Generazione di modelli per microscopia a trazione micropattern

Katie A. Bunde; Dimitrije Stamenović; Michael L. Smith

doi:10.3791/63628

Articolo metodologico

Generazione di modelli per microscopia a trazione micropattern

DOI:

10.3791/63628

⸱

17 febbraio 2022

Katie A. Bunde¹ , Dimitrije Stamenović¹ , Michael L. Smith¹

¹Department of Biomedical Engineering, Boston University

In questo articolo

Sommario

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Descriviamo i miglioramenti a un metodo standard per misurare le forze di trazione cellulare, basato sulla stampa di microcontatti con una singola fase di pattern sottrattiva di array di punti di proteine della matrice extracellulare su idrogel morbidi. Questo metodo consente una fabbricazione più semplice e coerente dei modelli a isola, essenziale per controllare la forma del cluster cellulare.

Abstract

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La microscopia a trazione micropattern consente il controllo della forma di singole cellule e cluster cellulari. Inoltre, la capacità di modellare la scala di lunghezza micrometrica consente l'uso di queste zone di contatto modellate per la misurazione delle forze di trazione, poiché ogni punto micropatternato consente la formazione di una singola adesione focale che quindi deforma l'idrogel morbido sottostante. Questo approccio è stato utilizzato per una vasta gamma di tipi di cellule, tra cui cellule endoteliali, cellule muscolari lisce, fibroblasti, piastrine e cellule epiteliali.

Questa recensione descrive l'evoluzione delle tecniche che consentono la stampa di proteine della matrice extracellulare su idrogel di poliacrilammide in una serie regolare di punti di dimensioni e spaziatura prespecificate. Poiché i modelli su scala micrometrica sono difficili da stampare direttamente su substrati morbidi, i modelli vengono prima generati su coperture di vetro rigido che vengono quindi utilizzate per trasferire il modello all'idrogel durante la gelificazione. Innanzitutto, viene descritto l'approccio originale di stampa a microcontatto per generare matrici di piccoli punti sul coperchio. Un secondo passaggio che rimuove la maggior parte del modello per lasciare isole di piccoli punti è necessario per controllare le forme di celle e cluster di celle su tali matrici di punti modellati.

Successivamente, viene descritta un'evoluzione di questo approccio che consente la generazione di isole di punti utilizzando un singolo passaggio di pattern sottrattivo. Questo approccio è notevolmente semplificato per l'utente, ma ha lo svantaggio di una durata ridotta per lo stampo principale necessario per realizzare i modelli. Infine, vengono descritti gli approcci computazionali che sono stati sviluppati per l'analisi delle immagini dei punti spostati e dei successivi campi di trazione generati dalle cellule e vengono fornite versioni aggiornate di questi pacchetti di analisi.

Introduzione

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La maggior parte dei fenotipi cellulari esercita forze di trazione sul loro ambiente. Queste forze di trazione sono generate dal citoscheletro contrattile di una cellula, che è una rete di actina e miosina, e altri biopolimeri filamentosi e proteine reticolanti 1,2,3,4. Le forze generate all'interno della cellula possono essere trasmesse all'ambiente extracellulare o alle cellule adiacenti, principalmente attraverso proteine transmembrana come integrine e caderine, rispettivamente ^5,6

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Protocollo

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1. Creazione di master in silicone

NOTA: la maggior parte del processo di progettazione, creazione e risoluzione dei problemi dei master in silicio per lo stampaggio ripetuto di timbri PDMS è stato trattato in precedenza²¹, quindi qui verranno descritte solo le differenze chiave in questo nuovo approccio.

Creare il design per la maschera fotografica utilizzando AutoCAD o software di progettazione simile. Rivestire un lato della fotomaschera, un sottile pezzo di vetro, con un sottile strato di cromo per controllare la diffusione della luce UV. Progettare la fotomaschera in modo che la luce U....

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Risultati

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Gli idrogel PAA con il modulo di Young di E = 3,6 kPa e il rapporto di Poisson di ν = 0,445 sono stati fatti per l'uso con questo metodo di micropatterning sottrattivo. Gli idrogel sono stati realizzati per avere uno spessore di ~ 100 μm, il che consente loro di essere ripresi con la configurazione di imaging utilizzata qui, impedendo allo stesso tempo alle cellule di rilevare il coverslip rigido sotto il gel, il che causerebbe problemi negli studi incentrati sul rilevamento della rigidità cellulare

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Discussione

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Un metodo migliorato per modellare indirettamente gli idrogel PAA è descritto in questo articolo. Questo approccio si basa su metodi che sono stati utilizzati in precedenza 20,35,36,37,38,39,40,41,42. Il cambiamento princi.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Ringraziamenti

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Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Paul Barbone del Dipartimento di Ingegneria Meccanica dell'Università di Boston per le discussioni utili e l'assistenza con l'analisi dei dati. Questo studio è stato supportato dalla sovvenzione NSF CMMI-1910401.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
(3-amminopropil)trimetossisilano	Sigma Aldrich	#281778
1,5 mL Provetta per microcentrifuga	Fisher Scientific	#05-408-129
15 mL provetta conica	Fisher Scientific	#05-539-12
4 x 4 in 0,060 Fotomaschera al quarzo LR Chrome Advance	Reproductions Corporation	N/A	Maschera personalizzata
Piastre	a 6 pozzettiFisher Scientific	#07-200-83
Acetone	Fisher Scientific	#A18P-4
Soluzione di acrilammide, 40%	Sigma Aldrich	#A4058
AlexaFluor 488	Thermo Fisher	#A20000
Amminoio Persolfato	Fisher Scientific	#BP179-25
Bisacrilammide	Fisher Scientific	#PR-V3141
Ethanol	Greenfield Global	#111000200C1GL
coprioggetti, 25 mm rotondi	Fisher Scientifc	#12-545-102
vetrini coprioggetti, 30 mm rotondi	Warner	#64-1499
Hamamatsu ORCA-R2 Camera	Hamamatsu	#C10600-10B
Human Plasma	Valley Biomedical	#HP1051P	Utilizzato per isolare fibronectina
acido cloridrico, 1.0 N	Millipore Sigma	#1.09057
ImageJ	Wayne Rasband	#1.53n
Set di piatti coprioggetti intercambiabili	Bioptechs	#190310-35
Kim Wipes	Fisher Scientific	#06-666-11C
Maschera Alinger	Karl Suss	#MA6
Matlab 2021	Mathworks	#R2021a
MetaMorph Basic	Molecular Devices	#v7.7.1.0
Estere N-idrossisuccinimide	Sigma Aldrich	#130672-5G
NucBlue Live Cell Stain	Thermo Fisher	#R37605
Microscopio invertito Olympus IX2-ZDC		Olympus
PD-10 GE	Healthcare	#52-1308-00
Photoresist Spinner Hood	Headway Research	#PWM32
Plasma Cleaner	Harrick	#PDC-001
Plasma Etcher	TePla	#M4L
Prior Lumen 200Pro Light Source	Prior Scientific	#L200
Wafer di silicio, 100 mm	University Wafer	809
SU-8 2005	Kayaku Advanced Materials Inc.
sviluppatore SU-8	Kayaku Advanced Materials Inc.
Sylgard 184 Elastomero siliconico	Essex Brownell	#DC-184-1.1
Tetrametiletilendiammina	Fisher Scientific	#BP150-20
Tricloro(1H,1H,2H,2H-perfluoroottil)silano	Sigma Aldrich	#448931
UAPON-40XW340 Obiettivo	Olimpo	#N2709300
Esposizione	alle inondazioni UVNewport	#69910
Vassoio portawafer, 110 x 11 mm	Ted Pella, Inc.	#19395-40

vetrini Colonne di desalinizzazione #IX81 ##NC9463827#NC9901158

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pelham, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (25), 13661-13665 (1997).
Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L.

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Ristampe e permessi

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Micropattern di proteine microstampa a contatto idrogel di poliacrilammide misurazione della forza di trazione stampi in PDMS patterning della matrice extracellulare forma dei cluster cellulari microscopia a fluorescenza adesione focale

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