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Articolo metodologico

Mappe micorriziche come strumento per esplorare i modelli di colonizzazione e le strategie fungine nelle radici di Festuca rubra e Zea mays

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DOI:

10.3791/63599

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26 agosto 2022

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Faculty of Agriculture, University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine Cluj-Napoca

In questo articolo

Sommario

Il protocollo qui descrive i metodi per la valutazione dei modelli di colonizzazione micorrizica arbuscolare e la strategia nelle radici per due specie: Zea mays e Festuca rubra. L'uso del metodo MycoPatt consente il calcolo dei parametri, la conversione delle strutture micorriziche in dati digitali e la mappatura della loro posizione reale nelle radici.

Abstract

I funghi micorrizici arbuscolari sono simbionti nelle radici delle piante. Il loro ruolo è quello di sostenere lo sviluppo dell'ospite e mantenere l'equilibrio nutrizionale negli ecosistemi. Il processo di colonizzazione dipende da diversi fattori come l'ecologia del suolo, la diversità genetica dei funghi e dell'ospite e le pratiche agronomiche. La loro azione sincronizzata porta allo sviluppo di una complessa rete ifica e porta allo sviluppo secondario di vescicole e arbuscoli nelle cellule radicali. Lo scopo di questa ricerca è stato quello di analizzare l'efficienza del metodo MycoPatt (pattern micorrizici) per il posizionamento di strutture fungine nelle radici di Festuca rubra e Zea mays. Un altro obiettivo era quello di esplorare la strategia di colonizzazione fungina come rivelato dalle mappe micorriziche di ciascuna specie. L'acquisizione e l'assemblaggio di più immagini microscopiche consentono la valutazione della colonizzazione micorrizica sia nelle piante di mais che in quelle di festuca rossa per fornire informazioni sulla posizione realistica delle strutture sviluppate. I pattern micorrizici osservati evidenziano l'efficienza variabile di ogni pianta in termini di sviluppo di connessioni con funghi simbiotici del suolo, causati da trattamenti applicati e fase di crescita. Le mappe dettagliate micorriziche ottenute attraverso il metodo MycoPatt sono utili per la diagnosi precoce dell'efficienza delle piante nell'acquisizione simbiotica dal suolo.

Introduzione

I funghi micorrize arbuscolari (AM) sono una categoria di endofiti del suolo che sono costantemente un'area di interesse per i ricercatori. La loro presenza nelle radici della maggior parte delle piante e il loro coinvolgimento nei cicli dei nutrienti le rende componenti vitali per la stabilità di ogni ecosistema in cui sono presenti piante erbacee 1,2. Attraverso il loro micelio extra-radicolare, AM agisce come un'estensione fungina per le radici delle piante, specialmente nelle aree difficili da raggiungere3. L'attività principale è nelle radici delle piante ospiti, dove AM sviluppa grandi reti ife e specifiche strutture intracellulari chiamate arbuscoli. La mancanza di specificità dell'ospite consente al simbionte di colonizzare più specie contemporaneamente. Questa capacità fornisce all'AM il ruolo dell'allocazione delle risorse e della regolazione dei nutrienti nell'ecosistema; Il fungo fornisce anche supporto nella sopravvivenza delle piante e aiuta nelle prestazioni della pianta 4,5,6,7. La reazione delle specie AM alle radici ospiti è visibile nell'estensione e nella posizione del micelio intra-radicolare e nella presenza e nella forma degli arbuscoli sviluppati intracellulari. Gli arbuscoli intracellulari fungono da punto di interscambio tra i due simbionti e rappresentano aree caratterizzate da processi di trasferimento rapidi. Le strutture che l'AM produce sono specie-dipendenti e, oltre agli arbuscoli, nelle radici, sviluppano anche vescicole, spore e cellule ausiliarie.

Ci sono molte sfide nella valutazione dei simbionti AM nelle radici delle piante 8,9. Il primo è il loro costante sviluppo durante l'intero periodo vegetativo degli ospiti, che porta a molteplici cambiamenti nella struttura arbuscolare ifale. I diversi stadi di crescita arbuscolare, fino al loro collasso, sono chiaramente presenti nelle radici, ma le strutture senescenti AM sono talvolta digerite, il che le rende solo parzialmente visibili10. La seconda sfida è rappresentata dal metodo e dal protocollo di colorazione, dalla grande diversità dei sistemi radicali, dalla dimensione delle loro cellule e dalle differenze di spessore, che rendono difficile proporre un metodo unificato. L'ultima sfida è rappresentata dalla valutazione e dal punteggio della colonizzazione AM. Esistono numerosi metodi che valutano AM con diversi gradi di obiettività e la maggior parte di essi sono ancora limitati alle tecniche di microscopia. Quelli semplici si basano sulla presenza/assenza di strutture nella corteccia radicolare, mentre quelli più complessi si basano sul visual scoring e sull'uso di classi di colonizzazione, con l'integrazione della frequenza e dell'intensità del fenomeno di colonizzazione. Negli ultimi decenni sono stati prodotti molti dati sullo stato micorrizico di più specie, ma la maggior parte dei metodi sono limitati al valore osservato della colonizzazione senza indicare la posizione reale di ciascuna struttura nella corteccia radicale. Come risposta alla necessità di risultati più accurati sulla colonizzazione AM, è stato sviluppato un metodo basato sull'analisi microscopica dei pattern micorrizici (MycoPatt) nelle radici per assemblare, in forma digitale, le mappe micorriziche dettagliate11. Inoltre, il metodo consente il calcolo oggettivo dei parametri di colonizzazione e la determinazione della posizione effettiva di ciascuna struttura nella radice.

La posizione delle strutture fungine AM può essere importante per rispondere alle seguenti due domande. Il primo è legato all'analisi della colonizzazione in un momento specifico dal ciclo vegetativo di una pianta. In questo contesto, è molto utile osservare l'abbondanza arbuscolare / vescicolare, segnalare come si trovano nella radice e fornire un'immagine e parametri di colonizzazione molto chiari. Il secondo è legato al rilevamento della strategia fungina e al suo orientamento e persino alla previsione del suo sviluppo futuro. Un'applicazione del MycoPatt può essere per le piante analizzate quotidianamente, ogni 2-3 giorni, settimanalmente o durante varie fasi di crescita. In questo contesto, la posizione delle vescicole/arbuscole è importante per comprendere meglio il meccanismo biologico della colonizzazione AM. Questi parametri e osservazioni sono molto utili per integrare i parametri matematici.

Lo scopo di questo articolo è dimostrare la capacità del sistema MycoPatt di esplorare il potenziale e la strategia di colonizzazione dei funghi AM nativi nelle radici di Zea mays (mais) durante le diverse fasi di sviluppo e nelle radici di Festuca rubra (festuca rossa) in diverse condizioni di fecondazione a lungo termine. Per raggiungere l'obiettivo, sono stati analizzati due grandi database di due esperimenti. L'esperimento del mais fu stabilito a Cojocna (46°44′56" lat. N e 23°50′0" di lunghezza. E), nella Fattoria Didattica Sperimentale dell'Università di Scienze Agrarie e Medicina Veterinaria Cluj su un feoziom con un terreno a tessitura argillosa12. L'esperimento della festuca rossa fa parte di un più ampio sito sperimentale istituito nel 2001 a Ghețari, sui Monti Apuseni (46°49'064" lat. N e 22°81'418'' di lunghezza. E), su terreno preluvosol (terra rossa) tipo13,14. Il mais è stato raccolto in cinque diverse fenofasi di crescita12: B1 = 2-4 foglie (come punto di controllo per l'inizio della colonizzazione micorrizica); B2 = 6 foglie; B3 = 8-10 foglie; B4 = formazione di pannocchie; B5 = maturità fisiologica. A partire dalla fase di 2-4 foglie (A0), è stato applicato un trattamento organico, che ha portato a un fattore di due graduazioni (A1 = controllo e A2 = trattato). Le radici della festuca rossa sono state raccolte alla fioritura da un esperimento con cinque concimazioni a lungo termine13,14: V1 = controllo, non fecondato; V2 = 10 t·ha-1 letame; V3 = 10 t·ha-1 letame + N 50 kg·ha-1, P 2 O5 25 kg·ha-1, K2O 25 kg·ha-1; V4 = N 100 kg·ha-1, P 2 O5 50 kg·ha-1, K2O 50 kg·ha-1; V5 = 10 t·ha-1 letame + N 100 kg·ha-1, P 2 O5 50 kg·ha-1, K2O 50 kg·ha-1. Cinque piante sono state raccolte in ogni fase di sviluppo da ogni variante di fertilizzazione. Sono stati analizzati i protocolli di colorazione e le loro prestazioni in termini di tempo di elaborazione del campione e qualità della colorazione. La relazione tra lo sviluppo delle ife AM e la presenza delle sue strutture nelle radici è stata analizzata separatamente per ciascuna specie ed è proseguita con l'identificazione delle radici più permissive per la colonizzazione. I modelli di colonizzazione specifici di ciascun sistema di root sono stati analizzati in base alle mappe di colonizzazione e al valore dei parametri AM.

Il mais è una pianta annuale, che implica una crescita continua delle radici, e questa è stata la ragione principale per applicare il MycoPatt nelle fasi di crescita. La festuca rossa è una pianta perenne proveniente da una prateria trattata a lungo con diversi fertilizzanti. Le sue radici hanno uno sviluppo più breve di 1 anno e l'antesi è considerata come il punto di vegetazione quando la pianta cambia il suo metabolismo da vegetativo a generativo. Per catturare queste piante durante questi intensi periodi di attività, sono stati scelti i punti temporali sopra menzionati. Il campionamento durante il periodo vegetativo è difficile per questa specie se coltivata in praterie naturali.

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Protocollo

1. Selezione del materiale biologico, campionamento delle radici e conservazione

  1. Raccogliere l'intera radice delle piante con una pala (Figura 1A) separatamente per ciascuna variante e replicare. Rimuovere delicatamente, a mano, i grandi aggregati di terreno dalle radici. Lavare l'intero apparato radicale e misurarlo su una bilancia con celle di 1 cm x 1 cm (Figura 1B). Tagliare le radici separatamente per ogni pianta e metterle in un sacchetto di plastica.
  2. Raccogli tutte le radici pulite da ogni pianta in un sacchetto di plastica e raccogli tutti i campioni da una variante in un sacchetto più grande. Scrivi su ogni borsa il nome dello stage/variante e la data di campionamento. Conservare le radici in frigorifero o congelatore ad una temperatura compresa tra -4 °C e -20 °C fino alla lavorazione.

2. Elaborazione delle radici, pulizia e colorazione per microscopia

NOTA: Utilizzare guanti, una maschera e un cappuccio microbiologico / chimico per questa fase del protocollo.

  1. Assicurarsi che il processo di scongelamento delle radici avvenga lentamente a temperatura ambiente. Per tutte le fasi della lavorazione, utilizzare piccoli barattoli (30-50 ml) per ridurre la quantità di agenti necessari.
  2. Eseguire i seguenti quattro passaggi della procedura di pulizia lenta e colorazione15. Fai tutti i passaggi a temperatura ambiente. Questo metodo consente l'elaborazione di un gran numero di campioni contemporaneamente senza l'uso di un bagno d'acqua per l'ebollizione.
    1. Pulizia delle radici: metti tutte le radici di una pianta in un barattolo. Preparare una soluzione di NaOH al 10% con acqua di rubinetto e versarla in ogni barattolo fino a coprire completamente le radici. Agitare vigorosamente i barattoli per 1 minuto o 2 minuti per produrre una dispersione omogenea della soluzione di pulizia nelle radici. Ripetere questa procedura dopo 24 ore e lasciare le radici nella soluzione di compensazione per almeno 48 ore.
      NOTA: Le radici pulite hanno un aspetto giallo pallido (fino al bianco) e la consistenza è morbida (possono essere facilmente schiacciate premendo con una pinzetta).
    2. Risciacquo delle radici: passare il contenuto di un barattolo alla volta attraverso un setaccio. Riciclare la soluzione di compensazione. Risciacquare le radici più volte in acqua di rubinetto fino a completa rimozione della soluzione di pulizia.
      NOTA: se la soluzione di compensazione non viene completamente rimossa, influirà sulla qualità della procedura di colorazione.
    3. Colorazione delle radici: posizionare le radici sciacquate in un barattolo pulito. Preparare una soluzione di inchiostro-aceto al 5%:5% con acqua di rubinetto (5 ml di inchiostro blu + 5 ml di acido acetico al 9% + 90 ml di acqua di rubinetto). Versare la soluzione in ogni barattolo fino a coprire completamente le radici. Agitare vigorosamente i barattoli per 1 minuto o 2 minuti per produrre una dispersione omogenea della soluzione colorante nelle radici. Ripetere questa procedura dopo 24 ore e lasciare le radici in questa soluzione per 48 ore.
      NOTA: Le radici macchiate hanno un colore blu intenso.
    4. Decolorazione parziale della radice: sciacquare le radici macchiate in acqua di rubinetto per 1-2 minuti. Agitare vigorosamente i barattoli per rimuovere la soluzione macchiante in eccesso. Ripetere la procedura se la colorazione è troppo intensa e non consente una chiara valutazione microscopica.
      NOTA: Le radici colorate possono essere conservate in acqua di rubinetto fino a 1 settimana a temperatura ambiente senza alterare la qualità della colorazione (Figura 2). Per periodi più lunghi, le radici possono essere mantenute fino a 2-3 mesi in una soluzione commerciale di aceto di mele al 5% (acido acetico al 5%).

3. Elaborazione delle radici per microscopia

  1. Segmentazione delle radici: posizionare le radici colorate di ciascun campione su un tagliere in scala (Figura 3A). Tagliare le radici in segmenti di 1 cm (Figura 3B). Scegli 15 segmenti per ogni variante.
  2. Metodo di frantumazione delicato per la preparazione del segmento: stendere le radici su un vetrino. Utilizzare una busta di laminazione per coprire le radici e schiacciarle delicatamente partendo da un bordo (Figura 3C,D). Utilizzare uno strumento di plastica morbida, ad esempio una pinzetta, un manico di bisturi, una penna o una matita con una gomma, per visualizzare lentamente le radici sulla diapositiva. Rimuovere con cautela la busta di laminazione e coprire il campione con un vetrino di copertura (Figura 3E).
    NOTA: Le radici hanno una forma tubolare, quindi è necessario separarle in un piano bidimensionale. Questa azione presuppone la separazione delle radici sul punto centrale, portando alla visualizzazione delle due parti del diametro interno. L'uso di sacchetti di laminazione nella delicata procedura di frantumazione consente di visualizzare le radici, che hanno una forma cilindrica, in due pezzi - uno a sinistra e uno a destra - verso il loro punto centrale. In questo modo, l'intera radice viene analizzata in profondità e il grado di colonizzazione è il parametro che mostra la colonizzazione volumetrica (descritta nel lavoro originale su MycoPatt11). Fondamentalmente, tagliamo un cilindro a metà e, successivamente, lo ricostruiamo matematicamente.
  3. Aggiungere acqua a un angolo del vetrino con una pipetta e lasciare che l'acqua si diffonda lentamente sul vetrino (Figura 3F). Rimuovere l'acqua in eccesso con un tovagliolo di carta.

4. Analisi microscopica dei campioni di radice

  1. Utilizzare un microscopio dotato di una fotocamera a buona risoluzione.
  2. Analizza le diapositive partendo da un'estremità. Cattura ogni campo microscopico. Rinomina ogni immagine catturata con un codice che permetterà il vero post-assemblaggio delle parti radice. Per le radici spesse, utilizzare l'ingrandimento 10x o 40x e per le radici sottili, utilizzare l'ingrandimento 40x. Usa lo stesso obiettivo e lo stesso ingrandimento per l'intero set di radici di una specie.

5. Assemblaggio di immagini post-microscopia

  1. Utilizzare il software di presentazione per progettare un tavolo da disegno per l'assemblaggio di immagini. Imposta la larghezza 2-3 cm più larga della larghezza dell'immagine. Aggiungere tutte le immagini acquisite da un segmento nell'ordine di acquisizione e ricostruire l'intera lunghezza del segmento radice (Figura 4A).
    1. In breve, raccogli un totale di 15 immagini per ogni segmento di 1 cm e organizzale verticalmente, a partire da 1 a 15, nel software di presentazione per ricostruire il segmento.
  2. Allineare le immagini al centro. Usa l'allineamento verticale per assicurarti che ogni immagine segua quella precedente. Su tutte le immagini, posizionare una griglia di 10 celle x 150 celle per coprire l'intero segmento radice.
    1. Inoltre, su ogni singola immagine, posizionare una griglia 10 x 10 e, in ogni cella di questa griglia, inserire un numero da uno a sei se è visibile una struttura AM o lasciare vuota se non è presente alcuna struttura AM. In questo modo, l'accuratezza del processo è massima senza errori nella posizione delle strutture AM osservate.
  3. Aggiungere una tabella per una griglia di 10 celle di larghezza e 150 celle di lunghezza (15 quadrati di 10 celle x 10 celle). Modificare le dimensioni della larghezza della tabella in larghezza delle immagini. Modificare la lunghezza della tabella in modo che comprenda tutte le immagini (Figura 4B).

6. Punteggio della colonizzazione micorrizica

  1. Utilizzare il numero univoco per valutare ogni tipo di struttura come descritto nel metodo dei pattern micorrizici11: 1 per le ife; 2 per gli arbuscoli; 3 per vescicole; 4 per le spore; 5 per le celle ausiliarie; e 6 per i punti di ingresso (Figura 4C). Assegna un punteggio a ciascuna struttura micorrizica osservata da ciascuna cellula delle griglie applicate in precedenza (Figura 4D).

7. Analisi dei dati grezzi ed estrazione dei risultati

  1. Inserisci tutti i punteggi ottenuti nel foglio di calcolo MycoPatt11. Utilizzare la funzione copia/incolla per trasferire tutti i punteggi dalla presentazione nel primo foglio denominato rawdata (Figura 5).
  2. Analisi primaria dei risultati: utilizzare il terzo foglio denominato parametri nello strumento foglio di calcolo MycoPatt per visualizzare i risultati come percentuali (%) separatamente in tre forme (Figura 6A-C). Utilizzare le colonne da A a K per analizzare l'immagine orizzontale della colonizzazione; colonne da M a W per analizzare l'immagine verticale della colonizzazione; e le colonne da Y a AI per analizzare la colonizzazione trasversale (media) per ciascuno dei 15 quadrati 10 x 10 (linee 2-17) e la colonizzazione media finale (linee 19-20).
    NOTA: La colonizzazione media trasversale viene utilizzata per il calcolo dei parametri di colonizzazione reale, relativi all'analisi sia orizzontale che verticale. In questo modo, non è possibile commettere errori rispetto a se si utilizza solo l'analisi orizzontale o verticale (descritta in dettaglio nell'opera originale11). Inoltre, questo insieme di parametri viene calcolato per l'intera superficie del campo microscopico.
    1. Utilizzare le definizioni e le formule, specifiche per ogni parametro, per analizzare i risultati11. Utilizzare i seguenti parametri di colonizzazione: frequenza di colonizzazione (%), intensità di colonizzazione (%), arbuscoli (%) e vescicole (%), spore (%) e cellule ausiliarie (%), punti di ingresso (%), percentuale di aree non micorriziche (%), grado di colonizzazione globale (%) e il rapporto delle aree micorriziche/non micorriziche.
      NOTA: se arbuscoli, vescicole, spore, cellule ausiliarie e punti di ingresso mancano dai campioni analizzati, il foglio di calcolo MycoPatt li assegnerà come zero (0).
  3. Produzione ed estrazione di mappe micorriziche: Visualizza l'immagine ottenuta dalla conversione del codice delle strutture micorriziche in colori nel secondo foglio dei grafici denominati MycoPatt (Figura 7A). Esportare l'immagine risultante nel foglio grafico come immagine (Figura 7B). Utilizzare il codice colore nella legenda per l'analisi dei modelli micorrizici.
  4. Analisi della mappa micorrizica: identificare le strutture più importanti e il loro assemblaggio su mappe micorriziche. Descrivere il modello di colonizzazione micorrizica osservato nelle radici analizzate. Descrivere la strategia di colonizzazione micorrizica basata sullo sviluppo strutturale osservato nella radice, il modello di ramificazione e lo sviluppo di arbuscolo / vescicola.

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Risultati

L'uso corretto del metodo di schiacciamento delicato delle radici dopo le procedure di colorazione fornisce buoni dettagli delle strutture micorriziche, sia per Zea mays (Figura 8A-C) che per Festuca rubra (Figura 9A-E), un buon contrasto tra strutture micorriziche e cellule radicali e una conferma della stele dovuta al colore blu. Se le procedure di pulizia e colorazione non h...

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Discussione

Gli studi sulla colonizzazione micorrizica sono vitali per lo sviluppo di nuove strategie in campo agronomico. Il potenziale di più piante coltivate di formare un'associazione simbiotica con le micorrize arbuscolari le ha rese una componente importante dello sviluppo sostenibile dell'agroecosistema e del mantenimento della sua salute 16,17,18,19,20. Pertanto, ...

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Dichiarazioni

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questo articolo utilizza i dati risultanti da due studi di dottorato nell'area tematica "Corn Mycorrhizal Patterns Driven by Agronomic Inputs", condotto da Victoria Pop-Moldovan, e "Mycorrhizal Status and Development of Colonization in Mountain Grassland Dominant Species", condotto da Larisa Corcoz, sotto il coordinamento della Prof. Dr. Roxana Vidican.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Aceto di mele 5%FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L.O?ET DE MERE
Inchiostro BluPelikan4001https://www.pelikan.com/pulse/Pulsar/ro_RO.Store.displayStore.224848./cerneal%C4%83-4001-de-la-pelikan
Vetrini coprioggettiMenzel-GlaserD 263 Mhttps://si.vwr.com/store/product/20545757/cover-glasses-menzel-glaser
Pincipe, PMPVitalab9.171 411http://shop.llg.de/info881_Forceps_PMP_lang_UK.
HTM? UID=55005bf838d8000000000000000
& Amp; OFS=33
Barattolo di vetro 47 mLCarte indacoBORCAN 47 ML ESAGONALE
https://indigo.com.ro/borcan-47-ml-hexagonal Buste di laminazionePeachPP525-08Biglietto da visita (60x90mm) / https://supremoffice.ro/folie-laminare-60x90mm-125mic-carte-vizita-100-top-peach-pp525-08-510328
Microflow Classe II ABS CabinetBioquell UK LtdMicroflow Classe II ABS Cabinethttp://www.laboratoryanalysis.co.uk/graphics/products/034_11%20CLASS%202BSC%20(STD).pdf
Vetrini per microscopioDeltalabD100001https://distrimed.ro/lame-microscop-matuite-la-un-capat-26x76-mm-deltalab/?utm_source=Google%20Shopping&utm_campaign=
google%20shopping%20distrimed& utm_medium=cpc&
utm_term=1647& gclid=CjwKCAjwu
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Microsoft Office 365MicrosoftOffice 365Excel e Powerpoint; foglio di calcolo e presentazione
NaOHOltchim01-2119457892-27-0065http://www.sodacaustica.com.ro/pdf/fisa-tehnica-soda-caustica.pdf
Guanti in nitrileSemperGuard816780637https://www.sigmaaldrich.com/RO/en/product/aldrich/816780637?gclid=CjwKCAjwuYWSBhByEiwAKd
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Fotocamera OptikaOPTIKACP-8; Fotocamera P8 Pro, CMOS da 8,3 MP, microscopio USB 3.0https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/c-p-series/
OptikaOPTIKAB383pLhttps://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/b-380-series/
Maschera protettiva FFP3Hermes GiftHERMES000100EN 149-2001+A1:2009 / https://www.emag.ro/set-10-masti-de-protectie-respiratorie-hermes-gift-ffp3-5-straturi-albe-hermes000100/pd/DTZ8CXMBM/#specification-section
BisturiCutfix9409814https://shop.thgeyer-lab.com/erp/catalog/search/search.action;jsessionid=C258CA
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Aceto di vino bianco 9%FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L.O?ET DE VIN ALB
https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-mere https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-vin-alb

Riferimenti

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