Costruzione di microelettrodi potenziali di campo locale per registrazioni in vivo da più strutture cerebrali contemporaneamente

I potenziali di campo locale (LFP) sono i potenziali elettrici registrati dallo spazio extracellulare nel cervello. Sono generati da squilibri di concentrazione ionica al di fuori dei neuroni e rappresentano l'attività di una piccola popolazione localizzata di neuroni, consentendo di monitorare con precisione l'attività di una specifica regione del cervello rispetto alle registrazioni EEG su macroscala¹. Come stima, i microelettrodi LFP separati da 1 mm corrispondono a due popolazioni di neuroni completamente diverse. Mentre il segnale EEG viene filtrato dal tessuto cerebrale, dal liquido cerebrospinale, dal cranio, dai muscoli e dalla pelle, il segnale LFP è un marcatore affidabile dell'attività neuronale locale¹.

I ricercatori hanno spesso bisogno di registrare simultaneamente LFP da diverse strutture cerebrali, ma gli array di microelettrodi disponibili in commercio spesso non offrono tale flessibilità. Qui, il presente protocollo descrive microelettrodi completamente personalizzabili e facilmente costruibili per registrare simultaneamente LFP da qualsiasi regione del cervello desiderata a diverse profondità. Sebbene gli LFP siano stati ampiamente utilizzati per registrare l'attività neuronale di una specifica regione del cervello 2,3,4,5,6,7,8,9, l'attuale design facilmente personalizzabile consente di registrare LFP da qualsiasi regione cerebrale superficiale o profonda ^{multipla 11,12} . Il protocollo può anche essere modificato per costruire qualsiasi array di microelettrodi desiderato determinando le coordinate stereotassiche delle regioni del cervello e assemblando l'array di conseguenza. Questi microelettrodi con una frequenza di campionamento di 10 kHz e una resistenza di 60-70 kΩ (lunghezza 2 cm) ci consentono di registrare LFP con precisione al millisecondo. I dati possono quindi essere amplificati da un amplificatore a 16 canali, filtrati (passa basso 1 Hz, passaggio alto 5 kHz) e digitalizzati.

Il presente lavoro è approvato dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università della Virginia. Per gli esperimenti sono stati utilizzati topi C57Bl/6 di entrambi i sessi (7-12 settimane). Gli animali sono stati mantenuti su un ciclo di luce di 12 ore / 12 ore di buio e hanno avuto accesso ad libitum al cibo e all'acqua.

1. Costruzione di microelettrodi

1. Per costruire i microelettrodi, utilizzare filo di nichel-cromo rivestito di diamemetico da 50 μm (diametro) (vedi Tabella dei materiali). Nastro adesivo a un'estremità del filo sul retro della piattaforma e avvolgere il filo tre volte attorno alla manopola più vicina sulla piattaforma (Figura 1A, C).
   NOTA: qui è stata utilizzata una piattaforma acrilica con due manopole (2 x 5 pollici), ma è possibile utilizzare qualsiasi piattaforma.
   1. Allungare il filo attorno alla seconda manopola più lontana per creare due loop tra le manopole. Avvolgere il filo altre tre volte attorno alla prima manopola per fissare il filo in posizione e fissare nuovamente l'estremità sul retro della piattaforma.
      NOTA: dopo che i fili sono stati separati (passaggi 1.2-1.3.1), devono esserci due fili su ciascun lato (quattro fili in totale, Figura 1B).
2. Posizionare le barre di tensione sotto i fili con il nastro avvolto attorno a loro (lato appiccicoso verso l'alto) (Figura 1C).
   NOTA: per le barre di tensione sono stati utilizzati pezzi acrilici triangolari, con nastro avvolto attorno a loro (lato appiccicoso all'esterno per fissare i fili). Il lato appiccicoso del nastro al di fuori delle barre di tensione manterrà i fili in posizione per regolare la distanza tra loro. Le barre di tensione devono essere a ~ 2,5 cm di distanza dalle manopole e i fili non devono essere allentati.
3. Usando un microscopio e una pinza fine, fare uno spazio di 3 mm o 4,5 mm tra i fili (spazio di 3 mm tra i fili per creare microelettrodi corticali (Ctx) - nucleo talamico ventrolaterale (VL); spazio di 4,5 mm per creare microelettrodi striatali (Str) - nigrali (SNR)) (Figura 1B).
   1. Se l'ingrandimento viene utilizzato al microscopio, assicurarsi di calcolare e regolare la differenza di ingrandimento e la distanza effettiva tra i fili.
      NOTA: se i microelettrodi sono costruiti per strutture diverse da quelle utilizzate qui, la distanza tra i fili deve essere regolata sulla distanza stereotassica tra le strutture. La Figura 2B fornisce un esempio di come saranno organizzati i fili; di conseguenza, le coordinate stereotassiche per altre strutture devono essere regolate.
4. Tagliare quattro piccoli pezzi di plastica (spessore 0,5 mm) ~ 6 mm (larghezza) x 3 mm (altezza) (Figura 1C).
   NOTA: Qualsiasi pezzo di plastica può essere utilizzato purché abbia uno spessore di 0,5 mm; qui, sono stati utilizzati tubi quadrati in cui sono stati venduti i perni (Pins, vedi Tabella dei materiali). Se si utilizza uno spessore diverso, aggiungere più o meno pezzi di plastica per adattarsi alle coordinate stereotassiche richieste.
5. Applicare la colla (vedi Tabella dei materiali) sulla plastica e posizionarli sui fili (Figura 1C). Posizionare i pezzi di plastica a ~ 1,0 cm di distanza dal centro del filo, che è a 1,0 cm di distanza dalla barra di tensione. Rimuovere l'eccesso di supercolla con un batuffolo di cotone.
6. Dopo che la supercolla si è asciugata, tagliare i fili usando forbici fini, nell'ordine indicato nella Figura 1C.
7. Tagliare quattro tubi di vetro da 7 mm utilizzando un kit disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali) e inserire i fili degli elettrodi nei tubi di vetro come indicato nella Figura 2A.
   1. Inserire le coppie di elettrodi VL e SNR nei tubi di vetro.
      NOTA: solo i fili per le strutture profonde devono essere inseriti nei tubi di vetro per supportare l'impianto chirurgico. Assicurarsi di non inserire elettrodi corticali nel tubo di vetro.
8. Metti la colla alla base dei tubi di vetro per collegarli alla plastica. Attendere un po 'di tempo fino a quando la colla si asciuga.
9. Tagliare i tubi e i fili di vetro usando un bisturi come indicato nella Tabella 1; assicurarsi che le lunghezze dei microelettrodi siano corrette. Se i microelettrodi prendono di mira strutture diverse, regolare la distanza di taglio in base alle coordinate stereotassiche richieste.

Figura 1: Schema della costruzione del microelettrodo. (A) Installazione di fili sulla piattaforma con barre di tensione sotto i fili. (B) Lo spazio tra i fili. (C) Quattro pezzi di plastica sono incollati ai fili. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Coordinate e dimensioni dell'impianto stereotassico dei microelettrodi.

2. Assemblaggio di array di microelettrodi

1. Utilizzare la colla per attaccare le materie plastiche nell'ordine desiderato delle regioni target. Un esempio di elettrodi corticali, talamici, striatali e nigrali è mostrato nella Figura 2B,C.
   1. Posizionare la coppia di elettrodi Ctx-VL a faccia in giù (il lato con i fili dell'elettrodo deve essere rivolto verso il basso) e collegare due pezzi di plastica vuoti da 6 mm x 3 mm sulla parte superiore con colla.
   2. Sopra i tre pezzi di plastica, posizionare la seconda coppia di elettrodi Ctx-VL con gli elettrodi rivolti verso l'alto (utilizzare un microscopio e assicurarsi che gli elettrodi VL siano allineati).
      NOTA: L'allineamento degli elettrodi bilaterali (qui, l'allineamento degli elettrodi VL sinistro e destro) è essenziale per indirizzare le strutture bilaterali desiderate in modo appropriato.
   3. Utilizzare la colla per fissare gli elettrodi SNR sulla parte superiore con gli elettrodi SNR a 2,0 mm di distanza dagli elettrodi VL e ~ 5,0 mm di distanza dagli elettrodi corticali (i fili degli elettrodi SNR devono essere rivolti verso l'alto).
   4. Ripetere il passaggio 2.1.3. per l'altro lato (i fili dell'elettrodo SNR devono essere rivolti verso l'esterno dell'array di microelettrodi).
2. Applicare resina epossidica intorno alla plastica per legare insieme gli elettrodi. Evitare di mettere resina epossidica sugli elettrodi.
3. Prendi un filo spesso e fai un anello su un'estremità. Immergere il cappio nella soluzione epossidica e posizionarlo sulla plastica, assicurandosi che il filo spesso sia piatto (Figura 2D) in modo che per i passaggi successivi, questo filo possa essere utilizzato come maniglia. Attendere che gli elettrodi siano completamente asciutti.
4. Tagliare i fili a 2 cm, come mostrato nella Figura 2E.

Figura 2: Costruzione e dimensioni del microelettrodo. (A) Quattro coppie di elettrodi si sono formate dopo che i fili sono stati tagliati con le forbici, come indicato nella Figura 1C (2 coppie di elettrodi Ctx-VL e 2 coppie di elettrodi Str-SNR). Inserire elettrodi a struttura profonda (VL e SNR) nei tubi di vetro e incollare le loro basi alla plastica (punti rossi). (B) Vista dall'alto: le coppie di elettrodi di (A) sono incollate in una pila per creare il nucleo del microelettrodo. Le linee rosse indicano le linee di colla. (C) Vista frontale laterale di (B). (D) Il filo spesso era attaccato ai microelettrodi. (E) I fili sono raggruppati come indicato e le estremità isolate vengono raschiate e tagliate in 2 cm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Connessione microelettrodo all'auricolare

1. Raggruppare i fili come indicato nella Figura 2E e raschiare via 1 mm delle estremità isolate con un bisturi.
2. Piegare gli elettrodi corticali come mostrato nella Figura 3A. Separare i fili come mostrato nella Figura 3B. Usando una pinza fine, fai un anello all'estremità di ciascun filo (Figura 3B).
3. Tenere in mano un auricolare a 10 pin con un emostato (vedere Tabella dei materiali) e utilizzare l'estremità in legno di un batuffolo di cotone per applicare quantità minime di flusso sui perni (Figura 3C). Assicurarsi di non mettere il flusso all'esterno dei pin per evitare cortocircuiti tra i pin.
4. Usando l'estremità di legno di un batuffolo di cotone, applicare il flusso agli anelli del filo.
5. Saldare i passanti del filo all'auricolare a 10 pin come mostrato nella Figura 3C. Dopo la saldatura, asciugare l'auricolare per evitare cortocircuiti tra i pin.
6. Prendi un filo sottile (0,005-0,008 pollici) per i fili di riferimento e di terra e rimuovi la plastica da un'estremità. Fai un anello sull'altra estremità del filo.
7. Saldare il lato spogliato dei fili di riferimento e di terra ai rispettivi pin (Figura 3A,C).
8. Tenendo premuto il filo spesso (Figura 2D), applicare il cemento cranioplastico attorno ai microelettrodi, specialmente dove i fili si collegano ai perni. Evitare di toccare le estremità dell'elettrodo effettivo con il cemento.
9. Dopo che il cemento si asciuga, metti la resina epossidica alla base dei tubi di vetro, dei fili del microelettrodo striatale e dell'intero elettrodo. Evitare di toccare le estremità dell'elettrodo effettivo con resina epossidica. Attendere che gli elettrodi siano completamente asciutti.
10. Gli elettrodi sono pronti. Praticare fori nel cranio del mouse (secondo le coordinate stereotassiche richieste) utilizzando un trapano dentale e impiantare l'auricolare come mostrato nella Figura 3D abbassando l'auricolare con microelettrodi rivolti verso il cranio e i fori appropriati. L'auricolare può essere collegato al braccio stereotassico per il supporto durante l'impianto.

Figura 3: Impianto di microelettrodi. (A) Gli elettrodi corticali sono piegati come indicato. (B) I fili sono separati per creare anelli alle estremità. (C) Il flusso (ai punti rossi) e i fili ad anello sono saldati all'auricolare a 10 pin, assicurando che ogni filo vada al pin appropriato. (D) L'auricolare viene impiantato per registrare gli LFP. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Marcatura della posizione dell'elettrodo dopo le registrazioni

1. Al termine delle registrazioni LFP, confermare la corretta posizione degli elettrodi nella regione target applicando una corrente sulle punte degli elettrodi per effettuare una lesione e attendendo 30 minuti prima di perfondere il mouse.
   NOTA: impostazioni della lesione per confermare la posizione delle punte dell'elettrodo: singolo scoppio, 40 μA, impulso monofasico a onda quadra da 0,75 ms, 50 Hz, 30 s.
2. Anestetizzare i topi con isoflurano (fino a quando il topo non si è addormentato) e perfondere¹⁰ transcardialmente con il 4% di paraformaldeide (PFA) in tampone fosfato di sodio 0,1 M. Sezionare il cervello (40 μm di spessore) su un criostato (vedi Tabella dei materiali) e colorare con DAPI (0,02% in PBS). Confermare la posizione corretta degli elettrodi dalla presenza delle lesioni della punta dell'elettrodo come mostrato nella Figura 4B,C.
   NOTA: La percentuale di isoflurano deve essere applicata seguendo le linee guida del singolo istituto.

5. Misurazione della resistenza dell'elettrodo

1. Misurare la resistenza degli elettrodi e controllare il cortocircuito tra gli elettrodi utilizzando un ohmmetro multi-range (vedi Tabella dei materiali). Impostare la scala di resistenza su R x 10.000, indicando che una deflessione unitaria nel puntatore corrisponde alla resistenza di 1 kΩ. Gli elettrodi lunghi 2 cm devono avere una resistenza di 60-70 kΩ.
2. Personalizza l'auricolare prendendo dieci pin singoli (vedi Tabella dei materiali). Saldare ogni perno con un sottile filo di rame a più fili in un cavo.
   1. Premere i perni saldati con le code dei cavi corrispondenti nella presa di accoppiamento a doppia fila a 10 pin (prese corrispondenti). Premere i perni aperti della presa di accoppiamento nell'auricolare LFP. In questo modo, ogni elettrodo LFP ha un filo di cavo designato nell'assieme.
3. Immergere la punta di ciascun elettrodo LFP (la cui resistenza deve essere misurata) in soluzione salina naCl allo 0,9% (concentrazione di NaCl nel sangue). Collegare l'estremità del filo del cavo che corrisponde all'elettrodo LFP al terminale positivo dell'ohmmetro.
   1. Utilizzare un filo a bassa resistenza (̴100 Ω) con un lato nell'acqua salina e l'altro lato come estremità aperta. Collegare l'estremità aperta del filo a bassa resistenza alla terra del puntatore dell'ohmmetro.
      NOTA: questa disposizione completa il circuito e richiede una deflessione del puntatore dell'ohmmetro.
4. Assicurarsi che non vi sia alcun collegamento elettrico tra due elettrodi sull'auricolare. Controllare l'isolamento elettrico degli elettrodi LFP a coppie (messa a terra: un cavo corrisponde a un elettrodo; positivo: un altro cavo corrisponde a un altro elettrodo). Scartare gli elettrodi se in questo caso si osserva una deflessione.

In questo lavoro, i microelettrodi LFP sono stati utilizzati per mappare la diffusione del sequestro attraverso i gangli della base11. Le registrazioni LFP simultanee sono state eseguite dalla corteccia premotoria destra (dove si trovava il focus delle convulsioni) e dal VL, striato e SNR sinistro (Figura 4). L'inizio del sequestro è stato identificato come deflessione della traccia di tensione almeno il doppio della linea di base (Figura 4A, freccia rossa). Il grafico dello spettro di potenza11 mostra le distribuzioni di frequenza per gli LFP registrati (Figura 4A). Le latenze di insorgenza delle crisi (barre rosse) potrebbero essere confrontate tra ciascuna struttura con precisione al millisecondo (Figura 4A). Un impulso di corrente è stato applicato alla fine delle registrazioni per marcare e confermare la posizione delle punte dell'elettrodo, formando una lesione (Figura 4B, C).

Figura 4: Registrazioni LFP rappresentative. (A) Un attacco è stato registrato dalla corteccia premotoria destra e dal VL, striato e SNR sinistro utilizzando microelettrodi LFP con gli spettri di potenza corrispondenti. La freccia rossa indica l'insorgenza delle convulsioni. Le barre orizzontali rosse indicano il ritardo di insorgenza del sequestro in ogni struttura. Lo schema cerebrale mostra la posizione dei microelettrodi (punti rossi). (B,C) Le strutture sono state lesionate dopo le registrazioni per segnare la posizione delle punte del microelettrodo nel VL e nell'SNR. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.