Questo protocollo mostra come ottenere una "impronta digitale" spettrometrica di massa della cardiolipina leucocitaria per la diagnosi della sindrome di Barth. La valutazione dell'elevato rapporto tra monolisocardiolipina e cardiolipina discrimina i pazienti con sindrome di Barth dai pazienti con insufficienza cardiaca di controllo con sensibilità e specificità al 100%.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Fingerprinting Cardiolipin nei leucociti mediante spettrometria di massa per una diagnosi rapida della sindrome di Barth
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La cardiolipina (CL), un fosfolipide dimerico che trasporta quattro catene di acidi grassi nella sua struttura, è il marcatore lipidico dei mitocondri, in cui svolge un ruolo cruciale nel funzionamento della membrana interna. Il suo metabolita monolysocardiolipin (MLCL) è fisiologicamente quasi assente nell'estratto lipidico delle cellule animali e il suo aspetto è il segno distintivo della sindrome di Barth (BTHS), una malattia genetica rara e spesso mal diagnosticata che causa una grave cardiomiopatia nell'infanzia. Il metodo qui descritto genera una "impronta digitale cardiolipina" e consente un semplice dosaggio dei livelli relativi delle specie CL e MLCL nei profili lipidici cellulari. Nel caso dei leucociti, è necessario solo 1 mL di sangue per misurare il rapporto MLCL/CL tramite ionizzazione laser di desorbimento assistita da matrice - tempo di volo/spettrometria di massa (MALDI-TOF/MS) entro appena 2 ore dal prelievo di sangue. Il test è semplice e può essere facilmente integrato nel lavoro di routine di un laboratorio di biochimica clinica per lo screening per BTHS. Il test mostra una sensibilità e una specificità al 100% per BTHS, rendendolo un test diagnostico adatto.
Introduzione
La sindrome di Barth (BTHS) è una rara malattia legata all'X caratterizzata da cardiomiopatia ad esordio precoce, miopatia del muscolo scheletrico, ritardo della crescita, neutropenia, disfunzione variabile della catena respiratoria mitocondriale e struttura mitocondriale anormale 1,2,3,4,5. BTHS ha una prevalenza di un caso per milione di maschi con attualmente meno di 250 casi noti in tutto il mondo, anche se è ampiamente accettato che la malattia è sottodiagnosticata 2,6
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Campioni di sangue di donatori sani e pazienti con insufficienza cardiaca sono stati raccolti presso l'Ospedale Policlinico di Bari (Italia), mentre campioni di pazienti BTHS sono stati ottenuti dalla clinica BTHS del Servizio Sanitario Nazionale del Regno Unito presso il Bristol Royal Hospital for Children (Regno Unito). Sono stati ottenuti il consenso informato scritto di donatori, pazienti e genitori sani (se del caso) e le approvazioni dei rispettivi comitati etici.
NOTA: Se non utilizzato immediatamente, il sangue (in tubo gel K-EDTA) può essere conservato a 4 °C per un massimo di 24-48 ore.
1. Isolame....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
In questo studio è stato descritto un metodo semplice e rapido per isolare i leucociti da 1 mL di sangue intero e ottenere l'impronta digitale CL mediante MALDI-TOF/MS (vedere Figura 2). La Figura 3 mostra il confronto tra l'impronta digitale CL rappresentativa dei leucociti, ottenuta da soggetti di controllo e giovani ragazzi BTHS, nell'intervallo di massa CL e MLCL (m/z). La Tabella 1 elenca le specie CL e MLCL rilevate in questi spet.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
La sindrome di Barth è un errore congenito del metabolismo e una condizione che cambia la vita che è probabile che sia sotto-diagnosticata 2,6. Come accennato in precedenza, un fattore che contribuisce può essere la mancanza di un test diagnostico semplice. Qui, è stato descritto un metodo semplice e veloce per misurare il rapporto MLCL / CL da MALDI-TOF / MS nei leucociti per lo screening BTHS. Inoltre, gli spettrometri di massa MALDI-TOF sono ampiamente di.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Tutti gli autori dichiarano che lo studio è stato condotto in assenza di qualsiasi relazione commerciale o finanziaria che potrebbe essere interpretata come un potenziale conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Siamo grati alle persone con BTHS e alle loro famiglie per aver partecipato alla nostra ricerca. Ringraziamo la Barth Syndrome Foundation US e il Barth Syndrome UK Trust per il loro sostegno e per aver aiutato con la raccolta dei campioni di sangue all'incontro annuale a Bristol. Questo studio è stato finanziato da Barth Syndrome Foundation US, Barth Italia Onlus e Regione Puglia.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1,1′,2,2′-tetratetradecanoyl cardiolipina | Avanti Polar Lipids | 750332 | Lipid standard per la calibrazione MALDI-TOF |
| 1,1′ 2,2′-tetra- (9Z-ottadecenoil) cardiolipina | Avanti Polar Lipids | 710335 | Standard lipidico per la calibrazione MALDI-TOF |
| 1,2-di- (9Z-esadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolammina | Avanti Polar Lipids | 878130 | Standard lipidico per la calibrazione MALDI-TOF |
| 1,2-ditetradecanoyl-sn-glicero-3-phosphate | Avanti Polar Lipids | 830845 | Standard lipidico per la calibrazione MALDI-TOF |
| 1,2-ditetradecanoil-sngliccero-3-fosfo-(1′-rac-glicerolo) | Avanti Polar Lipids | 840445 | Standard lipidico per la calibrazione MALDI-TOF |
| 1,2-ditetradecanoyl-sn-glicero-3-fosfo-L-serina | Avanti Polar Lipids | 840033 | Lipid standard per la calibrazione MALDI-TOF |
| 2-Propanolo, reagente ACS, ≥ 99,5% | Merck Life Science S.r.l. | ||
| 9-Aminoacridina emiidrato, 98% | Acros Organics | 134410010 | |
| Acetonitrile, reagente ACS, ≥ 99,5% | Merck Life Science S.r.l. | ||
| Cloroformio, reagente ACS, ≥ 99,8% | Merck Life Science S.r.l. | ||
| destrano da Leuconostoc spp. Mr 450.000-650.000 | Merck Life Science S.r.l. | 31392 | |
| Analisi della flessione 3.3 | Bruker Daltonics | Software | |
| Spettrometro di massa MALDI-TOF Microflex LRF | Bruker Daltonics | ||
| Microsoft Excel | Microsoft Office | Software | |
| OmniPur 10X PBS Concentrato liquido | Merck Life Science S.r.l. | 6505-OP | |
| Cloruro di potassio, reagente ACS, 99,0-100,5% | Merck Life Science S.r.l. | P3911 | |
| Cloruro di sodio, reagente ACS, ≥ 99,0% | Merck Life Science S.r.l. | S9888 |
Riferimenti
- Barth, P. G., et al. X-linked cardioskeletal myopathy and neutropenia (Barth syndrome): respiratory-chain abnormalities in cultured fibroblasts. Journal of Inherited Metabolic Disease. 19 (2), 157-160 (1996).
- Steward, C. G., et al.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
