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Articolo metodologico

Inattivazione di agenti patogeni tramite fotolisi in luce visibile della riboflavina-5′-fosfato

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DOI:

10.3791/63531

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6 aprile 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biotechnology, Ming Chuan University, 2Department of Tourism and Leisure, Hsing Wu University, 3Department of Science Education and Application, National Taichung University of Education, 4Department of Soil and Environmental Sciences, National Chung Hsing University

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per inattivare i batteri patogeni con specie reattive dell'ossigeno prodotte durante la fotolisi del mononucleotide flavina (FMN) sotto irradiazione di luce blu e viola di bassa intensità. La fotolisi FMN ha dimostrato di essere un metodo semplice e sicuro per i processi sanitari.

Abstract

Riboflavina-5'-fosfato (o flavina mononucleotide; FMN) è sensibile alla luce visibile. Vari composti, comprese le specie reattive dell'ossigeno (ROS), possono essere generati dalla fotolisi FMN dopo irradiazione con luce visibile. I ROS generati dalla fotolisi FMN sono dannosi per i microrganismi, compresi i batteri patogeni come lo Staphylococcus aureus (S. aureus). Questo articolo presenta un protocollo per disattivare S. aureus, ad esempio, attraverso reazioni fotochimiche che coinvolgono FMN sotto irradiazione di luce visibile. L'anione radicale superossido () generato durante la fotolisi FMN viene valutato mediante riduzione del tetrazolio nitro blu (figure-abstract-1NBT). La vitalità microbica di S. aureus attribuita alle specie reattive figure-abstract-2 è stata utilizzata per determinare l'efficacia del processo. Il tasso di inattivazione batterica è proporzionale alla concentrazione di FMN. La luce viola è più efficiente nell'inattivare S. aureus rispetto all'irradiazione di luce blu, mentre la luce rossa o verde non guida la fotolisi FMN. Il presente articolo dimostra la fotolisi FMN come metodo semplice e sicuro per i processi sanitari.

Introduzione

La riboflavina-5′-fosfato (FMN) è formata dalla fosforilazione nella posizione della riboflavina 5' della catena laterale del ribitil ed è richiesta da tutte le flavoproteine per numerosi processi cellulari per generare energia. Svolge anche il ruolo di vitamina per alcune funzioni nel corpo umano1. FMN è circa 200 volte più solubile in acqua rispetto alla riboflavina2.

L'inattivazione fotodinamica antibatterica (aPDI) dei batteri è un modo efficace per controllare la resistenza ai batteri 3,4 perché non dipende dalla modalità di resistenza batterica. Clinicamente, aPDI è usato per trattare le infezioni dei tessuti molli al fine di ridurre l'infezione della pelle nosocomiale dovuta a batteri multi-resistenti 5,6,7,8,9. aPDI produce anche morte cellulare generando specie reattive dell'ossigeno (ROS). I ROS, come i radicali superossido (), l'ossigeno singoletto, i radicali ossidrilici (figure-introduction-1•OH) e i radicali perossilici, sono radicali liberi o molecole che contengono ossigeno reattivo 10,11,12 e sono normalmente reattivi 13. Simile al danno al DNA causato dai ROS, la perossidazione della membrana e la distruzione delle cellule endoteliali sono anche reazioni biochimiche avverse che sono attribuite ai ROS nelle cellule12.

L'uso di aPDI per batteri patogeni coinvolge una sorgente di luce visibile o UV per inattivare i microrganismi in presenza di composti chimici, come il cloruro di metiltioninio 14, PEI-ce6 coniugato 15, porfirina 16, biossido di titanio17, blu di toluidina O 18 e nanoparticelle di ossido di zinco 19. Il blu di toluidina O e il blu di metilene sono coloranti fenotiazinici e il blu di metilene ha proprietà tossiche. Le nanoparticelle di ossido di zinco e l'irradiazione UV sono collegate a effetti negativi sulla salute e sull'ambiente. Pertanto, lo sfruttamento di un fotosensibilizzatore affidabile, sicuro e semplice tramite fotolisi sotto irradiazione visibile merita ulteriori studi.

Il micronutriente, riboflavina o FMN, non è tossico ed è infatti utilizzato per la produzione o l'alimentazione alimentare20. Sia l'FMN che la riboflavina sono altamente sensibili all'irradiazione luminosa2. Sotto UV 1,2,21,22,23 e irradiazione di luce blu10,24, questi due composti raggiungono uno stato eccitato. La riboflavina attivata o FMN prodotta dalla fotolisi viene promossa al suo stato di tripletto e i ROS vengono generati simultaneamente 2,25. Kumar et al. hanno riferito che la riboflavina attivata dalla luce UV provoca selettivamente un aumento delle lesioni alla porzione guanina del DNA nei microrganismi patogeni26. Sotto irradiazione mediante luce UV, è stato dimostrato che la riboflavina attivata fotodinamicamente promuove la generazione di 8-OH-dG, che è un biomarcatore per lo stress ossidativo, nel DNA27 a doppio filamento. È stato riportato che S. aureus ed E. coli sono disattivati da ROS durante la riboflavina o la fotolisi FMN10,24,28. Uno studio precedente degli autori ha dimostrato che le reazioni fotolitiche che coinvolgono riboflavina e FMN riducono il viola cristallino, un colorante triarilmetano e un agente antibatterico che genera figure-introduction-2ed eliminano la maggior parte della capacità antimicrobica del viola cristallino28. Quando la flavina adenina dinucleotide o FMN viene irradiata dalla luce blu, i ROS risultanti producono apoptosi nelle cellule HeLa per il loro avvelenamento in vitro29. Utilizzando il trattamento fotochimico in presenza di riboflavina, Cui et al. inattivano i linfociti inibendo la loro proliferazione e produzione di citochine30.

La fotolisi della riboflavina viene utilizzata per l'inattivazione dell'agente patogeno del sangue da UV 10,24, ma i componenti del sangue possono essere compromessi sotto irradiazione di luce UV30. È stato anche riportato che le piastrine esposte ai raggi UV migliorano progressivamente le prestazioni dei marcatori di attivazione P-selectina e LIMP-CD63 sulle loro membrane. La citotossicità dei raggi UV e dell'irradiazione ad alta intensità deve essere studiata e un fotosensibilizzatore che sia semplice e sicuro durante una fotoreazione FMN che coinvolge la luce visibile sarebbe di grande utilità.

La luce di lunghezze d'onda più corte ha più energia ed è molto più probabile che causi gravi danni alle cellule. Tuttavia, in presenza di un fotosensibilizzatore adatto, l'irradiazione con luce viola a bassa intensità può inibire i microrganismi patogeni. La fotosensibilizzazione e la generazione di FMN quando irradiato con luce violetta è quindi importante da studiare, al fine di figure-introduction-3 determinare la via attraverso la quale i ROS da fotolisi FMN aumentano l'inattivazione dei batteri.

Il controllo antimicrobico è un problema comune e lo sviluppo di nuovi antibiotici richiede spesso decenni. Dopo l'irradiazione con luce viola, la fotoinattivazione intermediata dalla FMN può annientare i batteri patogeni ambientali. Questo studio presenta un efficace protocollo antimicrobico in vitro che utilizza la luce viola per guidare la fotolisi FMN e quindi generare figure-introduction-4 aPDI. La vitalità microbica di S. aureus viene utilizzata per determinare la fattibilità dell'aPDI indotta da FMN.

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Protocollo

1. Configurazione del sistema di fotolisi

  1. Montare sei diodi emettitori di luce (LED) (DC 12 V) all'interno di un bicchiere di plastica opaca (8 cm x 7 cm) come mostrato nella Figura 1 per stabilire un sistema di fotolisi31.
  2. Aggiungere i reagenti (vedi sotto) nelle provette di vetro (13 mm di diametro e 100 mm di altezza) e fissare le provette nella parte superiore della tazza come mostrato nella figura 1. Posizionare la configurazione sperimentale in una stanza con una temperatura costante di 25 ± 3 °C.
  3. Monitorare e registrare la temperatura delle unità di prova durante le reazioni fotolitiche mediante un termometro a infrarossi.
    NOTA: La Figura 2 mostra gli spettri di emissione per le luci blu, verdi, rosse e viola, registrate utilizzando uno spettrometro ottico UV-Vis calibrato. Le lunghezze d'onda corrispondenti al massimo di assorbanza per le luci LED blu, verdi, rosse e viola utilizzate nello studio sono rispettivamente 465, 529, 632 e 405 nm. I chip LED possono riscaldare l'apparecchio durante gli esperimenti di irradiazione. L'intero sistema di fotoreazione in ogni esperimento è stato quindi collocato in una stanza dove la temperatura è stata mantenuta costante a 25 ± 3 °C.

2. L'effetto della lunghezza d'onda della luce sulla fotolisi della FMN (Figura 3)

  1. Preparare una soluzione di 0,1 mM FMN in tampone fosfato di potassio (PB) da 100 mM (pH 7,8). Esporre campioni FMN (3 ml ciascuno) a luce blu, verde, rossa o viola ad un'intensità di 10 W/m2 per 5 minuti. Tenere 3 mL di soluzione FMN al buio come controllo.
  2. Registrare l'assorbanza dei campioni FMN irradiati nell'intervallo 250-750 nm utilizzando uno spettrofotometro UV/visibile.

3. Metodo di riduzione del tetrazolio blu nitro (NBT) da rilevare figure-protocol-1 (Figura 4).

NOTA: Il metodo di riduzione NBT utilizzato qui è stato leggermente modificato dal test per la fotoreazione della riboflavina. Il metodo di riduzione NBT viene utilizzato per valutare il livello generato figure-protocol-2 dalla fotolisi FMN. L'FMN fotochimicamente eccitato viene prima ridotto dalla L-metionina in un semichinone, che poi dona un elettrone all'ossigeno dando origine a figure-protocol-331. L'as-generato figure-protocol-4 riduce NBT a formazan, che ha una caratteristica assorbanza a 560 nm32.

  1. Aggiungere 109,3 mg di L-metionina a 73,3 ml di PB (100 mM; pH 7,8). Vortex la soluzione per sciogliere la L-metionina.
  2. Dopo che la L-metionina è completamente sciolta, aggiungere 10 mg di polvere NBT e 1,53 ml di 0,117 mM FMN alla soluzione. Per ogni 1 mL della soluzione di reazione (cioè una miscela di FMN, L-metionina e NBT) applicata, le concentrazioni finali di FMN, metionina e NBT sono rispettivamente 2,4 x 10-6 M, 1,0 x 10-2 M e 1,6 x 10-4 M.
  3. Esporre la soluzione di reazione (1 ml) all'irradiazione luminosa LED blu o viola a 10 W/m2 per 1-5 minuti.
  4. Rilevare la figure-protocol-5 specie (dall'assorbanza a 560 nm) prodotta dalla reazione fotochimica, che riduce NBT e produce formazan.

4. Vitalità di S. aureus dopo fotolisi FMN (Figura 5)

  1. Trasmettere una colonia di S. aureus (BCRC 10451) da una piastra coltivata in 10 ml di brodo lisogenico prelevato in una provetta con tappo a vite da 15 ml. Coltura in agitatore a 37 °C per 16 h.
  2. Trasferire 0,5 mL di coltura in una provetta da centrifuga da 1,5 mL. Aggiungere acqua sterilizzata nel tubo della centrifuga per diluire la coltura a una densità ottica di 0,5 a 600 nm (OD600) (~6 x 107 CFU/mL).
  3. Trasferire 0,5 mL di coltura in una provetta da centrifuga da 1,5 ml, centrifugare a 14.000 x g per 10 minuti e decantare il surnatante per ottenere un pellet cellulare.
  4. Aggiungere 1 mL di soluzione tamponata FMN (30, 60 e 120 μM FMN in PB) ai pellet cellulari ottenuti come al punto 4.3 e al vortice. Per il controllo irradiato, aggiungere 1 mL di PB da solo.
  5. Trasferire 1 mL ciascuna di soluzioni cellulari batteriche vitali contenenti 30 μM FMN e PB da sole in tubi di vetro e irradiarle con luce violetta a 10 W/m2 per 30 minuti.
  6. Trasferire 1 ml ciascuno di soluzioni cellulari batteriche vitali contenenti 30, 60 e 120 μM FMN e PB da soli in tubi di vetro e irradiarli con luce blu a 20 W / m2 per 120 minuti. Installare un altro tubo di vetro con 1 mL di soluzione di cellule batteriche vitali contenente 120 μM FMN e irradiarlo con luce blu a 20 W / m2 per 60 minuti.
  7. Installare le provette come descritto nei passaggi 4.5 e 4.6 e coprirle con fogli di alluminio spessi. Questi tubi fungono da controlli oscuri.
  8. Conservare la camera di irradiazione (così come i controlli di oscurità) in una cella frigorifera a 9 ± 1 °C durante il periodo di irradiazione di 30-120 minuti.
    NOTA: Il calore rilasciato dalle luci a LED non può essere ignorato in quanto i chip LED posti all'interno della tazza possono riscaldare il sistema di fotoreazione durante gli esperimenti di irradiazione. Gli esperimenti sono stati quindi condotti in una cella frigorifera mantenuta a 9 ± 1 °C.
  9. Dopo irradiazione, trasferire 0,2 mL da ciascuna delle soluzioni di reazione su una piastra di agar Luria (LA). Distribuire i batteri sulla piastra con una bacchetta di vetro a forma di L e incubare per una notte a 37 °C.
  10. Calcolare il conteggio delle piastre vitali e i tassi di inattivazione di S. aureus dopo la crescita durante la notte.
    NOTA: Il tasso di inattivazione di S. aureus è calcolato come riduzione percentuale, che è pari a [1 -I / D] ×100%, dove I e D denotano, rispettivamente, il numero di CFU nel campione irradiato e il controllo di oscurità. La riduzione percentuale è definita come un valore negativo del tasso di inattivazione.

5. Rilevamento di figure-protocol-6 in S. aureus (Figura 6)

  1. Preparare i campioni di S. aureus come descritto al punto 4.
  2. Diluire la densità batterica dei campioni con acqua sterilizzata ad una densità ottica di 0,5 a 600 nm (OD600, ~6 x 106 CFU/mL). Trasferire 0,5 mL di coltura in una provetta da centrifuga da 1,5 mL. Centrifugare a 14.000 x g per 10 minuti e decantare il surnatante per ottenere un pellet cellulare.
  3. Aggiungere 0,1093 g di L-metionina, 0,1 g di NBT e 25 ml di FMN (400, 240 o 120 μM) a 75 ml di PB. Per ogni 1 mL del reagente applicato, le concentrazioni finali di FMN, metionina e NBT sono rispettivamente 100 (60 o 30) x 10-6 M, 7,3 x 10-3 M e 1,2 x 10-3 M.
  4. Aggiungere 1 mL di ciascuna soluzione di reagente (cioè con concentrazioni di FMN variabili) ai pellet cellulari ottenuti come al punto 5.2. Irradiare le soluzioni mediante luce violetta a 10 W/m2 per 10 min.
  5. Centrifugare la miscela a 14.000 x g per 10 minuti e decantare il surnatante. Risospendere il pellet in 1 mL di dimetilsolfossido (DMSO) per estrarre l'NBT ridotto. Rilevare le specie prodotte figure-protocol-7 dall'assorbanza a 560 nm.

6. Analisi statistica

  1. Esprimere i dati come media ± deviazione standard (SD) di tre test indipendenti.
  2. Applicare un t-test omoscedasticostico, a due campioni, per valutare se due misurazioni sono diverse. Valori p < 0,05 sono considerati statisticamente significativi.

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Risultati

Effetto della lunghezza d'onda della luce sulla FMN
Gli spettri di assorbanza di 0,1 mM FMN irradiati utilizzando LED blu, verdi, rossi e viola sono mostrati nella Figura 3. Ci sono due picchi per FMN (372 nm e 444 nm) per il controllo scuro. La luce verde e rossa non ha alcun effetto perché i cambiamenti negli spettri sono insignificanti. D'altra parte, la rispettiva assorbanza di FMN a 444 nm è ridotta di circa il 19% e il 34%, rispettivamente, dopo irradiazione di luce...

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Discussione

Un fotosensibilizzatore aumenta la reazione fotochimica dei composti chimici per generare ROS. I microrganismi patogeni possono essere inattivati dall'irradiazione luminosa in presenza di fotosensibilizzatori. Questo studio determina l'aPDI di S. aureus a causa di ROS generati dall'irradiazione di luce violetta di un fotosensibilizzatore esogeno, FMN.

Come mostrato nella figura 3, per FMN, l'assorbanza a 444 nm si riduce significativamente dopo 5 minuti d...

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Dichiarazioni

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Gli autori sono grati al Dr. Tak-Wah Wong e al Sig. Zong-Jhe Hsieh per il loro sostegno agli esperimenti.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Luci LED blu, verdi e rosseVita LED Technologies Co., Tainan, TaiwanDC 12 V 5050
Dimetil solfossidoSigma-Aldrich, St. Louis, MO190186
Termometro a infrarossiRaytek Co. Santa Cruz, CAMT4
LB brodoDifco Co., NJ
L-metioninaSigma-Aldrich, St. Louis, MO1.05707
NBTBio Basic, Inc. Markham, Ontario, Canada
AlimentatoreChina tech Co., New Taipei City, TaiwanYP30-3-2
Riboflavina 5′-fosfatoSigma-Aldrich, St. Louis, MOR7774
RNaseNew England BioLabs, Inc. Ipswich, MA
Misuratore di energia solareTenmars Electronics Co., Taipei, TaiwanTM-207
Staphylococcus aureus subsp. aureusBioresource Collection and Research Center (BCRC), Hsinchu, Taiwan10451
Spettrometro ottico UV-VisOcean Optics, Dunedin, FLUSB4000
Spettrofotometro UV-VisHitachi High-Tech Science Corporation, Tokyo, GiapponeU-2900
LED violaLong-hui Electronic Co., LTD, Dongguan, Cina

Riferimenti

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