Qui descriviamo una caratterizzazione proteomica basata sulla spettrometria di massa di linee cellulari con destini tissutali noti nell'embrione vertebrato di Xenopus laevis .
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Articolo metodologico
Proteomica della spettrometria di massa guidata da livrea cellulare nell'embrione in via di sviluppo (rana)
In questo articolo
Sommario
Abstract
La caratterizzazione degli eventi molecolari quando le cellule danno origine a tessuti e organi aumenta il potenziale per comprendere meglio lo sviluppo normale e progettare rimedi efficaci per le malattie. Le tecnologie che consentono l'identificazione e la quantificazione accurate di diversi tipi e di un gran numero di proteine fornirebbero informazioni ancora mancanti sui meccanismi molecolari che orchestrano lo sviluppo di tessuti e organismi nello spazio e nel tempo. Qui, presentiamo un protocollo basato sulla spettrometria di massa che consente la misurazione di migliaia di proteine in linee cellulari identificate in embrioni di Xenopus laevis (rana). L'approccio si basa su mappe riproducibili del destino cellulare e metodi consolidati per identificare, etichettare, tracciare e campionare in modo fluorescente le cellule e la loro progenie (cloni) da questo modello di sviluppo dei vertebrati. Dopo aver raccolto il contenuto cellulare utilizzando il microcampionamento o isolando le cellule mediante dissezione o selezione cellulare attivata dalla fluorescenza, le proteine vengono estratte e processate per l'analisi proteomica bottom-up. La cromatografia liquida e l'elettroforesi capillare vengono utilizzate per fornire una separazione scalabile per il rilevamento e la quantificazione delle proteine con spettrometria di massa ad alta risoluzione (HRMS). Vengono forniti esempi rappresentativi per la caratterizzazione proteomica delle cellule adipose del tessuto neurale. La proteomica HRMS guidata dalla linea cellulare è adattabile a diversi tessuti e organismi. È sufficientemente sensibile, specifico e quantitativo per scrutare le dinamiche spazio-temporali del proteoma durante lo sviluppo dei vertebrati.
Introduzione
La nostra comprensione della differenziazione cellulare e della genesi di tessuti e organi è il risultato di decenni di elaborati screening mirati di geni e dei loro prodotti. Aumentare la nostra conoscenza di tutte le biomolecole e delle loro quantità durante importanti eventi cellulari aiuterebbe a svelare i meccanismi molecolari che controllano il modello spaziale e temporale del piano corporeo dei vertebrati. Le tecnologie che consentono l'amplificazione molecolare e il sequenziamento sono ora in grado di riferire regolarmente su un gran numero di geni e trascrizioni, supportando studi basati su ipotesi nella ricerca biologica e traslazionale di base. Per comprend....
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Protocollo
Tutti i protocolli che garantiscono il mantenimento e la manipolazione umana delle rane adulte di Xenopus laevis sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Università del Maryland, College Park (numeri di approvazione R-DEC-17-57 e R-FEB-21-07).
1. Preparare le soluzioni
- Per l'embriologia
- Preparare 1x, 0,5x e 0,2x la soluzione di Steinberg (SS), quindi sterilizzarli in autoclave (120 °C per 20 min) fino alla sterilità seguendo i protocolli standard12.
- Preparare il 3% (p/v) di Ficoll in 1x SS sterilizzato seguendo i p....
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Risultati
Questo protocollo ha permesso lo studio delle proteine nelle singole cellule e dei loro lignaggi mentre stabiliscono i tessuti negli embrioni di X. laevis. La Figura 1 illustra una di queste applicazioni dell'approccio per studiare le proteine nelle cellule fatali del tessuto neurale e l'ectoderma neurale appena indotto nell'embrione. Come mostrato nella Figura 1A, il flusso di lavoro bioanalitico ha integrato gli strumenti tradizionali della biologia c.......
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Discussione
Questo protocollo consente la caratterizzazione dell'espressione proteica in linee cellulari identificate in embrioni della specie Xenopus . Derivando dalla HRMS, la metodologia combina una squisita specificità nell'identificazione molecolare, capacità di rilevamento multi-proteina senza sonde molecolari (di solito centinaia o migliaia di proteine diverse) e una capacità di quantificazione. L'adattabilità agli strumenti e ai flussi di lavoro classici nella (neuro)biologia cellulare e dello sviluppo espande la pr.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Siamo grati a Jie Li (University of Maryland, College Park) per le preziose discussioni sulla dissociazione embrionale e sulla FACS. Ringraziamo Vi M. Quach e Camille Lombard-Banek per l'assistenza nella preparazione dei campioni e nella raccolta dei dati in studi precedenti che esemplificano le applicazioni proteomiche evidenziate in questo protocollo. Parti di questo lavoro sono state sostenute dalla National Science Foundation con il numero di premio IOS-1832968 CAREER (a P.N.), dal National Institutes of Health con il numero di premio R35GM124755 (a P.N.), dall'Università del Maryland-National Cancer Institute Partnership Program (a P.N.) e dai premi di ricerca de....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acetonitrile (grado LC-MS) | Fisher Scientific | A955 | |
| Agarosio | ThermoFisher Scientific | R0492 | |
| Bicarbonato di ammonio | Fisher Scientific | A643-500 | |
| Colonna analitica | Thermo Scientific | 164941 | |
| Microbilancia analitica | Mettler-Toledo | XSE105DU | |
| Piattaforma automatica di frazionamento dei peptidi | Agilent | 1260 Infinity II | |
| Capillari borosilicati | Sutter Instruments Co. | B100-50-10 | |
| Capillari borosilicati (per la realizzazione di emettitori) | Sutter Instruments | B100-75-10 | |
| C18 colonne di rotazione (per desalinizzazione) | ThermoFisher Scientific | 89870 | |
| Telecamera ro monitor elettrospray Edmund | Optics Inc. | EO-2018C | |
| Combretastatina A4 | Millipore Sigma | C7744 | |
| Sistema CESI commerciale | AB SCIEX | CESI | |
| (Acido cicloesilammino)-1-propansulfonico (CAPS) | VWR | 97061-492 | |
| Citocalasina D | Millipore Sigma | C8273 | |
| Destrano, Alexa Fluor 488; 10.000 MW, Anionico, TermoFisher fissabile | Scientific | D22910 | |
| Diotiotreitolo | Fisher Scientific | FERR0861 | |
| Dumont #5 Pinze | Strumenti per la scienza | 11252-30 | |
| EDTA | Fisher Scientific | AAJ62786AP | |
| Sorgente luminosa per epifluorescenza | Lumencore | AURA III | |
| Eppendorf LoBing per microcentrifuga provette: proteina | Fisher Scientific | 13-698-793 | |
| Acido formico (grado LC-MS) | Fisher Scientific | A117-50 | |
| Congelatore (-20 ° C) | Fisher Scientific | 97-926-1 | |
| Congelatore (-80 ° C) | Thermo Scientific | TSX40086A | |
| Capillare in silice fusa | Molex 1088150596 | ||
| Heat Block Benchmark | BSH300 | ||
| Sistema di cromatografia liquida ad alta pressione | ThermoFisher Scientific | Dionex Ultimate 3000 RSLC nanosystem | |
| Alimentatore ad alta tensione | Spellman | CZE1000R | |
| Spettrometro di massa ad alta risoluzione | ThermoFisher Scientific | Orbitrap Fusion Spettrometro | |
| Tappi HPLC | Thermo Scientific | C4013-40A | |
| Fiale HPLC | Thermo Scientific | C4013-11 | |
| Illuminatore, ad es. Colli d'oca | Nikon | C-FLED2 | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | ||
| Iodoacetammide | Fisher Scientific | AC122275000 | |
| Metanolo (grado LC-MS) | Fisher Scientific | A456 | |
| Metanolo (grado LC-MS) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| Estrattore microcapillare | Suttor Instruments | P-2000 | |
| Microiniettore | Warner Instrument, Handem, CT | PLI-100A | |
| Estrattore Micropippette | Sutter Instruments Co. | P-1000 | |
| MS, software di | ProteomeDiscoverer | ||
| MS, sostituto opensource | MaxQuant | ||
| non-idet 40 | Millipore Sigma | 11754599001 | |
| piastra Petri 60 mm e 80 mm | Fisher Scientific | S08184 | |
| Pierce 10 µ Letto a L Zip-tips (per la desalinizzazione) | ThermoFisher Scientific | 87782 | |
| Kit per il dosaggio delle proteine dell'acido bicinconnico Pierce | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Saggio quantitativo del peptide colorimetrico Pierce | ThermoFisher Scientific | 23275 | |
| Pierce Trypsin Protease (grado MS) | Fisher Scientific | PI90058 | |
| Fiale | per proteine LoBindEppendorf | 0030108434 , | |
| Eppendorf | 5430R | incubatore | |
| refrigerato | Thermo Scientific | PR505755R/3721 | |
| isotionato di sodio | Millipore Sigma | 220078 | |
| pirofosfato di sodio | Sigma Aldrich | 221368-100G | |
| Fiala BGE in acciaio inossidabile | Fiale | ||
| Stereomicroscopio su misura | |||
| (obiettivo 10x) | Nikon | SMZ 1270, SZX18 | |
| Saccarosio | VWR | 97063-790 | |
| Pompe a siringa (2) | Apparato Harvard | 704506 | |
| Siringhe (a tenuta di gas): 500– 1000 µ L | Hamilton | 1750TTL | |
| Pipette di trasferimento (plastica, monouso) | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Trap Column | Thermo Scientific | 164750 | |
| Tris-HCl (soluzione 1 M) | Fisher Scientific | AAJ22638AP | |
| Concentratore sottovuoto in grado di funzionare a 4– 10 ° C | Labconco | 7310022 | |
| Vortex-mixer | Benchmark | BS-VM-1000 | |
| Acqua (grado LC-MS) | Fisher Scientific | W6 | |
| Acqua (grado LC-MS) | Fisher Scientific | W6 | |
| Stadio di traslazione XYZ | Thorlabs | PT3 | |
| XYZ Costruito | su misura |
Riferimenti
- Shoemaker, L. D., Kornblum, H. I. Neural Stem Cells (NSCs) and Proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 344-354 (2016).
- Cervenka, J., et al. Proteomic characterization of human neural stem cells and their ....
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Ristampe e permessi
