Articolo metodologico

Bioreattore guidato da imaging per la generazione di tessuto delle vie aeree bioingegnerizzato

DOI:

10.3791/63544

⸱

6 aprile 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Stevens Institute of Technology, 2Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 3Department of Cell Biology, State University of New York Downstate Medical Center, 4Department of Cardiothoracic Surgery, Stanford University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il protocollo descrive un bioreattore abilitato all'imaging che consente la rimozione selettiva dell'epitelio endogeno dalla trachea di ratto e la distribuzione omogenea di cellule esogene sulla superficie del lume, seguita da una coltura in vitro a lungo termine del costrutto cellula-tessuto.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lesioni ripetute al tessuto delle vie aeree possono compromettere la funzione polmonare e causare malattie polmonari croniche, come la broncopneumopatia cronica ostruttiva. I progressi nella medicina rigenerativa e nelle tecnologie dei bioreattori offrono l'opportunità di produrre tessuti funzionali cresciuti in laboratorio e costrutti di organi che possono essere utilizzati per lo screening di farmaci, modelli di malattie e sostituzioni di tessuti ingegnerizzate. Qui viene descritto un bioreattore miniaturizzato accoppiato con una modalità di imaging che consente la visualizzazione in situ del lume interno della trachea di ratto espiantata durante la manipolazione e la coltura dei tessuti in vitro . Utilizzando questo bioreattore, il protocollo dimostra la rimozione selettiva guidata dall'imaging di componenti cellulari endogeni preservando le caratteristiche biochimiche intrinseche e l'ultrastruttura della matrice tissutale delle vie aeree. Inoltre, vengono mostrati il rilascio, la distribuzione uniforme e la successiva coltura prolungata di cellule esogene sul lume delle vie aeree decellularizzato con monitoraggio ottico in situ . I risultati evidenziano che il bioreattore guidato dall'imaging può potenzialmente essere utilizzato per facilitare la generazione di tessuti funzionali in vitro delle vie aeree.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La superficie luminale delle vie respiratorie è rivestita da uno strato di epitelio costituito principalmente da cellule staminali multi-ciliate, club, calici e basali 1,2. Lo strato epiteliale funge da meccanismo di difesa primario del polmone, agendo come una barriera biofisica che protegge il tessuto delle vie aeree sottostante da agenti patogeni inalati, particolato o gas chimici. Protegge il tessuto delle vie aeree attraverso molteplici meccanismi, tra cui la formazione di giunzioni strette intercellulari, la clearance mucociliare e la secrezione antimicrobica e antiossidante

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il protocollo sui tessuti animali di seguito è stato approvato dalle linee guida e dai regolamenti sul benessere degli animali dell'Institute for Animal Care and Use Committee (IACUC) presso lo Stevens Institute of Technology ed è conforme alle linee guida del National Institutes of Health (NIH) per l'uso di animali da esperimento.

1. Progettazione e costruzione di bioreattori per trachee di ratto guidati da imaging

  1. Progettazione e fabbricazione di bioreattori di trachea di ratto
    1. Creare un modello CAD (Computer-Aided Design) della camera del bioreattore con progettazione pertinente, ad esempio ingressi, us....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La modalità di imaging in situ basata su lenti GRIN può consentire la visualizzazione del lume interno tracheale in situ (Figura 5A). Utilizzando questo metodo di imaging, è possibile ottenere sia immagini a campo luminoso che fluorescenti delle trachee native e deepilelializzate (Figura 5B,C). Nessun segnale fluorescente è stato osservato dalla trachea nativa prima dell'etichettatura CFSE (Figura 5Bii

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In questo lavoro, abbiamo creato un bioreattore guidato dall'imaging che può consentire (i) il monitoraggio del lume della trachea in situ dopo la rimozione cellulare e la consegna esogena delle cellule e (ii) la coltura in vitro a lungo termine del tessuto tracheale seminato dalle cellule. Utilizzando questo bioreattore personalizzato, abbiamo dimostrato (i) la rimozione selettiva delle cellule epiteliali endogene dal lume della trachea utilizzando detergenti e lavaggio delle vie aeree assistito da vib.......

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questa ricerca è stata sostenuta in parte dall'American Thoracic Society Foundation Research Program, dalla New Jersey Health Foundation e dalla National Science Foundation (CAREER Award 2143620) a J.K.; e il National Institutes of Health (P41 EB027062) al G.V.N.

....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1&volte; PBSGibco, Thermo Fisher Scientific10-010-031
Connettore a 3 porteWorld Precision Instruments14048-20
Connettore a 4 porteWorld Precision Instruments14047-10
AccelerometroSTMicroelectronicsIIS3DWBTR
Doppietto acromaticoThorlabsAC254-150-A-ML
Alluminio tronchettoTED PELLA16111
Antibiotico-antimicoticoThermo Fisher Scientific15240062
Asta di montaggioThorlabsER1
Viti a testa bombataMcMaster-Carr91255A274
Cubo a gabbiaThorlabsC4W
Nastro biadesivo conduttivo in carbonioTED PELLA16073
Kit di etichettatura CFSEAbcamab113853
Citrisolv (agente di pulizia)Decon1061
Adattatore C-mountThorlabsSM1A9
Collagene IAdvanced BioMatrix5153
Vernice liquida conduttiva all'argentoTED PELLA16034
Specchio dicroicoSemrockDI03-R488Lunghezze d'onda del laser riflesso:  473,0 +- 2 nm 488,0 +3/-2 nm
Eagle's modified Eagle' di Dulbecco s mediumGibco, Thermo Fisher Scientific 11965118
Adattatore femmina luer da paratia a portagommaCole-ParmerEW-45501-30
Femmina luer a tubolareCole-ParmerEW-45508-03
Connettore luer femmina-maschioCole-ParmerZY-45508-80
Siero fetale bovinoGibco, Thermo Fisher Scientific10082147
Lente filtranteChroma Technology CorpET535/50m
Microscopio fluorescenteNikonEclipse E1000 - D
Fusion 360Dado
McMaster-Carr91813A160
Esametiltililazano (HMDS)Fisher ScientifcAC120585000
Fibra di imagingSELFOC, NSG gruppoGRIN lente
LaserOpto EngineMDL-D-488-150mW
Tubi lentiThorlabsSM1L40
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen)Thermo Fisher ScientificL3224
MACH 3 CNC Control SoftwareNewfangled Solutions
ObiettivoOlympusUCPLFLN20X
Pompa peristalticaCole ParmerL/S sistema
FGF-basic umano ricombinantePeproTech100-18B
Anello di ritegnoThorlabsSM1RR
Scientific CMOS cameraPCO Panda PCOPanda 4.2
Sodio dodecil solfatoVWR97064-472
Solidworks ( 2019)Dassault Systè mes
Tubo dell'obiettivo impilabileThorlabsSM1L10
Amplificatore a piastra subwooferDayton AudioSPA250DSP
Altoparlante subwooferDayton AudioRSS21OHO-4Diametro del diaframma: 21 cm
Pompa a siringaWorld Precision InstrumentsAL-4000
Piastra a gabbia filettataThorlabsCP33
Adattatore luer filettatoCole-ParmerEW-45513-81
Lente del tuboThorlabsAC254-150-A-ML
Tygon TubingCole-Parmer13-200-110
XY TraduttoreThorlabsCXY1
esagonale Autodesk di pompaggio digitale standard

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. The Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
  2. Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. Optimization of N....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Rigenerazione dei tessuti delle vie aereeimaging in situdecellularizzazione della tracheacellule staminali mesenchimalisomministrazione di cellule idrogelmicroscopia a fluorescenzamodellizzazione delle malattieingegneria tissutale

Articoli correlati