-32G-2 | ||
| polivinilpirrolidone (PVP) | Aladdin, Shanghai, Cina | pompa P110608 | |
| Harvard Apparatus | PHD2000 | ||
| tubi in silicone | BIO-RAD, USA | ||
| relè a stato solido | KZLTD, Cina | KS1-25LA | |
| SpeedSTAR HS DNA Polimerasi | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| ago in acciaio | zhongxinqiheng,Suzhou,Cina | ||
SYBR GREEN  | Solarbio, Pechino, Cina | Sensori di temperatura SY1020 | |
| Tecnologia EasyShining, Chengdu, Cina | TCM-M207 | ||
| Modello (E. coli) | Takara Bio Inc. | AK601 | |
| Tween 20 | Aladdin, Shanghai, Cina | T104863 | |
| tensione di alimentazione | Medina, NY, STATI UNITI | TREK MODELLO 610E |
Riferimenti
- Li, Z., et al. All-in-one microfluidic device for on-site diagnosis of pathogens based on an integrated continuous flow PCR and electrophoresis biochip. Lab on a Chip. 19 (16), 2663-2668 (2019).
- Crews, N., Wittwer, C., Gale, B.
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Ristampe e permessi
