L'infezione di Caenorhabditis elegans da parte del parassita microsporidiano Nematocida parisii consente ai vermi di produrre prole altamente resistente allo stesso agente patogeno. Questo è un esempio di immunità ereditaria, un fenomeno epigenetico poco compreso. Il presente protocollo descrive lo studio dell'immunità ereditaria in un modello di verme geneticamente trattabile.
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Articolo metodologico
Studio dell'immunità ereditaria in un modello di infezione da microsporidi di Caenorhabditis elegans
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'immunità ereditaria descrive come alcuni animali possono trasmettere la "memoria" di una precedente infezione alla loro prole. Questo può aumentare la resistenza agli agenti patogeni nella loro progenie e promuovere la sopravvivenza. Mentre l'immunità ereditaria è stata riportata in molti invertebrati, i meccanismi alla base di questo fenomeno epigenetico sono in gran parte sconosciuti. L'infezione di Caenorhabditis elegans da parte del patogeno microsporidico naturale Nematocida parisii provoca la produzione di vermi che sono robustamente resistenti ai microsporidi. Il presente protocollo descrive lo studio dell'immunità intergenerazionale nel modello di infezione da N. parisii -C. elegans semplice e geneticamente trattabile. L'articolo attuale descrive i metodi per infettare C. elegans e generare prole immuno-innescata. Vengono inoltre forniti metodi per valutare la resistenza all'infezione da microsporidi mediante colorazione per microsporidi e visualizzazione dell'infezione al microscopio. In particolare, l'immunità ereditaria previene l'invasione delle cellule ospiti da parte dei microsporidi e l'ibridazione fluorescente in situ (FISH) può essere utilizzata per quantificare gli eventi di invasione. La quantità relativa di spore di microsporidi prodotte nella prole immuno-innescata può essere quantificata colorando le spore con un colorante che lega la chitina. Ad oggi, questi metodi hanno fatto luce sulla cinetica e sulla specificità patogena dell'immunità ereditaria, nonché sui meccanismi molecolari alla base. Queste tecniche, insieme agli ampi strumenti disponibili per la ricerca su C. elegans , consentiranno importanti scoperte nel campo dell'immunità ereditaria.
Introduzione
L'immunità ereditaria è un fenomeno epigenetico in cui l'esposizione dei genitori agli agenti patogeni può consentire la produzione di prole resistente alle infezioni. Questo tipo di memoria immunitaria è stato dimostrato in molti invertebrati che mancano di sistema immunitario adattativo e possono proteggere dalle malattie virali, batteriche e fungine1. Mentre l'immunità ereditaria ha importanti implicazioni per la comprensione sia della salute che dell'evoluzione, i meccanismi molecolari alla base di questa protezione sono in gran parte sconosciuti. Ciò è in parte dovuto al fatto che molti degli animali in cui è stata descritta l'immunità ere....
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Protocollo
Il presente studio utilizza il ceppo N2 wild-type C. elegans Bristol coltivato a 21 °C.
1. Preparazione dei media
- Preparare i media M9 come da rapporto precedente21,22.
- Preparare il mezzo di crescita dei nematodi (NGM) come da precedente rapporto21,22. Versare 12 ml di NGM per piastra da 6 cm o 30 ml per piastra da 10 cm.
- Preparare il ceppo di Escherichia coli OP50-1 come da un precedente rapporto23.
- Preparare le piastre NGM co....
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Risultati
Nel presente studio, le popolazioni parentali di C. elegans (P0) sono state infettate allo stadio L1 con una bassa dose di spore di N. parisii . Queste condizioni di infezione sono tipicamente utilizzate per ottenere un numero elevato di progenie F1 resistente ai microsporidi attraverso lo sbiancamento dei genitori. Le popolazioni parentali infette e i controlli non infetti sono stati fissati a 72 hpi e colorati con DY96 per visualizzare gli embrioni di vermi e le spore di microsporidi (
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Discussione
Il presente protocollo descrive lo studio dei microsporidi e dell'immunità ereditaria in un modello di infezione da N. parisii -C. elegans semplice e geneticamente trattabile.
La preparazione delle spore è un protocollo intensivo che in genere produce abbastanza spore per 6 mesi di esperimenti, a seconda della produttività24. È importante sottolineare che l'infettività deve essere determinata per ogni nuovo "lotto" di spore prima di utilizzarlo per gli.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Siamo grati a Winnie Zhao e Yin Chen Wan per aver fornito utili commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (Grant #522691522691).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Perle di zirconia da 2,0 mm Biospec | Products Inc. | 11079124ZX | |
| Siringa da 10 ml | Fisher Scientific | 1482613 | |
| 5 μ | Millipore Sigma | SLSV025LS | |
| Axio Imager 2 | Microscopio fluorescente Zeiss per l'imaging di vermi colorati con DY96 e FISH su vetrini da microscopio | ||
| Axio Zoom V.16 Microscopio stereo zoom a fluorescenza | Zeiss-Per | l'imaging dal vivo di animali transgenici fluorescenti per visualizzare l'IPR | |
| Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean Bench Baker | - | ||
| Disgregatore di perline, disgregatore analogico Genie SI-D238 Disgregatore cellulare Genie, | T9FB893150 | globale | |
| , citometri monouso per conta spermatica Millennium Sciences | Fisher Scientific | DRM600 | |
| Direct Yellow 96 | Sigma-Aldrich | S472409-1G | |
| EverBrite con DAPI | Biotium | 23001 | |
| Mezzo di montaggio EverBrite senza DAPI | Biotium | 23002 | |
| Software Fiji/ImageJ ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | ||
| Rotore meccanico | Thermo Sceintific | 415110 / 1834090806873 | Utilizzato per filare tubi di embrioni sbiancati per la schiusa notturna |
| Sonda MicroB FISH | Biosearch Technologies Inc. | - | Sintetizzato con una modifica Quasar 570 (Cy3) 5' e purificato HPLC, CTCTCGGCACTCCTTCCTG |
| N2 | Wild-type, ceppo Bristol | Ceppo predefinito | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
| Dodecil solfato di sodio (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771-100G | |
| Soluzione di idrossido di sodio (5 N) | Fisher Chemical | FLSS256500 | |
| Soluzione di ipoclorito di sodio (6% ) | Fisher Chemical | SS290-1 | |
| Stemi 508 Stereomicroscopio | Zeiss-Per | la manutenzione quotidiana dei vermi e il conteggio dei vermi L1 per le impostazioni dei saggi | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379-100ML | |
| Vectashield + A16 | Biolynx | VECTH1500 |
Riferimenti
- Tetreau, G., Dhinaut, J., Gourbal, B., Moret, Y. Trans-generational immune priming in invertebrates: current knowledge and future prospects. Frontiers in Immunology. 10, 1938(2019).
- Au, V., et al.
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Ristampe e permessi
